1、海棠不同叶位叶片色素含量的研究龚洪泳 1, 赵明明 1,2, 范俊俊 1,2, 张往祥 1,2*, 卫紫星 1，张洋 1（1. 南京林业大学林学院，江苏 南京 210037；2. 扬州小苹果园艺有限公司，扬州 225200）摘要：以 34 个海棠品种为试材，从中选取叶片色彩跨度较大的 5 个品种（冬红 Malus Winter Red、阿迪荣 M. Addirondack、亚当 M. Adams、鲁道夫 M. Rudolph和完美紫 M. Perfect Purple），利用光谱法与溶液法，对叶片色素（叶绿素、类胡萝卜素、花青素）相对含量及绝对含量进行测定、耦合，并通过耦合函数计算其余 29
2、个海棠品种叶片色素的绝对含量。旨在建立观赏海棠叶片色素含量的无损伤测定方法，同时通过海棠上、中、下叶位色素含量的研究，揭示不同叶位色素含量的差异及其变化规律。结果表明：通过对海棠叶片 3 种色素绝对含量与相对含量的耦合，拟合的相关系数分别为 R2=0.9875（叶绿素）、R2=0.9994（类胡萝卜素）、 R2=0.9905（花青素），方程拟合度较好；在海棠的不同叶位中，各品种叶片在叶绿素、类胡萝卜素、花青素 3 个维度上的变化呈规律性空间分布特点，其中，叶绿素呈增加趋势，类胡萝卜素和花青素呈下降趋势。关键词：海棠；叶片；色素含量；耦合函数Study of Pigment Contents i
3、n Different Malus Leaf Positions GONG Hongyong1, ZHAO Mingming1,2, FAN Junjun1,2, ZHANG Wangxiang1,2*, WEI Zixing1, ZHANG Yang1(1. Forestry College of Nanjing Forestry University，Jiangsu Nanjing 210037; 2. Yangzhou Small Apple Horticulture Co., Ltd. Yangzhou 225200)Abstract: Set 34 varieties of Malu
4、s as test material, and select 5 varieties with larger color spans in leaf from them (Malus Winter Red, M. Addirondack, M. Adams, M. Rudolph and M. Perfect Purple). Measure and couple the relative content and absolute content of leaf pigment (chlorophyll, carotenoids, anthocyanins) by spectroscopy a
5、nd solution method, furthermore to calculate the absolute content of leaf pigment in other 29 varieties by coupling function. The aim is to build a non destructive measuring method to measure the leaf pigment content in Malus sp, and to reveal the pigment content difference in different leaf positio
6、ns and the variation rules through studying pigment content respectively in upper, middle or lower leaf position. The result is as follow: after coupling the absolute content and relative content of 3 pigments in Malus sp leaf, the related coefficient fitted are R2=0.9875(chlorophyll), R2=0.9994(car
