1、红豆杉活性成分巴卡亭对慢性阻塞性肺病模型大鼠气道重塑的影响可行性报告一、项目实施的背景和意义慢性阻塞性肺疾病（Chronic Obstructive Pulmonary Disease, COPD）是具有不完全可逆气流受限特征并呈进行性发展的肺部非特异性炎症性疾病。就世界水平而言，COPD居当前死亡原因的第四位，其发病率、致残率和死亡率近二十年居高不下，社会经济负担沉重，根据世界银行/世界卫生组织发表的研究结果，至 2020年COPD将跃至世界疾病经济负担的第五位，已经成为重要的公共卫生问题 【1】 。关于 COPD的发病机制学说，目前主要有：吸烟，慢性气道和肺部炎症形成、蛋白酶抗蛋白酶失衡、
2、以及氧化剂抗氧化剂失衡等。COPD 可累及气道、肺实质和肺血管，表现为出现以中性粒细胞、巨噬细胞、淋巴细胞浸润为主的慢性炎症反应。炎症细胞释放炎症介质与气道和肺实质的结构细胞相互作用，引起肺结构的破坏，从而加重 COPD肺部炎症和气流受限。慢性炎症导致气道壁损伤和修复过程反复发生，修复过程中发生气道壁结构重构，胶原含量增加及瘢痕组织形成，这些改变造成气道狭窄，引起固定性气道阻塞。其病理基础为气道壁和肺实质的慢性炎症及结构破坏，最终导致管腔狭窄、肺气肿形成和进行性气流阻力增加。这一过程称为气道重塑 【2】 。对于气道重塑是构成COPD气道阻塞和肺的弹性回缩力下降的主要原因，并且是 COPD患者病
3、情不断进展最终导致呼吸衰竭和肺源性心脏病的主要原因，在气流受限中扮演着重要角色的观点是一致的。COPD气道重塑在呼吸学界已得到公认，如何有效的阻止或缓解气道重塑的发生发展成为 COPD治疗的重要环节，而恰恰这正是目前治疗遇到的瓶颈。目前全球没有任何一种药物能阻止 COPD气道重塑的发生，大多的药物治疗仅仅局限在延缓气道重塑的进展速率，从而间接气道延缓其肺功能下降速率的作用。因此对于气道重塑的有效干预一直困扰着全球学者，并且治疗措施捉襟见肘，面对这一现实问题，课题组选择研究能有效阻止气道重塑或者气道重塑中某一关键环节的药物，对于寻找治疗 COPD稳定期有效治疗药物将会提供一个新的思路，同时可以进
4、一步完善 COPD患者气道重塑机制研究。为什么巴卡亭作为研究目标药物，主要是基于以下背景：目前，以紫杉醇为代表的抗增殖药物已经成为预防支架内再狭窄研究热点。而课题组之前的研究结果证实了紫杉醇脂质体能通过调节肺间质纤维化模型大鼠肺组织型前胶原蛋白、型前胶原蛋白含量，影响 TGF-1 蛋白含量，减少核转录因子 B （NF-B）释放，进而改善肺组织 ECM 过度沉积状态，从而防止纤维化的形成。巴卡亭与紫杉醇均为红豆杉活性成分，其结构与紫杉醇类似，且在红豆杉天然林木中含量比紫杉醇含量高，取材相对于紫杉醇便利，因此课题在前期研究的基础上进一步研究巴卡亭对于 COPD 气道重塑过程中气道平滑肌和胶原纤维的
5、形成是否存在一定抑制作用，可以为红豆杉树业资源的充分利用提供又一领域。二、项目涉及的相关技术在国内外的研究现状和发展趋势(一) 慢性阻塞性肺病气道重塑机制研究：有关 COPD病理发展过程中气道重塑的机制研究目前主要集中在气道慢性炎症、炎性介质及细胞因子对气道重塑调节机制等方面。1.炎症与气道重塑的关系流行病学资料表明，吸烟、有害粉尘、烟雾、感染是引起 COPD的主要危险因素，这些危险因素通过炎症细胞发挥炎症作用，而炎症细胞产生的各种炎症介质直接或间接的参与了气道的慢性损伤及不完全修复过程，导致气道重塑。普遍接受的观点是气道重塑是慢性反复炎症刺激引起炎症细胞和结构细胞之间的相互作用的结果，各种有
