1、1江苏科技大学大型仪器设备申购论证报告设备名称：激光共聚焦显微镜系统申购部门：蚕业研究所负 责 人：沈兴家、黄金山日 期：2012.102激光共聚焦显微镜系统论证报告一、设备购置的背景2001 年以来，在学校的正确领导和有关部门的大力支持下，蚕研所仪器设备得到了很大的改善和提高，促进了蚕研所科学研究和技术开发的进步，蚕桑功能基因的定位克隆、基因表达调控机理、胚胎形成与发育、蚕桑病原微生物分子生物学研究和生物技术开发等研究不断深入；发表论文的数量和质量明显提高，SCI收录论文由原来的每年 2-4 篇提高到 8-10 篇；研究生招生规模成倍增长，博士、硕士研究生达到 40 名/年，新增 5 个生物
2、学二级学科；人才培养质量进一步提高，每年均有校优秀毕业生和优秀毕业论文获得者。在后基因组时代，基因功能研究显得尤为重要，而细胞生物学以及发育生物学是研究基因功能的重要组成技术手段，也是基因功能研究验证必不可少的过程；同时病理学研究中该设备也是一个重要的研究手段。近年来，蚕研所在蚕桑功能基因、发育生物学以及病理学研究等方面取得了较大进展，但是由于受设备条件的限制，在细胞生物学研究方面只做到目的蛋白表达，不能对其进行精确定位。后基因组时代更关注蛋白昆虫生长发育中的作用机理、蛋白之间的相互作用等等。目前这方面的研究，由于设备的短缺只能在外单位开展，但由于实验样品的处理以及荧光时效性的限制导致实验不能
3、顺利开展。蚕研所在原有特种动物科学博士生、特种动物科学和生物化学与分子生物学硕士生、农业推广硕士生培养的基础上，今年开始拓展了 5 个生物学二级学科的硕士生培养工作。很多研究生的学位论文课题涉及分子生物学和细胞生物学研究。另一方面，蚕研所承担国家级科研项目，包括国家 973、863、国家自然科学基金等，都需要开展细胞生物学等基础性研究。因此，急需要购置一个激光共聚焦显微镜系统。二、设备购置的意义和必要性1 意义激光共聚焦显微镜的购置，是蚕桑及生物学研究生科研平台和专业能力实践基地建设项目的重要内容。激光共聚焦显微镜在细胞生物学、蛋白质相互作用等3研究方面有独特的优势。它的购置必将进一步改善我校
4、生命科学方面博士、硕士研究生培养质量，拓展生命科学研究领域，有利于保持和强化蚕究所作为蚕业科技国家队的地位与作用，提升我校基础研究和应用基础研究的科研水平，增强科研竞争力。2 必要性与传统光学显微镜相比，激光共聚焦显微镜具有更高的分辨率，实现多重荧光的同时观察并可形成清晰的三维图像等优点，在对生物样品的观察中，激光共聚焦显微镜有如下优越性。（1）对活细胞和组织或细胞切片进行连续扫描，可获得精细的细胞骨架、染色体、细胞器和细胞膜系统的三维图像。（2）可以得到比普通荧光显微镜更高对比度、高解析度图像、同时具有高灵敏度、杰出样品保护。（3）多维图像的获得，如 7 维图像（XYZaIt）：xyt 、x
5、zt 和 xt 扫描，时间序列扫描旋转扫描、区域扫描、光谱扫描、同时方便进行图像处理。 （4）细胞内离子荧光标记，单标记或多标记，检测细胞内如 PH 和钠、钙、镁等离子浓度的比率测定及动态变化。（5）荧光标记探头标记的活细胞或切片标本的活细胞生物物质，膜标记、免疫物质、免疫反应、受体或配体，核酸等观察；可以在同一张样品上进行同时多重物质标记，同时观察； （6）对细胞检测无损伤、精确、准确、可靠和优良重复性；数据图像可及时输出或长期储存。（7）在细胞内水平分析验证不同蛋白质间的相互作用。 激光共聚焦显微镜是开展细胞生物学和分子生物学结合研究的重要工具。目前，全国拥有这类仪器的主要是生命科学研究单
