1、 高效液相色谱法测定保健食品中维生素 E 的测量不确定度评定 作者简介：林贤邦（1990-），男，本科，技术员，主要从事保健食品功效成分检测。*通信作者:蔡伟江（1985-），男，本科，技术员，主要从事保健食品功效成分检测。Email:高效液相色谱法测定保健食品中维生素E的测量不确定度评定林贤邦，陈宏壁，陈彩云，苏昭仑，蔡伟江 *（汤臣倍健股份有限公司，广东 珠海 519040） 摘 要：利用高效液相色谱测定保健食品中维生素 E 的含量,分析了不确定度来源,建立了高效液相色谱含量测定法的数学模型。对其中的标准溶液配置、样品准备、测量重复性等各个不确定度分量进行评估。计算得出本实验测定结果的扩展
2、不确定度为 U=1.14%。关键词：不确定度；高效液相；维生素E；保健食品High Performance Liquid Chromatography (HPLC) Method Was Developed For The Determination Of Vitamin E In health Food Measurement Uncertainty EvaluationLin Xianbang，Chen Hongbi，Chen Caiyun，Su Zhaolun ；Cai Weijiang(By-Health Co.，Ltd,Guangdong Zhuhai 519040)Abstract
3、: Using high performance liquid chromatography (HPLC) determination of the content of vitamin E in health food, analyzes the sources of uncertainty, established the mathematical model of high performance liquid chromatography (HPLC) content measurement. About the configuration of standard solution,
4、sample preparation, to evaluate the uncertainty components of measurement repeatability. Calculated from the experiment, the expanded uncertainty of determination results for U = 1.14%.Key words: uncertainty； high performance liquid；vitamin E； health food维生素 E 是指具有 生育酚生物活性的一类物质，在自然界中共有 8 种存在形式：-T，-T
5、，-T，-T 四种生育酚， -TT，-TT，-TT，-TT 四种生育三烯酚。维生素E（Vitamin E）是一类脂溶性维生素，易溶于脂肪和乙醇等有机溶剂中。本中心测定保健品中维生素 E 依据 GB 5413.9-20101中维生素 E 含量的测定方法进行测定。依据检测实验室具有并应用测量不确定度的程序对检测结果的测量不确定度进行评定，并依照JJF 1059.1-2012 测量不确定度评定与表示 2要求，建立维生素 E 含量的不确定度评定的一般模式，根据评定结果确认方法制定的可行性范围的一般方法。1 测定方法描述1.1 测量方法高效液相色谱法测定保健食品中维生素 E 的测量不确定度评定 作者简介
6、：林贤邦（1990-），男，本科，技术员，主要从事保健食品功效成分检测。*通信作者:蔡伟江（1985-），男，本科，技术员，主要从事保健食品功效成分检测。Email:GB 5413.9-20101.2 方法提要试样皂化后，经石油醚萃取，蒸走石油醚并无水乙醇定量溶解，以甲醇为流动相，使用填料为C18,4.6mm250mm,5m 的不锈钢柱和紫外可变波长检测器 UV294nm，流速 1.0min/mL,柱温 40C，对样品的维生素 E 进行液相色谱分离和测定。1.3 维生素 E 含量（mg/g）计算公式X=C*V/M式中： X样品维生素 E 的含量； mg/gM样品的质量，g；V样品的稀释倍数，m