6、害颗粒或气体进入气道后首先引起气道上皮的炎症发生，反复发作的支气管粘膜炎症刺激各种生长因子、致纤维化因子等生物活性分子不断产生，导致病灶损伤和修复交替发生，互为因果，在此过程中纤维粘连蛋白（FN）对于促进上皮细胞和其它新生细胞附着，吸引巨噬细胞、纤维母细胞和血管内皮进入创伤区最终促进修复起着重要作用，损伤修复的恶性循环最终导致小气道纤维组织增生、细胞外基质（ECM）沉积、细支气管管壁增厚、管腔狭窄以及周围肺组织纤维化和瘢痕收缩，从而压迫或牵拉细支气管，加重管腔狭窄，致使气流受限不可逆。相关的主要炎症细胞有巨噬细胞、中性粒细胞、T 淋巴细胞等。巨噬细胞是 COPD的主要炎症细胞成分之。国外学者
7、Baraldo【3】 研究表明 COPD患者外周气道平滑肌上的中性粒细胞和 CD8+细胞均较正常人增多。各种引起 COPD的危险因素，可以导致肺内巨噬细胞(AM)增多、活化，产生多种细胞因子、酶类等活性物质参与气道炎症的反应与重建，故有学者认为 AM是气道局部炎症反应的始动细胞之一 【4】 。在炎症反应中，AM 通过吞噬异物和参与免疫调节发挥对肺的保护作用，又可以通过分泌细胞因子、蛋白酶和蛋白酶抑制剂参与肺的损伤过程 【5】 。2.炎性介质及细胞因子对气道重塑的调节炎症细胞分泌的炎症介质有白介素 8(IL-8)、肿瘤坏死因子 (TNF-)、血管内皮素 I(ET-1)等。这些介质能破坏肺的结构，
8、促进炎症反应，在气道炎症中发挥着重要作用 【6】 。COPD 炎症主要参与细胞肺泡巨噬细胞、中性粒细胞、CD 8T细胞、上皮细胞等以及其释放的炎症因子肿瘤坏死因子-（TNF-） 、白细胞介素-11（IL-11） 、白细胞介素-8（IL-8） 、转化生长因子- 1（TGF- 1）等对气道结构细胞均产生重要影响，并且这几种因子可以通过不同的机制促进彼此的表达。Istvan 等用免疫复合物激酶分析方法观察到 TGF- 1可增加成纤维细胞 NIH3T3的细胞外信号的调节蛋白激酶（ERK1）的活性，同时增加 GTP酶和 Ras的结合，显性失活的 ERK1和小 G蛋白 Ras能抑制 TGF- 1对纤溶酶原
9、激活物抑制剂-1(PAI-1)和型胶原增强子的上调作用并刺激 ECM的沉积 【7】 。IL-8是主要的炎症介质之一，主要由单核巨噬细胞产生，在一定条件下，也可由成纤维细胞、上皮细胞、肝细胞等产生。气道内 IL-8水平的增高，可趋化并激活中性粒细胞，使之发生形态改变，定向游走到反应部位，并释放一系列活性产物(例如中性粒细胞弹性蛋白酶)，导致机体局部炎症反应。中性粒细胞弹性蛋白酶的释放又能诱导气道上皮细胞的 IL-8基因的表达，引起 IL-8的进一步分泌，如此恶行循环，增强了炎症反应，引起气道慢性炎症和持续损伤，导致肺结构的破坏。IL-8 对中性粒细胞具有强大的趋化和激活作用，促进中性粒细胞呼吸爆
10、发、释放颗粒，释放髓过氧化物酶、弹性蛋白酶等，破坏气道和肺实质。研究证实吸烟、有毒颗粒和气体以及感染等因素能够导致氧化/抗氧化失衡和氧化应激，促进人支气管上皮细胞 16-HBE细胞以及巨噬细胞表达 IL-8，上调气道和肺部的炎症反应 【8,9】 。 李国保等研究显示 COPD急性加重期 IL-8、中性粒细胞较稳定期升高，稳定期高于健康人，并且中性粒细胞、IL-8 分别与 FEV1负相关、功能性呼吸困难分级正相关 【10】 。（二）COPD 气道重塑的治疗：当前公认的治疗药物以及处于研究中的药物主要集中在以下方面。1.糖皮质激素：COPD 长期应用激素治疗 COPD一直存在着较大争议。慢性阻塞性
11、肺疾病全球倡议总结了几个多中心随机临床对照试验，结果显示长期应用吸入激素虽然不能明显改善肺功能的恶化状况，但可以减轻临床症状，减少发作次数，提高生活质量，尤其是中、重度老年患者。GIZYCKIM 等 【11】 研究 14例 COPD患者，使用氟替卡松 3个月后，经纤维支气管镜活组织检查发现其支气管上皮下肥大细胞数明显减少。目前对于激素治疗后 COPD患者的气道和肺的病理改变尚无定论。2. 肾上腺受体激动剂:体外实验发现，可以抑制多种平滑肌细胞和成纤维细胞的增殖，并且抑制平滑肌细胞、肥大细胞、单核细胞、淋巴细胞和炎性介质的释放，减少血浆蛋白的渗出，显示一定的抗炎效果，并且抑制气道重塑。3.TGF
