1、 高效液相色谱法测定保健食品中维生素 A 含量的不确定度评定第 1 页 共 9 页高效液相色谱法测定保健食品中维生素 A 含量的不确定度评定黄成安,黄康惠,潘拾朝,张喜金（汤臣倍健股份有限公司，广东 珠海 519040）【摘要】目的：全面地分析高效液相色谱法测定保健食品中维生素A 含量的不确定度来源和影响不确定度的因素。方法：根据检测过程，建立数学模型，分析影响不确定度因素的来源，通过对不确定度进行量化分析，得出扩展不确定度。结果：高效液相色谱法测定保健食品中维生素A含量的扩展不确定度为 1.843%。结论：高效液相色谱法测定保健食品中维生素A含量的不确定度主要由标准溶液浓度校正 、标准溶液的
2、配制和方法总重复性引入。【关键词】高效液相色谱法；维生素 A；数学模型；不确定度Assessment of content uncertainty of Vitamin A in health food by HPLCHuang Chengan,Huang Kanghui,Pan Shichao,Zhang Xijin(By-Health Co Ltd,Guangdong Zhuhai 519040)【Abstract】Objective:Comprehensive to analyze the sources and influencing factors of content uncert
3、ainty of Vitamin A in health food by HPLC.Methods:According to the testing process,a mathematical model was established to analyze the sources and influencing factors in uncertainty,through the quantitative analysis of uncertainty,obtained the expanded uncertainty.Result:The expanded uncertainty of
4、Vitamin A in health food by HPLC was 1.843%.Conclusion:The main sources of uncertainty of Vitamin A in health food by HPLC was regulating the concentration of standard solution,preparation of standard solution and the repeatability of method.【Keywords】HPLC;Vitamin A;Mathematical model;Uncertainty引 言
5、维生素 A 能够调节人体的多种生理机能，增强机体免疫能力，在调节体内各方面的代谢及促进骨骼的生长发育上有着极其重要的作用，同时它也参与视网膜视紫质的合成与再生，维持正常的视觉反应，以降低夜盲症和视力减退的发生 1,2。而维生素 A 摄入过量也会引起副作用，可损害脑组织等，因此维生素 A 制剂含量的控制十分重要 3。本文根据 JJF 1059.1-2012测量不确定度评定与表示 4，并参考 JJG 196-2006常用玻璃量器检定规程 5，结合检测方法和数学模型，对高效液相色谱法测定保健食品中维生素 A 的含量进行不确定度评估，找出不确定度主要来源，为方法的优化和评定测量结果提供依据。 高效液相
6、色谱法测定保健食品中维生素 A 含量的不确定度评定第 2 页 共 9 页研究部分1.提要1.1 测量方法：GB/T 5009.82-2003。1.2 基本原理：试样经过高温皂化、提取处理后，用乙醚萃取，蒸干乙醚后用乙醇定量溶解。利用高效液相色谱仪对样品中的维生素 A 进行分离和测定。2.材料与方法2.1 材料2.1.1 仪器设备：Agilent-1260 高效液相色谱仪； KQ-500VED 型超声仪；EMS-50 型恒温水浴锅； UV-2450 紫外分光光度计；R-202 旋转蒸发仪； XP-205 分析天平；MS-304S 分析天平。2.1.2 试药：乙醇(AR) ；抗坏血酸(AR)；氢氧
7、化钾(AR) ；乙醚(AR) ；无水硫酸钠(AR)；甲醇(色谱纯)。芘(厂家 :DR，批号：01116，纯度：99.0%)；维生素 A(厂家：SIGMA,批号：BCBG2044V,纯度：98.0%)。2.2 色谱条件：色谱柱：CNW Athena C 18-WP(5m,150mm4.6mm)； 流动相：甲醇:水=(94:6)；流速：1.0mL/min； 柱温：40； 检测波长：300nm。2.3 分析步骤：2.3.1 内标溶液的配制精密称取芘内标物 49.28mg 至 1000ml 容量瓶中，用乙醇溶解并定容至刻度，摇匀，作为内标溶液。2.3.2 标准储备母液的配制精密称取维生素 A 对照品
8、12.35mg 至 100ml 容量瓶，用乙醇溶解并定容至刻度，摇匀，作为标准储备母液。2.3.3 标准溶液的配制精密量取标准储备母液 0.5mL,1.0mL,2.0mL,3.0mL,5.0mL，置于 25mL 棕色容量瓶中，高效液相色谱法测定保健食品中维生素 A 含量的不确定度评定第 3 页 共 9 页精密加入内标溶液 3mL，用乙醇稀释至刻度，摇匀，即得 5 个不同浓度的标准溶液。2.3.4 标准溶液的浓度校正精密量取 1mL 标准储备母液至 50mL 容量瓶中，加入适量乙醇摇匀并定容至刻度,以乙醇为空白，在 325nm 波长处测定，其平均吸光度为 0.4376。维生素 A 的吸光系数为1