7、L；C样品溶液中维生素 E 的浓度，mg/mL。1.4 分析步骤1.4.1 标样溶液的配制精确称取 38.33mg 维生素 E 标准品于 50ml 容量瓶中，加入乙醇溶解后定容至刻度。维生素 E 校正：精密量取 生育酚 1mL，用无水乙醇定容至 25mL，以乙醇为空白，在 294nm波长处测定 d-生育酚吸光度，按校正公式:C=A*V*10/E。其中 C 是维生素 E 浓度（单位为 mg/mL），A 是紫外吸光度，E 是维生素 E1%比色光系数，V 是标准液稀释倍数；10单位转换系数。(d-生育酚吸光系数为 71)。1.4.2 样品处理1.4.2.1 皂化精确称取样品适量于 250mL 具塞锥
8、形瓶中，加入 50mL 4550水使其溶解，加入约 100mL 1.5%抗坏血酸的乙醇溶液，充分混匀后加入 25mL 氢氧化钾溶液混匀，放入磁力搅拌子，充氮排出空气，塞上瓶塞。将锥形瓶放入恒温磁力搅拌水浴锅中，控制水温在 532，皂化 45min 后，取出立刻冷却至室温。1.4.2.2 提取及浓缩用少量水将皂化液全部转入 500mL 分液漏斗中，加入 100mL 石油醚，轻轻摇荡，排气后塞好瓶塞，室温下振荡约 10min 后静置分层，将水相转入另一 500mL 分液漏斗中，按上述方法进行二次萃取。合并醚液，用水洗至近中性。醚液通过无水硫酸钠过滤脱水，醚液收入 250mL 圆底烧瓶中，高效液相色
9、谱法测定保健食品中维生素 E 的测量不确定度评定 作者简介：林贤邦（1990-），男，本科，技术员，主要从事保健食品功效成分检测。*通信作者:蔡伟江（1985-），男，本科，技术员，主要从事保健食品功效成分检测。Email:于旋转蒸发器上在 402充氮条件下蒸至近干，残渣紧密加入 25mL 乙醇，超声溶解，过膜后待测。1.4.3 测定待仪器稳定后,注入标准溶液和试样，根据标准溶液和试样的峰面积，算出试样中的含量。1.5 主要仪器电子天平 AL204（METTLER TOLEDO）；高效液相色谱仪 1260（Agilent technologies）；紫外分光光度计 UV-2450（岛津）。2
10、分析过程2.1 识别不确定度来源A 类标准不确定度：通过实验测得数据，以统计分析方法评定的不确定度，结果以实验标准差表征；B 类标准不确定度：根据经验、资料及假设的不确定度以概率分布估计获得的标准偏差表征。2.2 不确定度的来源（1）试样重复测定时，总重复性引起的不确定度 ur(x1)。（2）标准物质引起的标准不确定度 ur(x2)。（3）样品引起的标准不确定度 ur(x3)。（4）仪器（液相色谱仪）引起的标准不确定度 ur(x4)。根据以上分析，不确定度来源如图的因果图所示。高效液相色谱法测定保健食品中维生素 E 的测量不确定度评定 作者简介：林贤邦（1990-），男，本科，技术员，主要从事
11、保健食品功效成分检测。*通信作者:蔡伟江（1985-），男，本科，技术员，主要从事保健食品功效成分检测。Email:重复性样品吸光度测量稀释d- -生育酚的含量 w液相色谱仪人员操作样品称量标准物质称量皂化仪器定容浓缩图 1 维生素 E 试样有效成分含量测定的不确定度来源2.3 不确定度来源量化2.3.1 不确定度传播律由于数学模型是非线性模型，采用相对不确定度合成公式：ucr(x)= u2r(x1)+ u2r(x2)+ u2r(x3)+ u2r(x4)1/22.3.2 标准不确定度各分量的评定2.3.2.1 试样重复测定时，总重复性引起的标准不确定度分量 ur(x1)u(x1)包括：人员、环
12、境、仪器重复性等因素引起的不确定度；标准物质；天平重复称量引起的不确定度等。本法按“GB 5413.9-2010 维生素 E”的要求，通过对同一试样进行实验室内部比对试验，得出一组数据，见表 1。表 1 样品中维生素 E 含量重复测定 10 次结果序 号 含量（%）1 4.5482 4.5533 4.5534 4.5485 4.546 4.5477 4.5518 4.551高效液相色谱法测定保健食品中维生素 E 的测量不确定度评定 作者简介：林贤邦（1990-），男，本科，技术员，主要从事保健食品功效成分检测。*通信作者:蔡伟江（1985-），男，本科，技术员，主要从事保健食品功效成分检测。E
13、mail:9 4.55210 4.549维生素 E 含量测量单次的标准偏差为：S1=0.00388158标准不确定度: u(x 3.2.1)= =0.00388158/ =0.001228nS10相对标准不确定度为： = =0.001228/4.5492=0.02699%)(1.23xurx)(1.23此数值可作为测量重复性的方法确认结果，以后评定可采用此数据。ur(rep)=ur(x2.3.2.1)= 0.02699%在实际工作过程中，当测定某维生素 E 样品中维生素 E 含量 2 次时，取其算术平均值 4.549 作为测量结果，故测定重复性引起的标准不确定度分量为：ur(x1)=ur(x2