12、-l 抗体：可抑制胶原酶等降解细胞外基质的酶类合成，以减少胶原等的降解。同时，TGF-l 还可促进基质金属蛋白酶内源性抑制剂合成，致使成纤维细胞合成多种细胞外基质。因此，TGF-l 在调节细胞增殖、分化、细胞外基质形成及组织重塑方面起重要作用。李红梅等的实验结果表明，TFG-l 单抗组气道壁胶原沉积、上皮层及平滑肌层截面积较模型组显著减少，炎细胞减少，表明该抗体可减轻气道壁的纤维化和平滑肌增生 【12】 。4.其他治疗药物：如 N-乙酰半胱氨酸、羟甲基戊二酸单酰辅酶 A还原酶抑制剂、中医中药、基因治疗等，至今未广泛应用于临床。紫杉醇为红豆杉提取物，它具有独特的抗癌机理，研究证明主要通过作用于细
13、胞骨架中的微管/微管蛋白系统，促进微蛋白装配成微管，而又抑制微管的解聚，从而导致肿瘤细胞微管排列异常，纺锤体失去正常功能，致使细胞死亡。近年来有研究表明，紫杉醇可以抑制成纤维细胞的增殖，以紫杉醇为代表的抗增殖药物已经成为预防支架内再狭窄研究热点。研究组之前的研究结果证实了紫杉醇脂质体能通过调节肺间质纤维化模型大鼠肺组织型前胶原蛋白、型前胶原蛋白含量，影响 TGF-1 蛋白含量，减少核转录因子 B（NF-B）释放，进而改善肺组织 ECM过度沉积状态，从而防止纤维化的形成。巴卡亭与紫杉醇同为红豆杉的活性成分，其结构与紫杉醇类似，且在红豆杉天然林木中巴卡亭(DAB)含量比紫杉醇含量高，人工林木中它的
14、平均含量也接近天然林木，达到 0.034%之多 【13】 。这就提示我们巴卡亭可能对于 COPD气道重塑过程中气道平滑肌和胶原纤维的形成起到抑制作用，对于增殖的肺组织中的肺巨噬细胞中的微管系统也可能产生作用。目前，有关巴卡亭对 COPD气道重塑的抑制作用研究甚少，因此，我们试图通过建立 SD大鼠 COPD模型，检测血清中及肺泡灌洗液（BALF）中 IL-8、TGF- 1进行参数分析来比较观察不同剂量巴卡亭对 COPD大鼠气道重塑的抑制作用，同时更进一步揭示 COPD气道重塑的内在机制。之所以选择 IL-8、TGF-1 作为研究靶点是因为这些因子在 COPD患者气道炎症及气道重塑过程中起着至关重
15、要的作用，同时与正常组织相比，COPD 患者体液、气道壁及重塑肺组织中这些因子的含量差异有意义。随着研究的深入，目前已知 TGF-1 是与瘢痕形成关系最密切、最具代表性的生长因子 【14】 。Vignola 等研究了正常人、哮喘患者及慢性支气管炎患者支气管黏膜活检标本表达的 TGF-1，发现在哮喘和慢性支气管炎患者表达的 TGF-1 较健康对照组显著增多。研究表明 COPD患者诱导痰细胞总数及中性粒细胞比例均增高，诱导痰 IL-8水平增高 【15】 。IL-8 作为中性粒细胞的主要趋化因子，与其细胞表面特异性受体结合，诱导中性粒细胞形态改变、趋化、细胞内游离钙浓度一过性升高、颗粒内含物的释放
16、【16】 、生物活性物质形成及呼吸爆发产生大量氧自由基，促进炎症反应，如多种促炎细胞因子如 NF-B、IL-8、TNF-、NO 诱导酶等造成了组织的进一步破坏，而中性粒细胞本身又是 lL-8的重要来源，这样就形成了闭环刺激，从而使 COPD急性加重期中性粒细胞和 IL-8同时升高。目前关于 COPD发病机理的研究在不断完善，治疗方面对于 COPD急性加重期的治疗有明显的优势，然而 COPD患者在急性发作期后临床症状虽有所缓解，但其肺功能仍在继续恶化，并且进行性加重，而临床上对 COPD稳定期仍缺乏有效的、副作用少的干预措施。因此寻找 COPD稳定期有效治疗药物为当务之急。目前国内外针对巴卡亭对
