1、 深 圳 容 金 科 技 有 限 公 司 Shenzhen Reagent Technology Co.,Ltd. 地址：深圳市宝安区西乡街道固戍二路泳辉商务大厦 906-907 邮编：518102 电话：0755-23006611 075523006622 0755-23006633 0755-23006699 传真：0755-23006622-621REAGEN克伦特罗 ELISA 一步法检测说明书RND990131概述REAGEN克伦特罗酶联免疫反应测试盒适用于尿样、组织和饲料等中克伦特罗残留的定量检测。该试剂盒特点包括： 快速(10-30分钟),不需要有机溶剂，高回收率(75-95%)
2、的提取方法。 高灵敏度（0.05ppb）；低检测下限（肉类/脂肪0.1ppb，尿液0.2ppb，饲料1ppb）。 检测过程只需要不到2小时。 高重复性。2试剂盒原理REAGEN克伦特罗酶联免疫反应测试盒基于竞争性酶联免疫反应原理，克伦特罗抗体已经包被于微孔板上。药物分析时，样品同酶标记物共同被添加到板孔中。如果样品中含有药物，会竞争包被抗体，抑制酶标记物与板上包被的抗体结合。加入底物后，产物的颜色强弱与样品中药物的浓度成反比。3. 试剂盒组成已包被抗原的酶标板(Clenbuterol-coated Plate)（可拆式） .128 孔标准液(Standards)（0，0.05，0.15，0.5
3、，1.5，4.5ppb ） .61.8mL回收用 10ppb(Spiking)（可选） .11.8ml1x HRP 酶标记物 (HRP-Conjugated) .1 8ml20样品提取液(Sample Extraction Buffer) .110mL20浓缩洗液(Wash Solution) .128mLTMB 底物(TMB Substrate) .112mL终止液(Stop Buffer) .120mL10PBS.125mL样品平衡溶液 I （Sample Balance Buffer I ） .110mL样品平衡溶液混合物 II （Sample Balance Buffer II ） .
4、162g受体素清洗液 I(Beta-Agonist Clean Up Buffer I) .15mL受体素清洗液 II(Beta-Agonist Clean Up Buffer II) .15mL受体素清洗液 III(Beta-Agonist Clean Up Buffer III) .128mL牛奶清洗剂（Milk Clean Up Buffer） .110mL牛奶平衡液(Milk Balance Buffer) .125mL肝脏提取液(Liver Extraction Buffer ) .110mL本试剂盒应当在 2-8的温度下储存，有效期为一年。如果超过 3 个月不使用试剂盒，请将酶标记
5、物放置-20或者冰冻保存。4. 样品检测下限检测样品 检测下限（ng/g）饲料 1肉 鸡肝 0.1奶 0.25尿 血 0.05(method 1) 0.25(methodII )蛋 0.2羊牛猪肝 0.15. 交叉反应数据-兴奋剂 交叉反应 (%)（盐酸）克伦特罗(Clenbuterol) 100马布特罗(Mabuterol) 67马喷特罗(Mapenterol) 55妥鲁特罗(Tolubuterol) 12叔丁喘宁(Terbutaline) 8.3深 圳 容 金 科 技 有 限 公 司 Shenzhen Reagent Technology Co.,Ltd. 地址：深圳市宝安区西乡街道固戍二
6、路泳辉商务大厦 906-907 邮编：518102 电话：0755-23006611 075523006622 0755-23006633 0755-23006699 传真：0755-23006622-621希姆特罗(Cimbuterol) 6.7沙丁胺醇(Salbutamol) 6.0西马特罗(Cimaterol) 1.6吡丁舒喘宁(Pirbuterol) 0.5异丙肾上腺素(Isoprenaline) 0.36未提供的设备或材料1) 酶标仪(450nm)2) 恒温培养箱3) 匀质器4) 漩涡振荡器5) 移液器(10、20 和 100L，1mL 各一支)6) 多道移液器（50-300L）7.
