1、细胞工程学实验内容 实验一 植物细胞培养基的种类及配制 实验二 植物愈伤组织的诱导 实验三 植物愈伤组织细胞的培养实验一 植物 细胞培养基的 种类及配制一、实验目的1、了解 植物 细胞培养 基的种类及营养要求。2、掌握 MS培养基的配制 方法。二、实验材料1、实验设备： 高压灭菌锅、电子分析天平、 pH计 、超净工作台 。2、实验器材： 电磁炉 、烧杯、量筒、搅拌棒、 吸量管、移样枪 。三、 植物细胞培养基的种类在 100多年的植物组织、器官和细胞离体培养研究中，研制开发了数十种适宜不同植物、不同组织、不同细胞生长发育的培养基配方，但多数培养基是在几种普遍应用的培养基上演变而来的，其中应用最为
2、广泛的仍为 MS培养基。植物组织培养基早期的建立，如 White 提出的根培养基和 Gautheret提出的愈伤组织培养基，都是由先前的用于整体植物栽培的营养液发展而来的。以后所有的各种培养基又都是在 White 培养基和Gautheret培养基的基础上形成的。各种培养基在无机营养组成上的差异主要是盐和离子数量上的不同。常用培养基中根据无机盐的含量可以分为 4类，分述于下：1、高无机盐含量培养基： 高无机盐含量培养基中，钾盐、铵盐及硝酸盐含量较高，微量元素种类齐全，养分数量及比例较合适，广泛用于植物的器官、花药、细胞及原生质体的培养。主要有 MS培养基和 ER培养基。2、较高硝酸钾含量培养基：
3、 较高硝酸钾含量培养基适合于木本植物、十字花科植物和单子叶植物的组织和花药培养。主要有 B5培养基和 N6培养基。3、中等无机盐含量培养基： 中等无机盐含量培养基中，大量元素约为 MS培养基的一半，微量元素种类减少，但含量较 MS的高，适合于花药培养。主要有 Nitsch培养基和 NT培养基。4、低无机盐含量培养基： 低 无机盐量培养基中，大量元素含量大幅降低而且种类减少，多数用于生根培养基。主要有White 培养基和 Heller培养基。各种植物培养基的营养组成及配方如下表：培养基成分 培养基（ mg/L）MS（ 1962） ER（ 1965）B5（ 1968）N6（ 1975）Nitsch
4、1963NT（ 1971）White （ 1963）Heller（ 1953）NH4NO3KNO3CaCl22H2OCaCl2MgSO47H2O1 6501 9004403701 2001 9004403702 527.501502502 8301661857209501661858259502201 2338075075250KH2PO4（ NH4） 2SO4Ca（ NO3） 24H2ONaNO3Na2SO4170 340 134 40046368 680 300200600NaH2PO4H2OKClKIH3BO3MnSO44H2O0.836.2022.300.632.231500.753.
5、000.801.604.4010.0025.000.836.2022.3019.0065.000.751.505.001257500.011.000.10MnSO4H2OZnSO47H2OZnSO44H2OZnNa2EDTANa2MoO42H2O8.600.2515.000.02510.002.000.253.80 10.000.258.600.253.00 1.00MoO3CuSO45H2OCoCl26H2OCoSO47H2OAlCl30.0250.0250.00250.00250.0250.0250.025 0.0250.030.0010 .010.030.03NiCl26H2OFeCl3
6、6H2OFe2（ SO4） 3FeSO47H2ONa2EDTA2H2O27.8037.3027.8037.3027.8037.3027.8037.3027.8037.3027.8037.302.50 0.031.00肌醇烟酸盐 酸吡哆醇盐 酸硫胺素甘氨酸1000.500.500.102.000.500.500.502.001001.001.0010.000.500.501.002.001005.000.500.502.001001.000.050.010.013.00叶酸生物素蔗糖D-甘露醇30 000 40 000 20 000 50 000 0.500.0520 00010 000127
7、00020 000四、 MS培养 基 的配制植物细胞培养基种类很多，如 MS、 ER、 B5、 N6、 NT和White 等。本实验以 MS完全培养基为例，介绍植物细胞培养基的配制方法。（一） MS培养基母液的配制母液的配制是按药品的种类和性质分别配制，单独保存或几种混合保存。配制好的母液种类一般有大量元素、微量元素、钙盐、铁盐、有机营养和单独保存的各种生长调节类物质。大量元素一般配制成 10倍浓度的母液，微量元素和有机物常配制成 100倍浓度的母液。见下表。母 液 成 分 规 定量（mg/L）扩 大倍数称取量（ mg）母液体 积 （mL）配 1L培养基吸取量（ mL）编 号 种 类1 大量元
8、素KNO3 1 9001019 0001000 100NH4NO3 1 650 16 500MgSO47H2O 370 3 700KH2PO4 170 1 7002 钙盐 CaCl22H2O 440 10 4 400 1000 1003 微量元素MnSO44H2O 22.31002 2301000 10ZnSO47H2O 8.60 860H3BO3 6.20 620KI 0.83 83Na2Mo42H2O 0.25 25CuSO45H2O 0.025 2.5CoCl26H2O 0.025 2.54 铁盐Na2EDTA 37.30 100 3 730 1000 10FeSO44H2O 27.80
9、 2 7805 有机物质甘氨酸 2.0050100500 10盐 酸硫胺素 0.10 5盐 酸吡哆醇 0.50 25烟酸 0.50 25肌醇 100 5 000上 表提供了 MS培养基母液的配方。将各种化合物按指定扩大倍数准确称量、分别溶解后，按先后次序加入蒸馏水中，最后用蒸馏水定容。注意：在混合定容时，一定要掌握药剂的先后次序或稀释度，以免发生沉淀。钙盐和铁盐由于与其它母液混合容易发生沉淀反应，因此需单独配制。铁盐为螯合状态时，有利于植物在适宜的 pH下吸收和利用，因此需与螯合剂 Na2EDTA混合配制。生长调节类物质一般分别配制成 0.21.0mg/L的母液，用时按量吸取。某些生长调节剂不
10、溶于水，需用不同溶剂进行溶解，如 NAA、 2,4-D、 IAA、IBA、 GA3是醇溶性的，配制时先用少量 95% 酒精溶解，然后再用蒸馏水定溶； KT、 6-BA、 2ip、 ZT先溶于少量 1mol/L盐酸中，然后再用蒸馏水定容；叶酸先用少量稀氨水溶解后再定容。配制好的各种母液倒入棕色瓶中，贴好标签，保存于 4 冰箱中备用。注意：母液保存于冰箱中的时间不宜过长，一般为 12个月，当母液出现沉淀或霉菌团时，则不能再使用。（二） MS完全培养基的配制以配制 1 000mL MS完全培养基为例，配制全过程如下： 1、在洁净的不锈钢（或搪瓷）容器中加入 1/2终体积（ 500mL）的蒸馏水；2、按上表内容规定的量，精确吸取各种母液，依次加入到盛有 1/2终体积蒸馏水的不锈钢（或搪瓷）容器中，记录此时的总体积。注意：母液不能混合后加入，也不能同时加入，必须依次缓慢加入，且要一边加入一边搅拌，以免造成电解质局部浓度过高而发生沉淀反应；3、根据培养目的及要求，加入所需量的各种生长调节物质，记录此时的总体积（如用于长春花叶愈伤组织的诱导：加入 2,4-D 1.0mg/L、 6-BA 0.5mg/L、 NAA 1.0mg/L、KT 0.2mg/L）；