6、位以及生物制品公司，用于活细胞组织或生理病理切片等观察研究。我校蚕研所和农业部重点实验室是国内较早开展家蚕细胞生物学以及分子生物学研究的单位，在家蚕遗传发育和生理病理等方面取得较好成绩，积极推动蚕桑业的发展。目前，家蚕研究已经进入后基因组时代，需要从细胞水平、蛋白水平研究家蚕基因功能，这就需要精密的仪器对蛋白进行实时定位观察，以及昆虫的活体三维观察，由于该方面仪器设备的不足，使得蚕研所在家蚕功能基因研究4方面受到限制，影响了蚕研所在该领域的发展以及地位。国内蚕桑科研单位多数已经配有该仪器，所以该仪器的购置和使用，对提升我校特别是蚕研所和农业部重点实验室的设备条件、增强科技开发能力等，提高研究生
7、培养质量，推进蚕研所在家蚕功能基因、遗传发育以及生理病理等方面研究，具有重要的作用。三、可行性分析1 前期工作基础蚕研所与中科院上海生化所合作，在国内最早建立家蚕 BmNPV 表达系统，利用该系统成功表达十多个外源蛋白。同时，利用该系统开展病毒的功能基因研究，取得重要成果。蚕研所在细胞生物学研究方面有较好的研究基础，近年与中科院武汉病毒所合作，利用该系统成功对病毒的蛋白进行了定位分析，明确 Bm21蛋白定位于细胞核内，Bm126 蛋白定位于细胞质中并可能与内质网共定位。蚕研所在该领域先后承担国家“863” 、国家自然科学基金和江苏省高技术等项目以及多个横向合作项目。目前正在开展家蚕功能基因组、
8、家蚕发育生物学、家蚕病原学和桑树的抗逆性研究等，急需要购置和利用激光共聚焦显微系统。2 国内外相关研究进展激光共聚焦显微镜是采用激光作为光源，在传统光学显微镜基础上采用共轭聚焦原理和装置，并利用计算机对所观察的对象进行数字图象处理的一套集观察、分析和输出于一体的系统。把光学成像的分辨率提高了30%40%，使用紫外或可见光激发荧光探针，从而得到细胞或组织内部微细结构的荧光图像，在亚细胞水平上观察生理信号及细胞形态的变化，从而对活的或固定的细胞及组织进行无损伤的系列“光学切片”(Optical sectioning)，得到各个层面的信息，这种功能也被称为“细胞CT”或“显微CT” ，成为形态学，分
9、子生物学，神经科学，药理学，遗传学等领域中新一代的研究工具。目前国内外主要用该系统开展以下的研究。（1）观察活细胞、活组织。在不损伤细胞的前提下, 对活组织、活细胞进行观察和测量，这不仅省去了繁琐的样品前期处理过程(如脱水、脱蜡、染色等)；而且观察过的样品还可以继续用于其他的研究，这种功能对于细胞培养、转基因研究尤为重要，是激光共聚焦显微镜最大的优势。（2）生化成分精确定位观察。配合专用的分子探针，对于要检测的成分不仅可以定位到细胞水平，还可以定位到亚细胞水平和分子水平。5（3）动态观察。在同一样品平面上随时间进行连续扫描，就可分析细胞结构、内含和标记物等动力学变化。利用Flu-3、Indo-
10、1、Fura-Red等多种荧光探针，激光共聚焦显微镜能完成活细胞生理信号的动态监测，可对单个细胞内各种离子（Ca 2+、K +、 Na+、Mg 2+和 pH）的比例及动态变化作毫秒级实时定量分析；可以定量探测胞质中Ca 2+对肿瘤启动因子、化学因子、生长因子及各种激素等刺激反应；使用荧光探针Flu-3和SNARF 可同时测定Ca 2+和pH 值。（4）细胞结构、受体、蛋白质、酶等研究。激光共聚焦显微镜可获得较一般普通光学显微镜分辨率高的细胞内线粒体、高尔基复合体、内质网、溶酶体等细胞器图象，同时还可动态观察活细胞状态下细胞器的形态学变化情况，此外还可通过光学切片即断层扫描技术进行三维重建，显示
11、细胞器的空间关系及其变化。（5）细胞间通讯分析。激光共聚焦显微镜通过测量细胞缝隙连接介导的分子转移，观察相邻细胞之间的胞间通讯。用于研究肿瘤启动子、生长因子以及细胞内Ca 2+ 、pH 和cAMP对缝隙连接和胞间通讯的影响。激光共聚焦显微镜可采用荧光光漂白恢复FRAP技术检测细胞缝隙连接通讯，可用于研究胚胎发生、生殖发育、神经生物学、肿瘤发生等过程中缝隙连接通讯的基本机制和作用。 （6）细胞膜流动性研究。采用荧光光漂白恢复（FRAP）技术还可对细胞膜流动性进行研究，利用NBD-C6-HPC荧光探针标记细胞膜磷脂，然后用高强度的激光束照射活细胞膜表面的某一区域（12m），使该区域的荧光淬灭或漂白
