1、分子生物学实验教学大纲一、课程基本信息课程编码：091118B课程名称：分子生物学实验英文名称：experiment of molecular biology课程类别：专业必修课总 学 时：24 总 学 分：1适用专业：生物科学二、实验课程的性质、目标与任务1. 分子生物学已成为生命科学的基础学科之一，其基本理论和实验技术已渗透到生物学的各个领域并促进了一批新学科的兴起和发展。目前，以分子生物学为基础的基因克隆重组技术已成为现代生物技术的核心。因此，在掌握基本分子生物学理论的基础上，为培养学生在分子生物学技术方面的实际动手能力，开设本实验课程。2. 目标：通过实验原理的讲解和实验操作，使学生初
2、步了解和熟悉现代分子生物学实验的基本原理、操作技能和实际应用，提高学生的创新思维和独立分析问题、解决问题的能力。3. 通过本课程的实验教学和实验操作，要求学生熟练掌握下列分子生物学实验技术：大肠杆菌感受态细胞的制备和转化，质粒 DNA 的分离及纯化，琼脂糖凝胶电泳，PCR 扩增，DNA 重组、转化与检测实验等。三、实验课程教学基本要求（1）注重分子生物学基础实验技能的掌握与提高，提升学生的动手操作能力；（2）实验课前要预习，明确每次实验的目的、原理与基本步骤；（3）实验过程中要具有严谨科学的态度，尊重事实与实验结果，要善于发现问题、分析问题、解决问题；（4）树立学生之间的交流与合作意识。四、实
3、验教学内容及要求实验一 大肠杆菌感受态细胞的制备【实验类型】基础性实验【目的与要求】掌握大肠杆菌感受态细胞的制备技术。注意严格无菌操作，在冰上进行。正确选取对数生长期的大肠杆菌细胞。【内容提要】感受态是细菌处在容易吸收外源 DNA 的状态。选用经过基因改造的生物工程菌株大肠杆菌 DH5a 菌株为材料，在 0、CaCl 2 低渗溶液处理，细胞壁破坏，细胞成为球型原生质体。因而具备了吸收外源 DNA 的能力。实验操作步骤：1. 挑取单菌落，接种培养过夜2. 转接培养3. 将菌液置冰浴处理4. 收集菌体5. CaCl2 处理，-70 保存。【所需主要仪器设备】1.超净工作台 2.低温离心机 3.恒温
4、摇床 4.紫外分光光度仪实验二 质粒 DNA的转化【实验类型】基础性实验【目的与要求】掌握质粒 DNA 的转化技术。注意严格无菌操作，在冰上进行。准确控制转化热激的温度和时间。【内容提要】DNA 能够黏附于感受态细胞的表面，经过 42短时间的热激处理可以促进 DNA 的吸收。转化菌在非选择培养基中保温一段时间后，质粒 DNA 所携带的抗性基因（Amp r）得到表达，然后再在选择培养基上培养，使转化的菌株得以正常生长。实验操作步骤：1. 取新鲜制备的感受态细胞，加入质粒；同时做一对照试验2. 42水浴热激3.冰浴4.复苏5.涂平板6.菌落培养【所需主要仪器设备】1.超净工作台 2.恒温水浴 3.
