1、计划类别：前沿与关键技术创新-社会民生创新计划部分-新型临床诊疗技术南通市科技计划项目申报书（新型临床诊疗技术攻关）项目名称：联合肝脏 MRI 及血清 CK-18 水平判断NAFLD 进程 技 术 领 域 ： 申 报 单 位 ： 南 通 大 学 附 属 医 院 共 建 单 位 ： 南 通 市 第 三 人 民 医 院 申报单位地址： 南通市崇川区西寺路 20 号 邮 编： 226001 共建单位地址： 南通市青年中路 99 号 邮 编： 226006 项目负责人： 赵金丽 电 话： 13404290599 项目联系人： 徐水珠 电 话： 85052297 主管部门： 南通市科技局 申报日期：20
2、15 年 7 月 16 日南通市科学技术局二一五年制一、立项依据1、本项目国内外科技创新发展概况和最新发展趋势非酒精性脂肪性肝病(Nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD)是以弥漫性肝细胞大泡性脂肪变为主要特征的临床病理综合征，包括单纯性脂肪肝、非酒精性脂肪性肝炎（Nonalcoholic Steatohepatitis, NASH） 、NASH 相关性肝硬化，甚至可演变为肝癌。最近研究发现，NASH 患者并发心脑血管疾病的风险也明显上升，如动脉粥样硬化、脑梗死、心肌梗死等 1。近年来，随着人们生活习惯和饮食结构的改变，NAFLD 的患病率逐年增高，且起病渐
3、趋低龄化，已成为全球性的公共卫生问题，但直至目前仍未得到解决。NAFLD 已经成为最为常见的慢性肝病之一，西方国家患病率高达 20%-30% 1。随着国人生活水平的不断提高和生活习惯的改变， NAFLD 的发病率逐年上升，研究显示上海、广州等地患病率为 15%2。 NAFLD 的早期即为单纯脂肪变，如果疾病不进一步进展，则不会出现脏内炎症及纤维化，也不会造成严重的不良后果。如果疾病进一步进展，可转变为非酒精性脂肪性肝炎，它是以肝细胞脂肪变、肝细胞气球样变性、小叶内和/或汇管区炎症，伴或不伴纤维化为特征的代谢性疾病 3。此时患者肝细胞破坏，肝内发生炎症及纤维化，如果不能及时阻断病程进展，则会进一
4、步发展成为肝纤维化、肝硬化，甚至肝癌等终末期肝病。所以尽可能的在 NASH 阶段阻断病情的进展，显得至关重要 4。至今，NASH 发病机制仍未完全阐明，目前研究发现 TLR-4 信号通路、肝内巨噬细胞（Kupffer 细胞）在 NASH 中发挥重要作用 5，调节性 T 细胞（Treg 细胞） 、自然杀伤 T 细胞（NKT 细胞） 6以及 Th17 细胞 7也参与了 NASH 的发生发展。直至目前NAFLD 的发病机制仍未完全阐明，诊断主要依靠病理学检查作为重要手段，尤其在判断病程处在 NAFLD 进程程中的何种阶段时病理诊断显得更为重要。由于病理学检查存在一定的创伤，并存在一定的取样误差，导致
5、国内很难大规模开展，从而为 NASH 的诊断带来了困扰。近年大家一直致力于寻找有效的无创手段诊断 NASH，从而使该类患者得到及时治疗，延缓病情的进展，但直至目前结果仍不理想 8,9，所以目前发现有效的无创诊断手段成为治疗 NASH 的关键问题。肝细胞凋亡是 NASH 区别于单纯脂肪肝的一个重要特征，根据这一特征，早在 2009 年，人们研究发现外周血中 CK-18 片断每增加 50u/l，NASH 的患病率增加 30%；通过检测外周血中的 CK-18 片断，可以用来诊断 NAFLD，有助于区分 NASH 与单纯脂肪肝 10。紧接着也有多项研究证实 CK-18 片断可用于诊断 NAFLD11,
6、12。目前我们主要的诊断难点在于如何在 NAFLD 的人群中，尽早发现 NASH 患者，给与早期治疗，延缓病情进展。Kenneth Cusi 等研究发现，血清 CK-18 的含量作为外周血指标诊断 NAFLD 时，ROC 曲线下面积0.77，而预测 NASH 时仅为 0.65，在 NAFLD 肝纤维化时 ROC 曲线下面积0.68（如图 1 所示） 13，该研究提示 CK-18 作为诊断 NAFLD 时，具有较高的诊断效率，但针对目前临床医生最为关心的，如何在 NAFLD 患者中及早发现NASH 的帮助不大。我们知道 NASH 主要的病理学特征包括肝细胞脂肪变、肝内炎症以及肝细胞气球样变性三方
7、面，可以伴有不同程度的纤维化。进一步的研究显示，血浆 CK-18 与肝内炎症程度呈正相关，提示血浆 CK-18 能够较好地反映肝内炎症的程度；而肝内脂肪变性与血浆 CK-18 的相关性不明显，提示血浆 CK-18 不能很好的反应肝内脂肪变性程度 14。我们提出，寻找合适的反应肝内脂肪变性的检测方法，联合血浆 CK-18 片断的测定，有望成为诊断NASH 的重要的无创手段，对临床诊断具有重要意义。图 1 血浆 CK-18 含量预测 NAFLD、NASH、肝纤维化影像学检查方法如超声、CT和MRI等由于其无创性，敏感性和可重复性的优点常用于脂肪肝的临床诊断。近年来随着MR成像技术的不断发展，随着梯