12、，再用较弱的激光束照射该区域，可检测到细胞膜上其它地方未被漂白的荧光探针流动到漂白区域时的荧光重新分布情况。（7）三图像重建。激光共聚焦显微镜通过薄层光学切片功能，可获得真正意义上的三维数据，经过计算机图像处理及三维重建软件，沿X 、Y 和Z轴或其它任意角度来观察标本的外形及剖面，并得到三维的立体结构，从而能十分灵活、直观地进行形态观察，并揭示亚细胞结构的空间关系。（8）细胞物理和生物化学测定。激光共聚焦显微镜可进行低光探测、活细胞定量分析和重复极佳的荧光定量分析，从而能对单细胞或细胞群的溶酶体、线粒体、内质网、细胞骨架、结构性蛋白质、DNA、RNA 、酶和受体分子等细胞特异结构的含量、组份及
13、分布进行定性、定量、定时及定位测定；同时还可测定分子扩散、膜电位、氧化还原状态和配体结合等生化反应变化程度。另外，还可以对细胞的面积、平均荧光强度、积分荧光强度、细胞周长、形状因子及细胞内颗6粒数等参数进行自动测定。（9）荧光的定量、定位分析。激光共聚焦显微镜可对单标记或双标记细胞及组织标本的共聚焦荧光进行定量分析，并显示荧光沿Z轴的强度变化；同时还可自动将荧光图像与象差图像重叠以显示荧光在形态结构上的精确定位。还可测量标本深层的荧光分布。也适用于高灵敏度的快速荧光测定，准确地监测抗原表达、荧光原位杂交斑点及细胞结合和杀伤的形态学特性，并作定量分析。（10）荧光能量共振转移（FRET）技术：F
14、RET 是 指 在 两 个 不 同 的 荧 光 基团 中 ， 如 果 一 个 荧 光 基 团 （ 供 体 Donor） 的 发 射 光 谱 与 另 一 个 基 团 荧 光 共 振能 量 转 移 团 （ 受 体 Acceptor） 的 吸 收 光 谱 有 一 定 的 重 叠 ， 当 这 两 个 荧 光 基 团间 的 距 离 合 适 时 （ 一 般 小 于 100A0） ， 就 可 观 察 到 荧 光 能 量 由 供 体 向 受 体 转 移的 现 象 。 此 过 程 没 有 光 子 的 参 与 ， 所 以 是 非 辐 射 的 。 如 果 受 体 荧 光 量 子 产 率 为零 ， 则 发 生 能 量
15、 转 移 荧 光 熄 灭 ； 如 果 受 体 也 是 一 种 荧 光 发 射 体 ， 则 呈 现 出 受体 的 荧 光 ， 并 造 成 次 级 荧 光 光 谱 的 红 移 ， 从 而 可 以 计 算 出 不 同 分 子 间 的 距 离 ，确 定 是 否 发 生 相 互 作 用 。激光共聚焦显微镜也在家蚕研究中得到广泛应用，主要是家蚕功能基因的研究，如类 kinesin 蛋白在家蚕后部丝腺中定位，BRCA1 与 BARD1 的互作分析，DOPI 蛋白复合体在后部丝腺的定位于 ER 内等等，还有家蚕激素在咽侧体等组织中的定位等，以及不同时期家蚕神经节的发育变化等，激光共聚焦显微镜为这些研究提供了极
16、为便利的操作平台。我国是养蚕业的发祥地，具有悠久的养蚕历史和丰富的家蚕品种资源；也是当今世界的蚕丝业的第一生产大国，蚕茧和生丝产量约占世界总产量的70%左右，而我们为国家级研究所，目前正开展家蚕功能基因研究，但由于没有激光共聚焦显微镜，许多细胞生物学的实验不能开展。所以该设备的购置有助于加强我所的科研能力，为家蚕品种的遗传改良提供理论基础。3人员队伍蚕研所现有科技人员 67 名，拥有博士学位人员占 48%，硕士以上学位人员占75%，正高职称人员占 22%，副高以上人员占 67%。目前从事蚕桑分子生物学研究的中高级研究人员有 30 余名，从细胞生物学、发育生物学、分子生物学等研究人员（表 1）