5、恒温摇床实验三 质粒 DNA的提取【实验类型】基础性实验【目的与要求】碱裂解法提取质粒的技术和方法。注意加入三种溶液的先后顺序，在提取过程中，动作要轻柔。【内容提要】碱裂解法提取质粒利用的是环状质粒 DNA 与线状的染色体 DNA 片段在拓扑学上的差异来分离它们。在 pH 值介于 12.0-12.5 这个狭窄的范围内，线状的 DNA 双螺旋结构解开变性，在这样的条件下，共价闭环质粒 DNA 的氢键虽然断裂，但两条互补链彼此依然相互盘绕而紧密地结合在一起。当加入 pH4.8 的醋酸钾高盐缓冲液使 pH 降低至中性后，共价闭合环状的质粒 DNA 的两条互补链迅速而准确地复性，而线状的染色体 DNA
6、 的两条互补链彼此已完全分开，不能迅速而准确地复性，它们缠绕形成网状结构。通过离心，染色体 DNA 与不稳定的大分子 RNA、蛋白质-SDS 复合物等一起沉淀下来，而质粒 DNA 却留在上清液中。实验操作步骤：1. 收集菌体2. 加入三种溶液3. 离心4. 质粒的纯化5. 质粒的保存【所需主要仪器设备】1恒温培养箱 2恒温摇床 3小型高速离心机 4漩涡混合器实验四 琼脂糖凝胶电泳检测 DNA【实验类型】基础性实验【目的与要求】掌握琼脂糖凝胶电泳检测 DNA 的技术与方法。注意观察 DNA 的分子量大小，估计DNA 的含量，推测出样品 DNA 的浓度，观察质粒的 3 种构型，分析质粒 DNA 的
7、质量，判断可否作为下一步基因重组的材料？【内容提要】DNA 分子在琼脂糖凝胶中泳动时有电荷效应和分子筛效应。DNA 分子在高于等电点的 pH 溶液中带负电荷，在电场中向正极移动。由于糖 -磷酸骨架在结构上的重复性质，相同数量的双链 DNA 几乎具有等量净电荷，因此它们能以同样的速度向正极方向移动。在一定的电场强度下，DNA 分子的迁移速度取决于分子筛效应，即 DNA 分子本身的大小和构型。具有不同的相对分子质量的 DNA 片段的泳动速度不一样，可进行分离。 DNA 分子的迁移速度与相对分子质量的对数值成反比关系。凝胶电泳也可以分离相对分子质量相同，但构型不同的 DNA 分子（以质粒为例，一般情
8、况下迁移速率超螺旋环状 线状 DNA单链开环） 。实验操作步骤：1. 制备琼脂糖凝胶板2. 加样电泳3. 拍照【所需主要仪器设备】1.琼脂糖凝胶电泳系统 2. 凝胶成像系统实验五 PCR 基因扩增【实验类型】基础性实验【目的与要求】掌握 PCR 反应的基本原理和实验技术。注意确定好退火温度和延伸时间。【内容提要】PCR 即聚合酶链式反应，是指在 DNA 聚合酶催化下，以母链 DNA 为模板，以特定引物为延伸起点，通过变性、退火、延伸等步骤，体外复制出与母链模板互补的子链 DNA的过程。是一项 DNA 体外合成放大技术，能快速特异地在体外扩增任何目的 DNA。可用于基因分离克隆，序列分析，基因表
9、达调控等许多方面。实验基本操作步骤：1. 变性2. 退火3. 延伸【所需主要仪器设备】PCR 仪；凝胶电泳及凝胶成像系统； Taq 酶及其 Buffer；PCR 管实验六 DNA 重组【实验类型】基础性实验【目的与要求】掌握 DNA 重组的实验技术。注意外源 DNA 分子与载体分子的比例。【内容提要】DNA 重组是将外源 DNA 与载体分子连接，这样重新组合的 DNA 叫做重组体或重组子。DNA 重组的方法主要有粘端连接法和平端连接法。重组的 DNA 分子是在 DNA 连接酶的作用下，有 Mg2+、ATP 存在的连接缓冲系统中，将分别经酶切的载体分子与外源DNA 分子进行连接。连接反应的温度在
10、 37时有利于连接酶的活性，但是在这样的温度下，粘性末端的氢键结合是不稳定的。一般的连接条件是在 12-16，反应 12-16 小时( 过夜)。实验基本操作步骤：1. 纯化目的 DNA2. 连接重组【所需主要仪器设备】恒温水浴锅；小型高速离心机实验七 蓝白斑筛选实验【实验类型】基础性实验【目的与要求】掌握重 组 子 （ 阳性克隆）的筛选技术。未转化的菌将不能在培养基（含 Amp）上生长；空载体的转化子为蓝色菌斑；重组子的转化子为白色菌斑。可挑取白色菌斑，LB 液体培养基（含 Amp）37振荡培养过夜，提取质粒，酶切鉴定插入的片段是否正确。【内容提要】蓝白斑筛选是重组子筛选的一种方法，是根据载体