8、度回波同/反相位( in-phase/ opposed-phase, IP/ OP)序列和磁共振氢谱( proton magnetic resonance spectroscopy, 1H-MRS)的涌现和应用, 使得脂肪含量的定量评价成为可能。目前M成像常用的脂肪量化技术是基于梯度技术双回波序列的化学位移成像方法。氢质子( H)在水和脂肪中的进动频率不一样，在水分子中的进动频率比脂肪分子中的频率快3.5 ppm。而当氢质子受到射频脉冲激发后，脂肪和水中氢质子的相位差为0时，两种磁化矢量相加形成同相位（IP ） ，而当脂肪和水中氢质子的相位差为180时，两种磁化矢量相减为反相位（OP） 。因此
9、在梯度回波序列的不同时间采集回波信号时可以形成IP图和OP图像。之后通过测量肝脏的信号强度通过公式（SIinSIop）/2SIin 来计算脂肪分数(fat signal fractions，FF)。既往研究 15证实梯度回波技术是定量脂肪含量的有效方法。Fischer等研究发现，通过 IP/OP序列扫描得出的FF与组织病理学的脂肪变性有很好的相关性（r=0.92，P0.0001） ，FF 诊断的ROC 曲线下面积为0.90，而且对较少的脂肪成分也很敏感。 1H-MRS可以实现对活体组织代谢、生化改变及化合物定量的无创性研究。通过肝脏单体素点分辨选择波谱成像( point-resolved se
10、lective spectroscopy, PRESS) 序列扫描获得图像，分析肝脏脂肪的组成成分及脂质代谢的生化特性，并能测量人体内含氢最多的水峰和脂峰, 获得水峰峰值( Pwater ) 、脂峰峰值( Plipid ) 及水峰峰下面积( Awater ) 及脂峰峰下面积( Alipid ) , 然后通过A lipid / ( Alipid+Awater ) 得出相对脂肪含量 ( relative lipid cotent，RLC) ，直接反映活体肝脏的脂肪含量。既往国内外学者 16,17表明无论是正常人群还是脂肪肝患者，应用3.0T 1H-MRS定量分析肝脏脂肪含量可靠准确，也有很好的可重
11、复性。因此肝脏梯度回波IP/ OP系列和 1H-MRS可作为一种安全无创、精确度高的量化脂肪含量和评价脂肪肝程度的影像学检查方法 18,19。图2 肝脏inphase、outphase 、 1H-MRS图综上所述，目前 NASH 的无创诊断存在困难，近年来大家致力于寻找外周血的标志物诊断 NASH，但均存在一定的局限性，不能够很好的应用于临床。我们通过结合 MRI 检测平台与外周血的标志物，可能为 NASH 的诊断寻找到合适的无创手段。参考文献1. Targher G, Day CP, Bonora E. Risk of cardiovascular disease in patients w
12、ith nonalcoholic fatty liver disease. N Engl J Med 2010;363:1341-1350.2. Fan JG, Farrell GC. Epidemiology of non-alcoholic fatty liver disease in China. J Hepatol 2009;50:204-210.3. Angulo P. Nonalcoholic fatty liver disease. N Engl J Med 2002;346:1221-1231.4. Krawczyk M, Bonfrate L, Portincasa P. N
13、onalcoholic fatty liver disease. Best Pract Res Clin Gastroenterol 2010;24:695-708.5. Rivera CA, Adegboyega P, van Rooijen N, et al. Toll-like receptor-4 signaling and Kupffer cells play pivotal roles in the pathogenesis of non-alcoholic steatohepatitis. J Hepatol 2007;47:571-579.6. Hua J, Ma X, Web
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16、treatment response in patients with Non-alcoholic Steatohepatitis. J Hepatol 2015.10. Feldstein AE, Wieckowska A, Lopez AR, et al. Cytokeratin-18 fragment levels as noninvasive biomarkers for nonalcoholic steatohepatitis: a multicenter validation study. Hepatology 2009;50:1072-1078.11. Feldstein AE,