17、慢性阻塞性肺病的防治作用研究很少，我们从紫杉醇的特殊的抗癌机理及从紫杉醇的半合成方法中受到启示，巴卡亭与紫杉醇同为红豆杉中的活性成分，而且结构相似，并且巴卡亭在红豆杉中的含量丰富，研究红豆杉活性成分巴卡亭对慢性阻塞性肺疾病气道重塑的抑制作用对于寻找治疗 COPD稳定期有效治疗药物将会提供一个新的思路，同时可以进一步完善 COPD患者气道重塑机制研究，使得本研究途径兼具治疗上的特异性、安全性和有效性，同时为红豆杉树业资源的充分利用提供又一领域。参考文献：【1】Global Strategy for the Diagnosis, Management and Prevention of Chron
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24、n-8 in BAL fliud from smokers susceptible to pulmonary emphysema J.Thorax,2002,57(5):405-411三、研究开发的主要内容、关键技术及创新点（一）主要内容1. 采用气管内滴入脂多糖和被动吸烟的方法进行COPD模型建立，并进行实验动物的分组。2.制作大鼠肺组织的病理切片，进行各组模型大鼠肺组织的病理学及切片观察，比较不同用药组对大鼠肺组织及其超微结构的影响。3.按照2002年中华医学呼吸病学分会制定的BALF细胞学检测技术规范操作进行SD大鼠肺泡灌洗液的采集及细胞计数分类。4.进行不同动物分组中实验大鼠肺组织中T
25、GF-1表达的免疫组化检测，并采用统计软件对数据进行比较。5.进行不同动物分组中实验大鼠血清免疫组化检测IL-8含量测定，采用统计软件对数据进行比较。（二）关键技术1.慢性阻塞性肺病动物模型的建立以及成功建立的评估。2.SD大鼠肺泡灌洗液的采集以及 BALF细胞计数及分类。3.SD大鼠肺组织 TGF-1表达测定。4.SD大鼠血清及肺泡灌洗液中 IL-8表达测定。（三）创新点研究组从紫杉醇特殊的抗肿瘤特性中受到启示并在前期研究紫杉醇脂质体抑制肺纤维化作用机制的基础上，探讨红豆杉活性成分巴卡亭对慢性阻塞性肺病气道重塑的影响及其机制，从而为进一步寻找治疗慢性阻塞性肺病的有效途径提供实验依据。创新之处
26、在于首次将红豆杉活动成分巴卡亭应用于慢性阻塞性肺病气道重塑研究中。四、预期目标（包括主要技术、经济指标和经济社会效益，知识产权目标、科研成果和发表论文等）1.通过建立大鼠 COPD模型并进行巴卡亭药物干预，发现该药物不仅可以改善慢性非特异性气道炎症的程度，更重要的是通过抑制在气道重塑中起重要作用的细胞因子的表达而达到抑制 COPD稳定期气道重塑的作用，探讨红豆杉活性成分巴卡亭对气道重塑抑制的机制及其可能的细胞内信号转导机制，为进一步寻找治疗 COPD稳定期的有效途径及新药的开发奠定必要的理论基础，使得巴卡亭药物走向临床应用。2.目前南方红豆杉枝叶在提取少量紫杉醇等萜类物质后往往被废弃，这不仅不
27、利于资源的综合利用，而且还会造成资源浪费和环境污染。本项目研究药物巴卡亭为红豆杉中有效成分，达到预期研究目标后，不仅可拓宽南方红豆杉资源的应用范畴，而且对南方红豆杉的综合利用及环境保护都具有积极的促进作用。也必将对本省的红豆杉种植事业的可持续发展产生积极的影响，与我国政府大力提倡的低碳经济的方向相符合。3.发表核心期刊论文 2篇，申请国家专利 1项。五、研究方案、技术路线、 组织方式与项目组成员分工（一）研究方案1.实验方法1.1实验动物和药品:SD大鼠,雄性,体重(20020)g,100 只,清洁级,购于中科院上海动物研究所。巴卡亭 购于四川维克奇生物科技有限公司。1.2 具体步骤：（1）1
28、00 只 SD大鼠随机抽取 80只进行模型建立，造模后随机分为 4组，余 20只未造模 SD大鼠设为阴性对照组。分别称重。COPD模型建立：对各组大鼠采用气管内滴入脂多糖和被动吸烟的方法进行造模。第一组（阴性对照组，P 组）：30 天后灌胃生理盐水 20ml/kg，每日一次，连续 28天。第二组（阳性对照组，N 组）：30 天后灌胃强的松片水溶液 4mg/kg，每日一次，连续 28天。第三组（低剂量巴卡亭 干预组，LBAD 组）：30 天后以低剂量的巴卡亭 提取液灌胃，每日一次，连续 28天。第四组（中剂量巴卡亭 干预组，MBAD 组）：30 天后以中浓度的巴卡亭 提取液灌胃，浓度是 LBAD