9、835。2.3.5 样品处理2.3.5.1 皂化本实验样品为维生素 A 维生素 D 软胶囊(儿童型)。取 20 粒样品，挤出内容物，搅拌均匀。精密称取试样 0.1g，置于 250mL 锥形瓶中，用约 50mL 乙醇使其溶解，直到颗粒物分散均匀为止。加入 25mL 10%抗坏血酸水溶液、3mL 内标溶液、10mL 氢氧化钾水溶液(1:1)，混匀。于沸水浴回流 60min，使皂化完全。取出立刻冷却至室温。2.3.5.2 提取及浓缩用 50mL 的水分两次将皂化液全部转入 500 mL 分液漏斗中，加入 100mL 乙醚，轻轻摇动，排气后盖好瓶塞，室温下振荡约 10min 后静置分层，将水相转入另一
10、 500mL 分液漏斗中，按上述方法进行第二次萃取。合并醚液，用水洗至近中性。醚液通过无水硫酸钠过滤脱水，滤液收入 500mL 圆底烧瓶中，于旋转蒸发仪上在 502充氮条件下蒸至近干(绝不允许蒸干)。残渣加入适量乙醇，超声波提取溶解，将乙醇转移到25mL 容量瓶中，用乙醇洗涤圆底烧瓶数次，洗涤液全部转移到同一 25mL 容量瓶中，用乙醇定容至刻度，摇匀，过滤，即得供试品溶液。2.3.5.3 测定待仪器稳定后,分别吸取对照品溶液与供试品溶液各20L，注入液相色谱仪，测定。3.数学模型=10式中： X样品中维生素 A 的含量，mg/100g； M样品的质量，g；V样品的稀释体积，mL； C样品溶液
11、中维生素 A 的浓度，g/mL。由实验过程和数学模型可以看出，影响维生素 A 测定结果的不确定度因素有：除了样品的质量，样品的稀释体积, 样品溶液中维生素 A 的浓度之外，还有高效液相色谱仪进样的重复性，样品处理过程的一致性和高效液相色谱仪积分面积重复性等因素对测定结果产生影响。故不确定度的来源可以归纳为以下几个方面：高效液相色谱法测定保健食品中维生素 A 含量的不确定度评定第 4 页 共 9 页3.1 重复测定导致的不确定度 ur(1):包括样品处理过程的一致性所产生的不确定度；3.2 高效液相色谱仪所产生的不确定度 ur(2):包括进样的重复性、液相色谱仪积分面积重复性所产生的不确定度；3
12、.3 样品称量所产生的不确定度 ur(3)；3.4 样品定容体积所引入的不确定度 ur(4):包括容量瓶体积所产生的不确定度；温度变化所产生的不确定度；内标溶液加入体积的不确定度；3.5 标准溶液配制所引入的不确定度 ur(5):包括标准溶液配制过程中容量瓶体积产生的不确定度；稀释 5 个不同浓度标准溶液过程中刻度吸管所产生的不确定度；内标溶液加入体积所产生的不确定度；温度变化所产生的不确定度；3.6 标准溶液浓度校正所产生的不确定度 ur(6):包括紫外分光光度计产生的不确定度；温度变化产生的不确定度；校正标准溶液浓度时所使用的移液管、容量瓶所产生的不确定度；3.7 由于标准溶液的浓度由吸光
13、度来校正，且内标溶液的浓度对测量结果不产生影响，故维生素 A 对照品的称样量及纯度，芘内标物的称样量及纯度，均不参与评定。4.各分量不确定度评定4.1 重复测定导致的不确定度 ur(1)4.1.1 样品处理过程的一致性，采用平行测定 10 次的结果进行评定，属于 A 类评定，按照实验方法对样品平行测定。结果如下：表 1 样品中维生素 A 含量平行测定 10 次的结果序号 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10（mg/100g）82.450 82.247 81.136 82.651 83.841 80.119 82.386 81.016 80.383 80.353（mg/100g）81.66维
14、生素 A 含量测定的标准偏差为：1.231S1= =1(i-)2-1 =标准不确定度: u (4.1.1)= = =0.3893nS 1.23110高效液相色谱法测定保健食品中维生素 A 含量的不确定度评定第 5 页 共 9 页相对标准不确定度为： = =0.4768%(1)=(4.1.1) 0.389381.66100%4.2 高效液相色谱仪所产生的不确定度 ur(2) 4.2.1 进样的重复性，液相色谱仪积分面积重复性，采用同一个样品重复进样 10 次, 以维生素 A 和芘的峰面积的比值来进行评定（n=10） 。属于 A 类评定。结果如下：表 2 同一个样品重复进样 10 次的结果序号 1
15、 2 3 4 5 6 7 8 9 10 1.2315 1.2283 1.2267 1.2256 1.2252 1.2184 1.2174 1.2110 1.2116 1.2109 1.221维生素 A 和芘的峰面积比值的标准偏差为： 0.0077732= =1(i-)2-1 =标准不确定度: u (4.2.1)= = =0.0024592 0.00777310相对标准不确定度为：u r(2) = = =0.2014%yu)1.24( 0.0024591.221100%4.3 样品称量所产生的不确定度 ur(3)4.3.1 使用 XP-205 分析天平进行称量，天平的校准证书给出的测量结果示值误
16、差的扩展不确定度 U=0.06mg，k=2，属正态分布，样品的称样量 m=105.77mg，则有：标准不确定度为： (4.3.1)=0.062=0.03相对标准不确定度为：u r(3)= 0.03105.77100%=0.02837%4.4 样品定容体积引入的不确定度 ur(4)4.4.1 样品定容过程只用到 25mL 的容量瓶，由 25mL 容量瓶的校准证书可知，这些容量瓶都属于 A 级，测量结果的扩展不确定度 U=0.01mL，k2，属于正态分布，则有：标准不确定度为：u (4.4.1) = 0.005mLkU 0.012相对标准不确定度为：u r(4.4.1)= =0.02000% 0.