17、 Alkhouri N, De Vito R, et al. Serum cytokeratin-18 fragment levels are useful biomarkers for nonalcoholic steatohepatitis in children. Am J Gastroenterol 2013;108:1526-1531.12. Cao W, Zhao C, Shen C, et al. Cytokeratin 18, alanine aminotransferase, platelets and triglycerides predict the presence o
18、f nonalcoholic steatohepatitis. PLoS One 2013;8:e82092.13. Cusi K, Chang Z, Harrison S, et al. Limited value of plasma cytokeratin-18 as a biomarker for NASH and fibrosis in patients with non-alcoholic fatty liver disease. J Hepatol 2014;60:167-174.14. Szczepaniak LS，Nurenberq P，Leonard D，et al.Magn
19、etic resonance spectroscopy to measure hepatic triglyceride content: prevalence of hepatic steatosis in the general population.Am J Physiol Endocrinol Metab 2005;288(2) : E462- 46815. Fischer MA, Nanz D, Reiner CS,et al.Diagnostic performance and accuracy of 3-D spoiled gradient-dual-echo MRI with w
20、ater- and fat-signal separationin liver-fat quantification: comparison to liver biopsy. Invest Radiol. 2010;45(8):465-70.16. Reeder SB, Robson PM, Yu H,et al. Quantification of hepatic steatosis with MRI: the effects of accurate fat spectral modeling.J Magn Reson Imaging 2009;29(6):1332-9. 17. 熊美连，曹
21、代荣，邢振，等.3.0T 1H-MRS测量肝脏脂肪含量的可重复性研究.临床放射学杂志，2012;31(12):1736-39.18. Sharma P, Altbach M, Galons JP,et al. Measurement of liver fat fraction and iron with MRI and MR spectroscopy techniques. Diagn Interv Radio 2014; 20(1):1726.19. dAssignies G, Kauffmann C, Boulanger Y,et al.Simultaneous assessment of
22、 liver volume and whole liver fat content: a step towards one-stop shop preoperative MRI protocol. Eur Radiol 2011;21(2):301-9. 2、本项目研究的目的、意义外周血标记物 CK-18 可以较好地反映肝内炎症的程度，从而具有较高的NAFLD 诊断率，但其与肝内脂肪变性的相关性不明显，不能很好的反应肝内脂肪变性程度，对 NAFLD 患者中及早发现 NASH 的帮助不大。本研究致力于通过 MRI IP/OP 序列扫描及 1H-MRS 技术，结合外周血标志物 CK-18 的检测，
23、用于区分 NAFLD 患者中单纯性脂肪肝、NASH 及 NAFLD 相关性肝硬化。为NASH 的诊断寻找到合适的无创手段，尽早发现 NASH 患者，早期治疗延缓病情进展，减轻患者的经济负担，提高患者的生活质量。3、本项目研究现有起点科技水平及已存在的知识产权情况目前该课题科技水平已达到分子生物学水平，依托 3.0T 高场强磁共振扫描仪进行 IP/OP 序列扫描及 1H-MRS 检查，并结合外周血 CK-18 的检测，通过这种无创检查手段尽早诊断 NASH，以便于早期治疗；该课题自主设计资助实施，未侵犯他人知识产权。二、研究内容1、具体研究开发内容和要重点解决的关键技术问题；1、具体研究开发内容