7、注意事项实验前请阅读以下文字，以保证获得最佳实验效果。1) 标准品中含有克伦特罗，请小心使用。2) 不要使用过期的试剂盒。3) 不同批次的试剂盒不要混用，酶标物和微孔板具有盒与批次的特异性。4) 尽量保持室温 20-25，避免在通风口操作防止温度过低，过热和/或者蒸发。同样的，不要在阳光直射下实验，防止过热及蒸发。在孵育期间，如果工作台温度过低，应该铺垫若干纸巾或者其他物料。5) 水质量很重要，确保使用蒸馏或者去离子水。6) 加入样品或者试剂到空的微孔板时，吸嘴靠于微孔接近底部，并保持接触。7) 孵育时间的计算越规范越好，保持添加标准品的一致性，先添加标准品后添加样品。8) 从低浓度到高浓度地
8、添加标准品，降低影响标准品曲线质量的风险。9) 将微孔板置于放有干燥剂的密封袋中，冷藏保存。8试剂的准备所有的试剂在使用之前应将其回温至室温（约半小时） ，并在使用试剂前摇动几下，以保证合理的浓度。（1）1工作洗液按 1：19 的比例配制浓缩洗液和双蒸馏水。举例：取 10ml 的 20X 浓缩洗液加入到 190ml 双蒸馏水中，配制成 200ml 的 1X 工作洗液，按需要，可同比例放大或缩小。（2）1样品提取液按 1：19 的比例配制样品提取浓缩液和双蒸馏水。举例：取 1ml 的 10X 样品提取液加入到19ml 双蒸馏水中，配制成 20ml 的 1X 样品提取液，按需要，可同比例放大或缩小
9、。（3）1PBS 样品提取液按 1：9 的比例配制 PBS 浓缩液和双蒸馏水。举例：取 1ml 的 10X PBS 加入到 9ml 双蒸馏水中，配制成 10ml 的 1XPBS，按需要，可同比例放大或缩小。（4）1平衡溶液将 10ml 样品平衡溶液 I、62g 样品平衡溶液混合物 II 和 190ml 蒸馏水加入 250ml 容量瓶中，混匀9样品的准备蛋 1. 匀质适量样品 2. 加入 2 mL 1X 样品提取液 到 1 g 样品中, 涡旋混匀 3. 加入 3 mL 乙腈 和 2.5 mL of 1X 样品平衡液 . 涡旋混匀 4. 离心 4,000 x g (20 25 / 68 77 F)
10、,取 900 L 上清液到新管. 5. 氮气吹干 606. 加入 1 mL 正己烷 再加入 0.6 mL 1X PBS, 涡旋混匀. 7. 离心 5minutes 4,000 x g, 除去正己烷层 8. 取 100 uL 下层液体做检测. 稀释倍数: 2. 深 圳 容 金 科 技 有 限 公 司 Shenzhen Reagent Technology Co.,Ltd. 地址：深圳市宝安区西乡街道固戍二路泳辉商务大厦 906-907 邮编：518102 电话：0755-23006611 075523006622 0755-23006633 0755-23006699 传真：0755-23006
11、622-621饲料1. 匀质适量样品. 2. 加入20 mL 0.1 M HCl 到 2 g 样品. 涡旋混匀3分钟. 3. 离心10 分钟 2,000 x g (20 25 / 68 77F), 取 1 mL 到新管，加入55 L 1 M NaOH 调到 pH 6-8 (1 M NaOH 的量根据实际样品来调节). 4. 离心 10 分钟 2,000 x g, 取 0.5 mL 到新管 加入0.5 mL 1X PBS, 混匀. 5. 取100 uL 来检测. 稀释倍数: 20. 2） 肌肉/鸡肝方法 1（1） 除去肌肉、肝脏或者肾脏中的脂肪，使用适当的匀浆器进行匀浆；（2） 取 3g 匀浆样
12、品，加入 8mL 乙腈和 1mL 乙酸乙酯，最大转速涡旋振荡 3 分钟；（3） 室温（22.52.5）C 下离心力 4000g 离心 5 分钟；（4） 移取 6mL 上清液到另一新试管，在 60-70 C 减压蒸馏或 60-70C 水浴氮气吹干；（5） 取 1mL 正已烷溶解干燥物，并加入 1mL1PBS 溶液，最大转速涡旋振荡 1 分钟。 （如果出现乳化现象，同时下层液量不足够检测，保证管子排气，85水浴 3 分钟） ；（6） 室温（22.52.5）C 下离心力 4000g 离心 5 分钟，除去正己烷，每孔取 100L 下清液进行检测。稀释倍数：0.5方法 2（1） 除去脂肪，使用适当匀浆器