7、otenoids), R2=0.9905(anthocyanins), while the equation is well; At different positions and in different leaves , chlorophyll, carotenoids, anthocyanins have spatial distribution regularities; Chlorophyll presents a trend of increase, carotenoids and anthocyanins present a trend of decrease.Key words
8、: Malus; Leaf; Pigment Content; Coupling Function基金项目：江苏省大学生实践创新训练计划项目：“彩叶观赏海棠新品种选育“201410298067Y. ；作者简介：龚洪泳（1993- ），女，本科生，研究方向为观赏植物栽培。通讯作者：张往祥，（1965- ），男，副教授，主要从事观赏园艺研究，E-mail: 。海棠是蔷薇科苹果属（Malus）的灌木或小乔木 1，品种丰富，树姿优美，花开似锦，入秋后金果满树，芳香袭人，自古以来是雅俗共赏的名树 2。海棠叶色多样（红色、紫色、绿色等），具有极高的观叶价值，在公园绿化以及建筑装饰中已获得广泛关注 3。叶色
9、是各种色素综合作用所表现出来的结果，不同色素种类及其含量的时空组合最终决定叶色 4。对于海棠色素含量的研究已有报道，如张往祥等 5对于观赏海棠品种群开花进程中色素组分动态特征的研究，韩振云等 6在探讨 UFGT 基因在观赏海棠叶片呈色过程中的作用是研究了其花色素苷的含量，李玲 7对王族海棠（MalusRoyalty）叶片内色素进行定性分析，孙方行等 8研究了盐胁迫下两种海棠光合能力及色素含量的变化。但是，这些研究多重点围绕海棠花朵色素含量进行，或者是少部分海棠叶片色素含量的研究，没有形成针对海棠品种群叶片色素含量的研究体系。此外，传统的植物色素含量的测定多用比色法 9-13，或液相色谱法 14
10、,15，但是，这两种方法均需破坏性取样，且测定时间长、成本高，无法对叶片生长过程中的色素含量进行动态观测。目前，随着高光谱遥感技术的发展，越来越多的研究人员开始利用光谱分析系统进行色素含量监测 16,17,，且已学者发现通过比色法测定的色素绝对含量与光谱分析系统测定的相对含量具有一定的相关性 18。因此，本研究将比色法测得的海棠叶片色素绝对含量与光谱法测得的相对含量进行耦合，并计算其他海棠色素含量，进而分析观赏海棠上、中、下位叶片色素含量的差异，为海棠叶片色素定性评价体系提供支撑。1 材料与方法1.1 试验地概况试验地位于扬州市江都区仙女镇（东经 11955，北纬 3242），亚热带季风气候，
11、年平均气温 14.9，年平均降雨量 1000mm，无霜期较长。试验地土壤肥沃，地势平坦，灌排条件良好。1.2 试验材料试验材料为 34 个海棠品种，均为 1a 生嫁接苗，多引自欧美地区，在长三角地区生长适应，叶色丰富，表现良好（见表 1）。表 1 试验材料表No. 品种名称 Cultivar name No. 品种名称 Cultivar name1 阿迪荣 Malus Addirondack 18 丽莎 M. Lisa2 阿美 M. Almey 19 鲁道夫 M. Roudph3 芭蕾舞 M. Ballet 20 罗宾逊 M. Robinson4 宝贝 M. Thunderchild 21 马
12、凯米克 M. Makamik5 贝腾 M. Batten 22 玛丽波特 M. Marry Potter6 春之韵 M. Spring Sensation 23 乔劳斯基 M. tschonoskii7 冬红 M. Winter Red 24 时光秀 M. Show Time8 冬金 M. Weinter Gold 25 天鹅绒住 M. Velvet pillar9 粉冠 M. Pink Sprires 26 完美紫 M. Perfect Purple10 高原红 M. Prainfire 27 绣球 M. Hydrargea11 豪帕 M. Hopa 28 绚丽 M. Gorgeous12