29、的两倍，每日一次，连续 28天。第五组（高剂量巴卡亭 干预组，HBAD 组）：30 天后以高浓度的巴卡亭 提取液灌胃，浓度是 LBAD的四倍，每日一次，连续 28天。以上五组均在实验的第 60天采用颈静脉取血后行颈动脉放血处死，分离出气管和肺，左下肺用手术线结扎，余肺行支气管肺泡灌洗。进行肺泡灌洗后随机选取各组大鼠，取右肺拍照后至于 10中性福尔马林溶液中浸泡固定，经脱水，石蜡包埋切片，按常规程序行 HE染色，进行病理组织学分析。1.3 BALF细胞计数及分类：严格按照 2002年中华医学呼吸病学分会制定的 BALF细胞学检测技术规范操作。1.4 左下肺组织匀浆进行 TGF-1的测定：采用免疫
30、组化法对 TGF-1表达进行测定。1.5 血清及肺泡灌洗液中IL-8表达测定：采用ELISA法测定血清及肺泡灌洗液中IL-8含量，严格按试剂盒说明书进行操作。1.6统计学分析应用SPASS17.0软件包，实验数据用均数 标准差(xs) 表示 , 两组间比较采用t 检验，多组间比较用进行方差分析及Spearman等级相关分析结果，组间两样本均数的比较行q检验。（二）技术路线阳性对照组（20 只）（20 只）SD 大鼠100只灌胃生理盐水 20ml/kg阴性对照组（20 只）（20 只）采用气管内滴入脂多糖和被动吸烟的方法进行COPD 模型建立巴卡亭 治疗组（3 个剂量组，各20 只强的松片水溶液
31、 4mg/kg分别给予高、中、低剂量的巴卡亭提取液60 天后取血后处死，肺泡灌洗，支气管肺组织标本留取，进行病理组织学分析、组织 TGF-1表达测定、血清及肺泡灌洗液 IL-8 含量测定。（三）组织方式与项目组成员分工姓 名（签名）性 别年 龄专业技术职务、职称 专 业在本项目中的分工实验动物证书号成员 1成员 2成员 3成员 4男女女女31304139主治医师主治医师副主任医师副主任医师呼吸内科内科学呼吸内科呼吸内科总体设计与实施生化检测数据统计与分析动物实验22-00797922-006057成员 5成员 6成员 7成员 8女女女女37473045副主任医师副主任护师主管药师副主任医师呼吸
32、内科护理学药理学临床医学药效实验生化检测动物实验组织病理22-0060630606005六、计划进度安排（一）2012.04.302012.07.31 完成实验的前期工作，所需动物及试剂购买、配制。（二）2012.08.012013.02.28 完成动物预实验和分组实验，完成动物实验，并进行大鼠肺组织、血清、肺泡灌洗液标本的留取。（三）2013.03.012013.07.31 进行支气管肺组织中 TGF-1 表达测定及血清、肺泡灌洗液 IL-8含量的测定。（四）2013.08.012014.04.30 分析实验结果，完成相关论文的撰写，发表核心期刊论文 2篇，申请国家专利 1项。七、现有工作基
33、础和条件（一）前期的研究基础以及项目所需工作条件：1.申请人长期从事呼吸病、危重病和感染病的临床和科研工作，通过临床经验积累，现已对慢性阻塞性肺病气道重塑的发病原因和治疗方法有较为深入的研究，目前课题组已发现红豆杉中紫杉醇对肺间质纤维化模型大鼠的 TGF-1 表达和 NF-B 活性的具有影响作用，研究结果表明紫杉醇脂质体可以减轻博莱霉素 A5所致的大鼠肺间质纤维化早期肺泡炎症细胞的渗出，抑制肺泡炎症反应。并通过调节肺纤维化形成过程中的型前胶原蛋白和型前胶原蛋白含量、改善细胞外基质异常沉积状态、抑制肺损伤组织过度修复，从而减轻博莱霉素 A5所致的大鼠肺组织纤维化。以下为光学显微镜组织观察部分结果：