17、00525100%4.4.2 由于本实验室温度在 205的范围内波动，假设温度变化为 5，该温度引起的不确定度可通过估算温度范围和体积膨胀系数计算，液体的体积膨胀明显大于容量瓶的体积膨胀，故只考虑前者即可。设温度为矩形分布，换算系数为 ，水的膨胀系数3高效液相色谱法测定保健食品中维生素 A 含量的不确定度评定第 6 页 共 9 页为/，则有：相对标准不确定度为： ur(4.4.2)=5 100%0.06063%2.110-42.1103 -44.4.3 样品溶液中内标溶液的加入只用到 3mL 的单标线吸量管，由校准证书可知，实验中所用的 3mL 单标线吸量管，属于 A 级，测量结果的扩展不确定
18、度 U=0.002mL， k=2，属于正态分布，则有：标准不确定度为：u (4.4.3)= = =0.001mLkU 0.0022相对标准不确定度为：u r(4.4.3)= =0.03334% 0.0013 100%则，样品定容体积所引入的不确定度 ur(4)，为 ur(4.4.1)、u r(4.4.2)和 ur(4.4.3)的合成，即：(4)=(4.4.1)2+(4.4.2)2+(4.4.3)2=0.07203%4.5 标准溶液配制所引入的不确定度 ur(5)4.5.1 标准溶液配制过程中，需要用到 5 个 25mL 的容量瓶。参照 4.4.1 中相对标准不确定度的计算方法，则有：标准不确定
19、度为：u (4.5.1) = 0.005mLkU 0.012相对标准不确定度为：u r(4.5.1)=5 =0.1000 % 0.00525100%4.5.2 移取标准溶液所用的 5mL 刻度吸管，从校准证书可知，该 刻度吸管属于 A 级，吸量结果的示值误差为：01mL 为 0.010mL，15mL 皆为 0.014mL，按三角分布转化成标准不确定度。配制过程中，分别移取了 0.5mL、1mL、2mL、3mL、5mL。则5mL 刻度吸量管所产生的不确定度为 5 次移取标准溶液的标准不确定度的合成，即：ur(4.5.2)=(0.0100.56)2+(0.01016)2+(0.01426)2+(0
20、.01436)2+(0.01456)25 100%=0.4392%4.5.3 对照品溶液中内标溶液的加入所产生的相对标准不确定度，可参照 4.4.3，则有： 标准不确定度为： u(4.5.3)= = =0.001mLkU 0.0022相对标准不确定度为：u r(4.5.3)=5 =0.1667%0.0013 100%4.5.4 温度变化带来的体积不确定度，同 4.4.2，则有：u r(4.5.4） 0.06063%。标准溶液配制所引入的不确定度 ur(5)，为 ur(4.5.1)、u r(4.5.2)、u r(4.5.3)和 ur(4.5.4)的合成，即：(5)=(4.5.1)2+(4.5.2
21、)2+(4.5.3)2+(4.5.4)2=0.4842%4.6 标准溶液浓度校正时所引入的不确定度 ur(6):高效液相色谱法测定保健食品中维生素 A 含量的不确定度评定第 7 页 共 9 页4.6.1 用紫外分光光度计对标准溶液浓度进行校正，测得吸光度 A=0.4376；紫外分光光度计的校准证书给出的测量结果示值误差的扩展不确定度 U=0.005，k=2，属正态分布，则有： 标准不确定度为： u(4.6.1)= =kU0.0052 =0.0025相对标准不确定度为：u r(4.6.1)=0.00250.4376100%=0.5713%4.6.2 温度变化带来的体积不确定度，同 4.4.2，则
22、有：u r(4.6.2)0.06063%4.6.3 校正标准溶液浓度时所产生的不确定度分别为：4.6.3.1 1mL 单标移液管：由校准证书可知，实验中所用的 1mL 单标移液管，属于 A级，测量结果的扩展不确定度 U=0.002mL， k=2，属于正态分布，则有：标准不确定度为： u(4.6.3.1)= = =0.001mLkU 0.0022相对标准不确定度为：u r(4.6.3.1)= =0.1000%0.0011 100%4.6.3.2 50mL 容量瓶：由 50mL 单标线容量瓶的校准证书可知，实验中所用的 50mL单标线容量瓶，属于 A 级，测量结果的扩展不确定度 U=0.02mL，