17、。而且，每年招收的生命科学博士、7硕士研究生已达到 40 余名，其中很研究生的课题涉及细胞生物学以及分子生物学。因此，激光共聚焦显微系统的功能将在研究生教学、科学研究中得到很好的发挥。表 1 蚕研所从事细胞生物学和分子生物学研究的主要科技人员姓 名 出生 学位 职称 相关研究内容郭锡杰 195904 博士 研究员 家蚕病毒分子生物学沈中元 196201 硕士 研究员 家蚕分子病理学唐旭东 197911 博士 助理研究员 家蚕分子病理学张国政 196110 博士 研究员 家蚕功能基因组学韦亚东 196908 博士 副研究员 发育生物学沈兴家 196302 博士 研究员 家蚕功能基因组学唐顺明 1
18、97111 博士 副研究员 家蚕转基因汪生鹏 197103 博士 副研究员 家蚕功能基因组学黄金山 197212 博士 副研究员 家蚕及杆状病毒功能基因易咏竹 196207 学士 副研究员 家蚕生物反应器郝碧芳 197409 博士 助理研究员 BmNPV 分子生物学赵巧玲 196409 博士 研究员 家蚕遗传育种与分子生物学李木旺 197208 博士 研究员 家蚕功能基因定位克隆与分子育种徐安英 195801 学士 研究员 家蚕遗传育种与基因功能裘智勇 197102 博士 副研究员 家蚕遗传学与分子生物学夏定国 196712 硕士 副研究员 家蚕功能基因组学程嘉翎 195708 学士 研究员
19、桑树生理学吴福安 196109 博士 研究员 桑树病理学赵卫国 196610 博士 研究员 桑树基因功能刘 利 197301 博士 副研究员 桑树遗传育种潘 刚 197108 博士 副研究员 桑树遗传转化8四、性能参数和设备选型1设备的构成本套设备由激光器部分，扫描器部分，显微镜以及软件四部分构成。2. 主要技术参数及配置（*为必须满足的参数）*2.1 激光器：覆盖可见光波长范围的固体激光器，各激光器单独分立。 405nm/488nm/555nm/635nm 2.2 扫描器部分2.2.1 光学部分2.2.1.1 扫描器（含检测器）与显微镜直接连接（非光纤连接） ，一体化设计，一体化像差及色差校
20、正。2.2.1.2 多个荧光检测通道，一个透射光检测通道。2.2.2 扫描系统*2.2.2.1 自动预扫描 *2.2.2.2 扫描速度 ：512512 分辨率 5幀/秒*2.2.2.3 扫描分辨率 ：2048X2048 像数点2.2.2.4 最小变倍：0.5 ，步进 0.1。2.2.2.5 16 位、12 位和 8 位 A/D 转换的动态范围。*2.2.2.6 共聚焦扫描视野 18 毫米2.2.2.8 光谱分辨率最高为 1nm 2.2.3 计算机工作站 CPU( P4) 3.2G；内存 4GB；液晶显示屏（ 30 英寸） ；双高速硬盘，一个硬盘160G，一个硬盘 500G, DVD 刻录；总的
21、像素25601024 pixels；网卡 10/100/1000M，Windows 7 专业版；计算机工作站标准配置。*2.2.4 全电动倒置万能显微镜2.2.4.1 显微镜内置电动调焦驱动马达。2.2.4.2 汞灯光源：外置式长荧光寿命（2000h）光源。92.2.4.3 六位电动滤色镜转盘，含 UV、B、G 激发滤色镜组件。*2.2.4.4 物镜：物镜：针对共聚焦显微镜应用优化的高分辨率、高透过率荧光、DIC 物镜 10/20/ 40/632.2.4.5 电动载物台2.2.4.6 卤素灯（12v） 100w*2.2.4.7 目镜一对：10，视场数23*2.2.4.8 全套微分干涉（DIC）