13、红巴伦 M. Red Baron 29 雪坠 M. Snowdrift13 红熙 M. Red Nessy 30 亚当 M. Adams14 皇家 M. Royalty 31 亚瑟王 M. King Arthur15 黄玉 M. Yellow Jade 32 洋溢 M. Radiant16 金丰收 M. Harvest Gold 33 迎春雪 M. Spring Snow17 可辛奈拉 M. Coccinella 34 紫宝石 M. Purpura Gem1.3 试验方法1.3.1 溶液法测定叶片色素绝对含量（1）样品采集从供试样品选取叶片色彩差异较大的 5 个品种（冬红、阿迪荣、亚当、鲁道夫
14、、完美紫）利用比色法进行色素含量的测定。每个品种采集随机采集 10 片叶，立即放入冰盒中，带回实验室，测定其色素含量。（2）测定方法叶绿素与类胡萝卜素含量的测定参考李合生的方法 19。计算方法为：叶绿素 a（Ca）=13.95A665-6.88A649；叶绿素 b（Cb）=24.96A 649-7.32A665，此两式相加为叶绿素总浓度；类胡萝卜素=（ 1000A470-2.05Ca-114.8Cb）/245。求得色素浓度后，再按下式计算叶片中单位鲜重各色素含量：叶绿体色素含量（mg/g）=（色素的浓度提取液体积稀释倍数）/样品鲜重。叶片中花青素的含量使用盐酸乙醇法测定 20。依据公式 OD=
15、（OD 530-OD620）-0.1（OD 650-OD620）计算花青素光密度值，再依据下式计算花青素含量：花青素含量（ nmol/g）=OD /V/m1000000。其中，OD 表示花青素在 530nm 波长下的光密度； 表示花青素摩尔消光系数，为4.62106；V 表示提取液总体积（ml）；M 表示取样质量（ g）；1000000 表示计算结果换算成 nmol 的倍数。1.3.2 光谱法测定叶片色素相对含量（1）样品采集所取试材为试验苗木地向阳处同一方位，取植株上位叶（顶端叶片）、中位叶（二级枝条顶端第 2、3 个叶片）、下位叶（二级枝条第 56 位叶）各 5 片，保持所采集叶片健康无虫
16、害、长势相同、颜色均匀一致。于上午 6：008：00 采集试验材料，即刻分别放入样品保鲜袋，封口后置于装有冰块的保鲜箱中带回室内，6h 内完成测量 21。（2）测定方法利用叶片中各种色素对光谱反射特性不同，测定样品对不同光谱的反射特性便能测出其中多种不同色素的含量，如叶绿素、类胡萝卜素以及花青素循环库的大小等指标 22。所用仪器为 Unispec 光谱仪（英国 PPSystems 公司），通过测定叶片的反射光谱值，计算出叶片中色素的相对含量。计算公式为叶绿素 mSR705=（R 750-R445）/（R 705-R445），类胡萝卜素 R800（ 1/R520-1/R700），花青素 3R80
17、0（1/R 550-1/R700）。1.3.3 拟合耦合函数及数据处理构建拟合耦合函数 24，将色彩跨度较大的 5 个海棠品种色素的绝对含量和相对含量进行拟合，得到耦合函数，并应用于其他海棠品种叶片色素绝对含量的换算，得出运用光谱分析仪测定植物叶片色素含量的新方法 23。利用 Excel 软件绘制叶绿素、类胡萝卜素、花青素柱状图，利用 Matlab 7.0 软件绘制其三维图。2 结果与分析2.1 海棠 3 种色素相对含量和绝对含量表 2 为叶片色彩梯度较大的 5 个海棠品种的色素含量。对于叶片色素绝对含量而言，在这 5 个海棠品种中，叶绿素、类胡萝卜素、花青素最高的均为鲁道夫；叶绿素最低为亚当
18、；类胡萝卜素和花青素最低为冬红。对于叶片色素相对含量而言，在这 5 个海棠品种中，叶绿素最高的为完美紫色，类胡萝卜素和花青素最高的均为鲁道夫；叶片中叶绿素最低的为鲁道夫，类胡萝卜素和花青素最低的均为冬红。表 2 叶绿素、类胡萝卜素、花青素绝对含量和相对含量叶绿素 类胡萝卜素 花青素品种绝对含量 mg/g 相对含量 绝对含量 mg/g 相对含量 绝对含量 nmol/g 相对含量冬红 2.10 2.08 0.49 0.87 0.001 0阿迪荣 2.15 2.04 0.53 1.06 0.0019 0鲁道夫 2.27 1.92 1.15 3.31 0.0093 3.23完美紫 2.096 2.47