14、.3.2.1)/ =0.02699%/ =0.02%2.3.2.2 标准物质引起的标准不确定度分量 ur(x2)2.3.2.2.1 标准物质校正前稀释引入的不确定度 ur（x 2.3.2.2.1）溶液定容过程引起不确定度主要由 1mL 单标移液管（B 级）引入的不确定度。2.3.2.2.1.1 1mL 单标移液管校准产生的标准不确定度 u r（x 2.3.2.2.1.1）按照 1mL 单标移液管的校准证书知，实验中所用的 1mL 单标移液管都属于 B 级测量结果的扩展不确定度 U=0.00048mL， k=2，属于正态分布，则有：标准不确定度为：u(x 2.3.2.2.1.1)= =0.000
15、48/2=0.00024mLkU相对标准不确定度为：u r(x2.3.2.2.1.1)=0.00024/1=0.024%2.3.2.2.1.2 溶液温度与校准温度不同产生的标准不确定度 ur（x 2.3.2.2.1.2）假设溶液与校准温度的差异为5，移液管的体积为 1mL，水体积膨胀系数 水为(2.110 -4)/，水的体积膨胀明显大于玻璃的体积膨胀，因此只需考虑水的体积膨胀即可，按矩形分布，取 k ，则有：标准不确定度为：u（x 2.3.2.2.1.2）=152.110 -4/ 0.00061mL3 3相对标准不确定度为：u r(x2.3.2.2.1.2)= 0.00061/1=0.061%
16、1mL 单标线移液管产生的合成相对标准不确定度：高效液相色谱法测定保健食品中维生素 E 的测量不确定度评定 作者简介：林贤邦（1990-），男，本科，技术员，主要从事保健食品功效成分检测。*通信作者:蔡伟江（1985-），男，本科，技术员，主要从事保健食品功效成分检测。Email:ur(x2.3.2.2.1)= =0.07%）（）（ %061.202.2.3.2.2.2 溶液定容过程引起的不确定度 ur（x 2.3.2.2.2）溶液定容过程引起不确定度主要由 25 mL 单标线容量瓶 (B 级) 引入的不确定度。2.3.2.2.2.1 25 mL 容量瓶校准产生的标准不确定度 u r（x 2.
17、3.2.2.2.1）按照 25 mL 单标线容量瓶的校准证书知，实验中所用的 25 mL 单标线容量瓶都属于 B 级测量结果的扩展不确定度 U=0.01mL， k2，属于正态分布，则有：标准不确定度为：u(x 2.3.2.2.2.1) =0.01/20.005mLkU相对标准不确定度为：u r(x2.3.2.2.2.1)=0.005/25=0.020%2.3.2.2.2.2 溶液温度与校准温度不同产生的标准不确定度 ur（x 2.3.2.2.2.2）假设溶液与校准温度的差异为5，容量瓶的体积为 25mL，水体积膨胀系数 水为(2.110-4)/，水的体积膨胀明显大于玻璃的体积膨胀，因此只需考虑
18、水的体积膨胀即可，按矩形分布，取 k ，则有：标准不确定度为：u（x 2.3.2.2.2.2）=2552.110 -4/ 0.016mL3 3相对标准不确定度为：u r(x2.3.2.2.2.2)=0.015/25=0.064%25 mL 单标线容量瓶产生的合成相对标准不确定度：ur(x2.3.2.2.2)= =0.07%）（）（ %064.202.2.3.2.2.3 标准物质浓度校正引入的不确定度 ur（x 2.3.2.2.3）用紫外分光光度计进行浓度校正，维生素 E 标准物质吸光度 =0.2177；紫外分光光度计的校准证书给出的测量结果示值误差的扩展不确定度 U=0.0022，k=2，属正
19、态分布，则有：标准不确定度为：u(x 2.3.2.2.3)= =0.0022/2=0.0011kU相对标准不确定度为：u r(x2.3.2.2.3)=0.0011/0.2177=0.506%由上面分析可得，维生素 E 标准物质引起的相对标准不确定度为：=)(2xur )3.2.32(2)2.32(2)1.2.32(2 xruxruxru =0.52%2.3.2.3 维生素 E 样品引起的标准不确定度 ur(x3)2.3.2.3.1 样品称量引起的不确定度 ur（x 2.3.2.3.1）高效液相色谱法测定保健食品中维生素 E 的测量不确定度评定 作者简介：林贤邦（1990-），男，本科，技术员，