23、 k2，属于正态分布，则有： 标准不确定度为：u (4.6.3.2) = 0.01mLkU 0.022相对标准不确定度为：u r(4.6.3.2)= =0.02000 % 0.0150100%所以该项的不确定度 ur(4.6.3)，为 ur(4.6.3.1)和 ur(4.6.3.2)的合成，即：(4.6.3)=(4.6.3.1)2+ (4.6.3.2)2=0.1020%则标准溶液浓度校正所引入的不确定度 ur(6)，为 ur(4.6.1)、u r(4.6.2)和 ur(4.6.3)的合成，即：(6)=(4.6.1)2+(4.6.2)2+(4.6.3)2=0.5835%4.7 合成标准不确定度评
24、定，将上述不确定度分量列表如下：表 3 相对标准不确定度一览表名称 不确定度来源 类型 相对标准不确定度值ur(1) 方法总重复性 A 0.4768%ur(2) 高效液相色谱仪 A 0.2014%ur(3) 样品称量 B 0.02837%ur(4) 样品定容体积 B 0.07203%高效液相色谱法测定保健食品中维生素 A 含量的不确定度评定第 8 页 共 9 页ur(5) 标准溶液配制 B 0.4842%ur(6) 标准溶液浓度校正 B 0.5835%合成标准不确定度: ()=(1)2+(2)2+(3)2+(4)2+(5)2+(6)2=0.9214%5.扩展不确定度评定扩展不确定度可由合成标准
25、不确定度乘以包含因子，取置信概率 p=95%,则 k=2，因此样品中的维生素 A 含量测定的扩展不确定度为： U=kur(x)=20.9214%=1.843%6.测量不确定度的结果与表示 不确定度结果：U (X)= 81.66 1.843%= 1.51 mg/100g样品中维生素 A 的含量：W= 81.661.51 mg/100g7.讨论从表 3 可以看出，维生素 A 含量测定的不确定度因素中，影响最大的是 标准溶液浓度校正、标准溶液配制和方法总重复性，影响最小的是高效液相色谱仪、样品定容体积和样品称量等产生的不确定度。因此提示在今后的含量检测过程中，要注意标准溶液浓度校正，要选用高校准级别
26、的容量瓶和单标移液管，还要对紫外分光光度计进行定期的检定与维护保养。而且要求分析人员熟练掌握样品的各项处理步骤，以提高检测准确性。【参考文献】1 黄敏,黄增琼.高效液相色谱法测定复合鱼肝油制剂中维生素 A 的含量J.广西医科大学学报,2007,24(3):600-6012 钱玲慧 ,廖佳宇,李亚妮,莫晓帆,马丽,姚彤炜.测定维生素 A 的三种方法比较J.实验技术与管理,2012,29(5):43-48.3 李东文 .HPLC 检测复合鱼肝油制剂中维生素 A 含量的可行性J. 河北医药,2013,35(12）:1986-1987.4 国家质量监督检验检疫总局.JJF1059.1-2012 测量不
27、确定度评定与表示 M.中国质检出版社,高效液相色谱法测定保健食品中维生素 A 含量的不确定度评定第 9 页 共 9 页2012:1-53.5 国家质量监督检验检疫总局.JJG196-2006 常用玻璃量器检定规程M.中国计量出版社,2006:1-22.6 苏佳妍,岳青阳,于大海.维生素 A 含量测定方法的研究J.山西医药杂志,2010,39(6):557-558.7 李剑虹 ,朴建华,郭宁,杨丽琛,董杰,杨晓光.儿童维生素 A 与铁营养状况的相关性研究J卫生研究,2006,35(2):182-184.8王颖,任永红.HPLC 测定食品中山梨酸结果的不确定度评定J 现代科学仪器,2008(3):40-42.9荆淑芹,孙媛媛,李景辉.高效液相色谱法测定尪痹胶囊中芍药苷含量的不确定度评定 J中国当代医药,2014,8(22):10-12.