11、的遗传特征筛选重组子，如 -互补、抗生素基因等。由 -互补而产生的 LacZ+细菌在诱导剂 IPTG 的作用下，在生色底物X-Gal 存在时产生蓝色菌落，因而易于识别。然而，当外源 DNA 插入到质粒的多克隆位点后，几乎不可避免地导致无 -互补能力的氨基端片段，使得带有重组质粒的细菌形成白色菌落。这种重组子的筛选，又称为蓝白斑筛选。经连接产物转化的大肠杆菌工程菌平板37温箱倒置培养 12-16 h 后，有重组质粒的细菌形成白色菌落。实验基本操作步骤：1. 同转化实验2. 转化平板的制备【所需主要仪器设备】1.超净工作台 2.恒温水浴 3.恒温摇床实验八 DNA 酶切技术【实验类型】基础性实验【
12、目的与要求】掌握 DNA 的酶切技术，了解它在 DNA 重组中的应用。【内容提要】限制性内切酶能特异地结合于一段被称为限制性酶识别序列的 DNA 序列之内或其附近的特异位点上，并切割双链 DNA。它可分为三类: 类和 类酶在同一蛋白质分子中兼有切割和修饰(甲基化) 作用且依赖于 ATP 的存在。类由两种酶组成 : 一种为限制性内切核酸酶( 限制酶),它切割某一特异的核苷酸序列; 另一种为独立的甲基化酶 ,它修饰同一识别序列。类中的限制性内切酶在分子克隆中得到了广泛应用，它们是重组 DNA 的基础。绝大多数类限制酶识别长度为 4 至 6 个核苷酸的回文对称特异核苷酸序列。DNA 限制性内切酶的酶
13、切图谱又称 DNA 的物理图谱，它由一系列位置确定的多种限制性内切酶酶切位点组成，以直线或环状图式表示。在 DNA 序列分析、基因组的功能图谱绘制、 DNA 的无性繁殖、基因文库的构建等工作中，建立限制性内切酶图谱都是不可缺少的环节，近年来发展起来的 RFLP(限制性片段长度多态性)技术就是建立在它的基础上。实验基本操作步骤：1. 提取质粒2. 酶切3. 电泳【所需主要仪器设备】1.超净工作台 2.恒温水浴 3.恒温摇床 4.恒温培养箱 5.小型高速离心机 6.漩涡混合器五、实验学时分配实验项目名称、实验学时、实验类型、项目类别、开放性等。序号 实验项目名称实验学时 实验类型必做/选做是否为开
14、放实验 备注1 大肠杆菌感受态细胞的制备 3 基础性 必做 是2 质粒 DNA 的转化 3 基础性 必做 是3 质粒 DNA 的提取 3 基础性 必做 是4 琼脂糖凝胶电泳检测 DNA 3 基础性 必做 是5 PCR 基因扩增 3 基础性 必做 是6 DNA 重组 3 基础性 必做 是7 蓝白斑筛选实验 3 基础性 必做 是8 DNA 酶切技术 3 基础性 必做 是合计 24六、所在实验室及主要仪器设备（一）实验室名称：分子生物学实验室（二）主要仪器设备：超净工作台、低温离心机、恒温摇床、紫外分光光度仪、恒温培养箱、小型高速离心机、漩涡混合器、琼脂糖凝胶电泳系统、凝胶成像系统、PCR 仪七、使
15、用教材及主要教学参考书教材：现代分子生物学实验技术（第 2 版） 魏春红等主编，2012，高等教育出版社参考书：分子生物学实验指导魏群主编，1999，高等教育出版社分子克隆实验指南J.萨姆布鲁克，1999，科学出版社八、课程考核方式与成绩评定课程需撰写实验报告，要求：实验名称、目的、内容、原理、设备、实验步骤、实验记录、数据处理（实验现象描述、原理论证、结构说明、误差分析等） 、讨论等。以实际操作为主的方式进行成绩考核，根据需要确定具体项目和占总成绩的比例。考勤 30%+实验技能 30%+实验报告 40%，实验技能主要是以实际操作为主的方式进行成绩考核，而考勤包括每次实验的预习、纪律、卫生等。制 订：生命科学系 教研室：生物科学教研室执笔人：曹建斌 审订人：李新