20、主要从事保健食品功效成分检测。*通信作者:蔡伟江（1985-），男，本科，技术员，主要从事保健食品功效成分检测。Email:用电子天平进行称量，维生素 E 试样重量 m=0.2243g, 天平的校准证书给出的测量结果示值误差的扩展不确定度 U=0.3mg，k=2，属正态分布，则有：标准不确定度为：u(x 2.3.2.2.2)= =0.3/2=0.00015gkU相对标准不确定度为：u r(x2.3.2.3.1)= 0.00015/0.2243=0.067%2.3.2.3.2 样品处理引起的不确定度 ur（x 2.3.2.3.2）将样品处理引起的不确定度量化，用回收率来整体评价样品处理过程的不确
21、定度。分析程序的回收率在实验室确认使用标准加入法分析。表 2 收集了实验室对含维生素 E 样品中的维生素 E 标准回收率进行 10 次分析的结果。表 2 维生素 E 标准回收率分析结果测量组分 加入标准的量/mg 测量次数 n Rec 平均回收率/% S2 标准偏差/%维生素 E 1.533 10 98.76 0.6由上面分析可得，维生素 E 样品引起的相对标准不确定度为：=)(3xur )2.3.2()1.32.(2xruxru=0.20%2.3.2.4 液相色谱仪引起的不确定度 ur(x4)检测结果的重现性主要受操作人员的样品处理过程的一致性，样品的均匀性和仪器本身的性能因素的影响，该不确
22、定度属 A 类评定，采用同一样品进行重复实验进行评估，其中的测量结果如下表 3：表 3 重复进样 5 次峰面积的测量值序号 峰面积 A1 4355.427732 4374.029793 4353.947754 4362.066895 4359.55566平均值 4361.00556单次测量结果的标准偏差：标准不确定度为： u(x 2.3.2.4)=7.125/ =3.1875高效液相色谱法测定保健食品中维生素 E 的测量不确定度评定 作者简介：林贤邦（1990-），男，本科，技术员，主要从事保健食品功效成分检测。*通信作者:蔡伟江（1985-），男，本科，技术员，主要从事保健食品功效成分检测。
23、Email:相对标准不确定度为： = =3.187/4361.00556=0.08%)(4xurx)4.23(表 4 相对标准不确定度一览表名称 不确定度来源 类型 相对标准不确定度值ur (x1) 方法总重复性 A 0.02%ur (x2) 维生素 E 标准物质 B 0.52%ur (x3) 维生素 E 样品 A 0.20%ur (x4) 液相色谱仪 A 0.08%2.4 合成标准不确定度评定由表 3 中各相对不确定度合成ucr(x)=u2r(x1)+u2r(x2) + u2r(x3) + u2r(x4)1/2=(0.02%)2+(0.52%)2+(0.20%)2+(0.08%)21/2=0
24、.564%3 扩展不确定度评定扩展不确定度可由合成标准不确定度乘以包含因子，取置信概率 p=95%,则 k=2，因此维生素 E样品中的维生素 E 含量测定的相对扩展不确定度为：U=kucr(x)=20.57%=1.14%4 测量不确定度的报告与表示维生素 E 样品中维生素 E 含量的测量结果为：W=4.5490.014 mg/g；k=25 测量不确定度统计直方图各测量不确定度的统计直方图如图 2 所示。图 2 维生素 E 样品中维生素 E 有效成分含量测定的不确定度分量6 结论高效液相色谱法测定保健食品中维生素 E 的测量不确定度评定 作者简介：林贤邦（1990-），男，本科，技术员，主要从事
25、保健食品功效成分检测。*通信作者:蔡伟江（1985-），男，本科，技术员，主要从事保健食品功效成分检测。Email:从不确定度分量图可以看出，保健食品中维生素 E 有效成分含量测定的测量不确定度因素中，影响最大是标准物质，样品配置过程和液相色谱仪，其次是方法总重复性等而产生的不确定度。因而，要求分析人员要熟练掌握样品从称量到皂化、浓缩时的各项操作技术，同时还要熟练掌握分析操作过程中的各项要领，选用工作标准品时应选择纯度较高的标准品以及选用精度高的分光光度计，并严格按照规定的检测条件进行测定。参考文献1GB 5413.9-2010.食品安全国家标准婴幼儿食品和乳品中维生素 A、D、E 的测定S2JJF 1059.1-2012.测量不确定度评定与表示S3中国实验室国家认可委员会化学分析中不确定度的评估指南M北京：中国计量出版社，20024国家质量技术监督局计量司组测量不确定度评定与表示指南M北京：中国计量出版社，20045 玻璃仪器的校准单位 广州广电计量检测股份有限公司/信息产业部电子 602 计量站6 液相色谱仪的校准单位 广州广电计量检测股份有限公司/信息产业部电子 602 计量站