13、匀质；（2） 取 1g 匀质样品，加入 2mL1样品提取液，最大速度涡旋振荡 3 分钟或者摇床 20 分钟；（3） 加入 3ml 乙腈，2.5ml 1x 平衡液，混匀（4） 室温（22.52.5）C 下离心力 4000g 离心 5 分钟，移取 0.9mL 上清液到另一试管（避免接触脂肪层） ；（5） 氮气吹干 60，（6） 取 1mL 正已烷溶解干燥物，并加入 0.6mL1PBS 溶液，最大转速涡旋振荡 1 分钟（7） 室温（22.52.5）C 下离心力 4000g 离心 5 分钟；除去正己烷，每孔取 100L 下清液进行检测。稀释倍数：2.0牛奶方法一1. 取 1 mL 牛奶, 加 0.1
14、mL 0.5 M HCl 和 50 uL 清洗剂 I , 混匀5s, 加入 50 uL 清洗剂 II 混匀30s. 2. 离心 2,000 x g 室温 (20 25 / 68 77 F ) 5分钟. 3. 取 100 uL上清液, 加 320 uL 清洗剂 III, 混匀. 4. 取 100 uL 检测. 稀释倍数: 5.方法二1. 取1 mL 奶样 加 100 uL 牛奶清洗剂.2. 剧烈涡旋20秒.3. 离心4,000 xg 10 分钟.4. 取110uL 上清，加入290 uL 牛奶平衡液, 混匀 5. 取100uL 样品液用于检测稀释倍数 4牛羊猪肝（1） 除去脂肪，使用适当匀浆器匀
15、质；（2） 取 1g 匀质样品，加入 2mL1样品提取液，最大速度涡旋振荡 3 分钟或者摇床 20 分钟；（3） 加入 3ml 乙腈，2.5ml 1x 平衡液，100ul 肝脏提取液，混匀（4） 室温（22.52.5）C 下离心力 4000g 离心 5 分钟，移取 0.9mL 上清液到另一试管（避免接触脂肪层） ；（5） 氮气吹干 60，（6） 取 1mL 正已烷溶解干燥物，并加入 0.6mL1PBS 溶液，最大转速涡旋振荡 1 分钟（7） 室温（22.52.5）C 下离心力 4000g 离心 5 分钟；（8） 除去正己烷，每孔取 100L 下清液进行检测。稀释倍数：2.0深 圳 容 金 科
16、技 有 限 公 司 Shenzhen Reagent Technology Co.,Ltd. 地址：深圳市宝安区西乡街道固戍二路泳辉商务大厦 906-907 邮编：518102 电话：0755-23006611 075523006622 0755-23006633 0755-23006699 传真：0755-23006622-6214） 尿样（1） 取 0.5mL 尿样，室温（22.52.5）C 下离心力 4000g 离心 5 分钟；（2） 取 50L 上清液作检测。稀释倍数：1.0方法 2：(血液 尿背景高的)1. 取 1 mL 牛奶 , 加 0.1 mL 0.5 M HCl 和 50 uL
17、 清洗剂 I , 混匀, 加入 50 uL 清洗剂 II 混匀. 2. 离心 2,000 x g 室温 (20 25 / 68 77 F ) 5分钟. 3. 取 100 uL上清液, 加 320 uL 清洗剂 III, 混匀. 4. 取 100 uL 检测. 稀释倍数: 5.10酶联免疫反应测试步骤以下为计算份量的表格，用户可根据自己的需要来确定需要配置多少试剂。试剂 每个反应需要的体积 24 次反应的体积酶标工作液 50 L 1.2 mL工作洗液 1 mL 24 mL终止液 100 L 2.4 mL底物 100 L 2.4 mL（1） 加入 100L 的标准品和样品于所设定的孔中；（2） 在
18、每孔中加入 50L 酶标， 轻轻摇动微孔板混匀 1 分钟；（3） 室温（22.52.5）C 避光孵育 45 分钟；（4） 洗板 3 次，每次加入 250L 1洗液，最后一次尽量甩干并在吸水纸上吸干；（5） 加入 100L 的 TMB 底物（底物本身无色，出现颜色变化不能使用） ；（6） 室温（22.52.5）C 避光孵育孵育 10-15 分钟，加入 100L 的终止液终止反应，在 450nm 下读 OD 值(读数前使用无绒布擦拭微孔底部水分和指模)。11结果计算（1） 分别计算标准、质控和样品的平均吸光度值和相对吸光度值。相对吸光度值 (%) = (标准或样品吸光度值/零标准吸光度值) 100 （2） 以相对吸光度值为纵坐标，标准浓度为横坐标建立标准曲线。（3） 从标准曲线上读取质控和样品的浓度值。备注：如结果呈阳性反应，应该用其他检验方法（如色谱/质谱方法等）进行确证。以下曲线图是克伦特罗酶联免疫反应测试盒的典型标准曲线