19、 0.99 2.68 0.0080 2.63亚当 2.08 2.16 0.97 2.65 0.0081 2.532.2 色素绝对含量与相对含量的函数耦合观赏海棠叶片各色素含量的耦合函数中，叶绿素为 y=1.64x2-7.53x+10.67（R 2=0.9875），类胡萝卜素为 y=0.28x+0.24（ R2=0.9994），花青素为y=0.0025x+0.0015（R 2=0.9905）。3 种色素拟合效果较好（图 1），可适用于 29 种海棠叶片色素绝对含量的计算。2.002.052.102.152.202.252.301.8 2 2.2 2.4 2.6叶 绿 素 相 对 含 量叶绿素绝对
20、含量mg/g0.20.40.60.811.21.40.5 1.5 2.5 3.5类 胡 萝 卜 素 相 对 含 量类胡萝卜素绝对含量mg/g00.0020.0040.0060.0080.010 1 2 3 4花 青 素 相 对 含 量花青素绝对含量nmol/g图 1 3 种色素绝对含量与相对含量的耦合函数2.3 海棠叶片色素含量分析基于 29 个海棠品种叶片的 3 种色素建立三维图，见图 2。从上位叶到下位叶，叶绿素维度方向出现位点总体右移趋势（叶绿素含量增加），高叶绿素含量的品种比例增加。上位叶叶绿素含量范围在 2.047.37 之间，罗宾逊的叶绿素含量最低，紫宝石的叶绿素含量最高；中位叶叶
21、绿素含量范围在 2.048.62 之间，亚瑟王的叶绿素含量最低，紫宝石的叶绿素含量最高；下位叶中叶绿素含量范围 2.036.15 之间，阿美的叶绿素含量最低，紫宝石的叶绿素含量最高。在类胡萝卜素维度方向随着叶位的下移，出现位点总体右移趋势（类胡萝卜素含量下降），高类胡萝卜素含量的品种比例减少。上位叶类胡萝卜素含量范围在 0.252.33 之间，亚瑟王类胡萝卜素含量最低，皇家类胡萝卜素含量最高；中位叶类胡萝卜素含量范围在0.311.11 之间，紫宝石类胡萝卜素含量最低，时光秀类胡萝卜素含量最高；下位叶类胡萝卜素含量范围在 0.281.02 之间，紫宝石类胡萝卜素含量最低，皇家类胡萝卜素含量最高。
22、从上位叶到下位叶，在花青素维度方向出现位点总体下移趋势（花青素含量下降），花青素含量的叶片比例减少，上位叶花青素含量范围在 0.010.017 之间，绚丽花青素含量最低，时光秀花青素含量最高；中位叶花青素含量范围在 0.0010.007 之间，冬金花青素含量最低，皇家花青素含量最高；下位叶花青素含量范围在 0.0010.004 之间，黄玉花青素含量最低，天鹅绒住花青素含量最高。图 2 不同叶位海棠叶片色素含量3 讨论3.1 植物叶片色素含量的无损伤测定传统的色素提取过程和测定过程都比较费时耗力，并且操作步骤繁琐，测定过程还需要破坏大量的植物材料。在可见光波段内，利用植被高光谱信息估测色素含量具
23、有可行性24,25，因此，色素测定的新方法是选择 5 个色彩跨度较大的品种作为梯度标准，利用光谱仪测定其色素相对含量，比色法测定其绝对含量，构建色素相对含量和绝对含量的耦合关系，得出两者的换算公式 26。该方程只能应用于蔷薇科苹果属不同海棠品种叶片的色素含量测定 27。这种新方法优于传统方法，操作简单，降低对材料的浪费，避免对植株造成机械损伤，可以用于不同海棠叶片色素含量测定 26。3.2 观赏海棠不同叶位色素含量差异分析植物不同叶位间色素含量是有差异的，王美玲等 28研究显示两个紫甘蓝品种叶绿素含量在上位叶中最低，中位叶和下位叶差异不明显；花青素含量在上位叶中含量最高，中位叶中含量最低。本研
24、究通过溶液法及光谱法测得数据进行耦合后，算得 29 个观赏海棠品种的色素含量，结果显示，观赏海棠叶片的叶绿素、类胡萝卜素及花青素含量在不同叶位上是有差别的。上位叶的叶绿素含量比中、下位叶低，这是由于上位叶多为嫩叶，中位叶和下位叶多为老叶，随着叶片的逐渐成熟，叶绿素含量也逐渐增加，这与郝峰鸽 29研究结果一致。此外，上位叶及中位叶比下位叶的光照时间长，光照强度大，且不同光照强度下叶片的净光合速率、蒸腾速率不同 30，所以海棠叶片上、中位叶类胡萝卜素含量和花青素含量比下位叶高。参 考 文 献1 俞德浚. 中国植物志M. 北京: 科学出版社, 1974: 372-375.2 姜楠南. 中国海棠花文化
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