22、附件，有与不同数值孔径的物镜一一对应的 DIC棱镜电动 DIC2.2.4.9 防震显微镜台2.2.5 软件：2.2.5.1 智能化系统设置：根据不同应用要求，软件可”一键设置” 自动设置整个光路，无需手动设定。2.2.5.2 扫描过程中实时计算和显示比率（ratio）图像。2.2.5.3 可以线或帧方式进行多次扫描的平均和累加。2.2.5.4 折射率校正功能，校正折射率不同对三维扫描的影响，保证空间定位的精确，共定位分析功能。2.2.5.5 具有图形化的感兴趣区域荧光强度平均值分析，实时或在扫描完成后显示和计算离子浓度。2.2.5.6 具有直方图（Histogram）分析工具，可测量直线和任意
23、形状曲线的荧光强度分布，可测量长度、角度、面积、荧光强度。2.2.5.7 图像运算功能，包括加、减、乘、除、比率（ratio） 、移位、滤镜。2.2.5.8 免费图像浏览软件，可用于共聚焦系统以外的任意计算机，以便于浏览、输出共聚焦图像。2.2.5.9 荧光漂白，FRAT 分析3. 设备选型为了更好地了解不同厂家生产的激光共聚焦设备的性能，我们先后与蔡氏公司、徕卡公司、尼康公司和奥林巴斯等多家公司或其供应商交谈，并通过电话、电子邮件等从北京大学、南京农业大学、模式动物研究所、南京医科大学、扬州10大学、江苏大学、南通大学等了解激光共聚焦设备性能及使用情况。尼康和奥林巴斯为日本产品，虽然价格上有
24、一定优势，但突出的问题是用户反映产品稳定性不好，激光器质量较差，而且该产品为 2006 年出的产品，技术上已经明显落后，所以根据产品性能初步选定蔡氏公司和徕卡公司的产品。蔡氏公司和徕卡公司为世界上生产该类仪器的著名德国公司。蔡氏公司的产品有 LSM700/710/780，徕卡公司目前主推的是 Leica TCS SP5/8, 这两个公司的产品是细胞生物学研究的理想设备，绝大部分外科研院及生物公司都使用他们的产品，目前江苏地区蔡氏用户有 26 家，徕卡用户有 28 家。蔡氏公司推荐 LSM700是其一款中低端设备，保留该系列的优点，去除一些复杂的配置，能满足一些不同用户的需要，而徕卡公司的 Le
25、ica TCS SP5/8 与蔡司的 710 相似的高端机型。为了进一步调研这两家产品，我们制备了一种家蚕细胞样品，利用 3 种染色材料对其进行处理，先后对蔡氏 LSM700/710、Leica TCS SP5 和 SP8 产品进行自制样品观察和实地观摩，根据成像效果以及操作等具体进行了分析比较。通过比较发现蔡氏 LSM700 一个较大的问题是视野范围小，所获得图像四周明显较黑，这样就会失去一部分数据，这个是由系统的扫描方式决定的；由于只有 2 个荧光通道，不能同时观看 3 种荧光，必须一个一个通道观察，然后进行图片处理，才得到一个完整的图片，操作麻烦；图像分辨率要差一些，当荧光点放大时，看到
26、的是一个方形的点，图像失真，所以制作的图片不能满足研究需要，而且还有串色的问题不能解决，激光器通道只有 2 个，以后不能扩展。而 Leica TCS SP5/8 相比较具有较好的成像效果，在关键的设备激光光源以及软件处理方面进行了精细的设计，采用棱镜分光以及 X2Y 的扫描模式，具有极佳的成像效果，扫描速度快，分辨率高，灵敏性高，稳定性强，能够满足我们家蚕研究的基本需要；具有多个荧光通道，所以操作方便，利用仪器自带管理软件可以在计算机界面完成操作，并能进行荧光的具体分析以及后期加工处理；并具有良好的平台扩展性，可现场升级至双光子、STED 超高分辨率、SMD 单分子荧光、CARS 等最先进的技术应用平台，本所部分研究人员以前曾使用过该公司的早期产品，我们最近也考察了最新发布 Leica TCS SP8 的样机，观看其成像效果，所以从产品的质量、适用性、售后服务以及以后的升级等方面综合进行考虑，我们都倾向于选择 Leica TCS SP8。