24、：（1）MRI 测定 NAFLD 患者中单纯脂肪肝、NASH 及 NAFLD 相关性肝硬化的肝脏脂肪含量，分析三者的肝脏脂肪含量差异有无统计学意义。（2）结合 MRI 肝脏脂肪含量及外周血 CK-18 的定量检测，对比组织病理学结果，分析其相关性。试图找出诊断 NASH 及判断 NAFLD 进程无创及准确的方法。2、重点解决的关键技术：(1)1H-MRS 检查采用单体素点分辨波谱序列，可受体素大小及肝内血管、胆管影响，因此检查时体素不小于 2cm3，感兴趣区（region of interest，ROI ）选取于肝右叶，避开邻近血管及胆管。(2)1H-MRS 检查图像易受呼吸移动影响，因此在检
25、查前进行呼吸运动训练，选择相对静止的平台期作为最佳配合状态进行扫描。(3)肝组织标本收集较困难，我们在获得患者知情同意权后通过肝活检、肝穿刺等方法取得样本，与南通第三人民医院肝病实验室合作增加样本量。2、项目的特色和创新之处；首次提出通过 MRI IP/OP 序列扫描、 1H-MRS 成像对 NAFLD 肝脏脂肪含量进行定量检测，ELISA 法测定 NAFLD 患者外周血 CK-18 片段含量，研究两者联合判断 NAFLD 进程与病理诊断的相关性，试图找出诊断 NASH 及判断NAFLD 进程无创及准确的方法，为临床治疗提供有力的依据。3、要达到的主要技术、经济指标及社会、经济效益。该项目虽然
26、不直接产生经济效益，但该研究通过无创检测手段可以区分NAFLD 患者中单纯性脂肪肝、NASH 及 NAFLD 相关性肝硬化，尽早诊断NASH，有助于临床的早期治疗，延缓病情进展，同时无创检测可以减轻患者的痛苦，有利于病情的监测，因此有较好的应用推广前景。三、研究试验方法、技术路线以及工艺流程主要研究实验方法1.MRI 检查使用美国 GE 公司 Signa HDx3.0T 超导磁共振扫描仪及其随机配置的AW4.5 工作站。扫描序列：常规 T1WI、T 2WI，频率饱和反转恢复序列 ( spectral saturation inversion recovery , SPIR)、IP/ OP 序列
27、及 PRESS 序列。成像参数见表 1。表 1 MRI 成像参数脉冲序列 TR(ms)FA(0)TE(ms)矩阵 FOV(mm)层厚/间隔(mm)NEX常规T1WI150 85 2.1 288192 380340 8/2 1常规T2WI6000 90 85.1 320224 380290 8/2 2SPIR 6000 90 85.1 320224 380290 8/2 2IP/ OP 150 85 4.8/2.4 288192 380340 8/2 1PRESS 3000 90 35 380380将原始数据传输至GE AW4.5工作站，在IP/ OP 图像上分3次测量肝脏ROI的信号强度（si
28、gnal intensity，SI） ，取其平均值，通过公式FF= （SI inSI op）/2SIin计算。采用GE SA GE 软件进行 1H-MRS波谱图像后处理 , 得到水峰峰值( Pwater ) 、脂峰峰值( Plipid ) 及水峰峰下面积( Awater ) 及脂峰峰下面积( Alipid ) , 然后通过A lipid / ( Alipid+Awater ) 得出相对脂肪含量( relative lipid cotent，RLC) 。2.外周血CK-18检测我们通过酶联免疫吸附实验(ELISA) 检测 CK-18 片断含量。即将已知的CK-18 片断抗体吸附在固相载体表面，而
29、患者外周血标本中的 CK-18 片断可与之结合，使酶标记的抗原抗体反应在固相表面进行，最终根据标准曲线计算CK-18 片断含量。该技术具有快速、灵敏、简便、载体易于标准化等优点。3.肝脏病理学检查肝穿刺组织标本10%福尔马林固定后，常规石蜡包埋、切片后，行H&E染色。由经验丰富的病理科医生读片后给予非酒精性脂肪性肝病评分（NAS） 。NAS评分标准 (08分) ：肝细胞脂肪变性： 66%，3分；小叶内炎症（200 倍镜下计数坏死灶）：无，0分；4个，3分；肝细胞气球样变：无，0分；少见，1分；多见，2分。NAS4分者可诊断为NASH；介于两者之间者为NASH可能。本研究入组NASH患者均为NA
30、S3分者。单纯脂肪变在病理上主要表现为单纯的肝细胞脂肪变，不伴有小叶内炎症细胞浸润；当出现NASH相关肝硬化时病理学主要表现为假小叶形成，此时肝细胞脂肪变反而有所减轻。技术路线图工作方案1.标本收集1.1 病例选择 1.1.1 纳入标准： NAFLD 患者，其诊断标准如下： 有易患因素如肥胖、2 型糖尿病、高脂血症和女性等；无饮酒史或饮酒折合酒精量每周40g；除外病毒性肝炎、药物性肝病、Wilson 病、全胃肠外营养和自身免疫性肝病等；除原发病临床表现外，出现乏力、肝区隐痛等症状，可伴肝脾肿大；血清转氨酶可升高，并以 ALT 为主，可伴有 GGT、铁蛋白和尿酸等增高； 肝脏组织学有典型表现；有影像学诊断依据。临床诊断标准凡具备下列第 项和第或第项任一项者。
