1、Comment W用1: 文献依据？1梾木种子低温层积过程中内源激素含量的动态变化摘要：应用酶联免疫吸附测定法（ELISA）研究了梾木种胚低温层积过程中内源激素质量分数的动态变化，分析了内源激素与梾木种子休眠的关系。结果表明，IAA在层积处理初期剧烈降低，持续一段时间后IAA质量分数显著升高，但后期IAA质量分数下降，IAA/ABA的也出现同样的变化。种胚中的ABA在层积处理前期较高，但随着处理时间的延长质量分数趋于下降。ZRs和iPAs的变化相对较为平稳，尽管有一定的波动，但整体呈渐趋增高趋势。就iPA S/ABA、ZRs/ABA 二者的比例变化来看，处理前期（180 d前）二者均为上升，但
2、后期（180 d后）波动较大，并出现了短暂下降。梾木种胚中各内源激素间存在着一定的内在关系，它们相互作用共同影响着种胚内源物质的效应与转化。关键词：梾木；种子；内源激素；低温层积；种子休眠中图分类号：S718.43；Q946.8 文献标识码： 文章编号： Dynamic Variation of Endogenous Hormone Content in Cornus macrophylla seeds during cold stratification Abstrat： Variation of endogenous hormone content in embryos of Cornus
3、 macrophylla during cold stratification were studied with enzyme linked immunosorbent assay(ELSA), the relationship between endogenous hormone content and seed dormancy were analyzed. The result showed the IAA content in embryos dropped in the early phase of cold stratification, but that rebounded a
4、fter brief continuant time, and IAA content fell remarkably at the last stage, variation of IAA/ABA was so. ABA content in embryos was high cold stratification ago, but as the extension of treatment time that tended to fall. Variation of both of ZRs and iPAs showed an equilibrium situation, the mass
5、 fraction trended to increasing. Ratio of iPA to ABA and ZRs to ABA was firstly(0 180th) increased, at the later stage of cold stratification(180 days later)that was prone to big fluctuations, and decreased along with the processing time. There were certain internal relation between endogenous hormo
6、nes in embryos, so mutual interactions between the various hormones affected their effect and transformation of matter.Key words：Cornus macrophylla； seeds；endogenous hormone；cold stratification；seed dormancy梾木（Cornus macrophylla）又名椋子木，隶属山茱萸科梾木属（Cornus） ，为我国传统的木本油料植物。其自然散生于我国西北的甘肃、陕西，华北的山东、河南，以及长江以南各
7、省海拔600 2200 m的密林中 1。梾木新鲜种实含油率高达31.8% 41.3%， 出油率30% 2。油脂不仅可供食用（在我国江西、山东、山西群众用简易榨油取果油食用已有上百年的历史） ，还可作机械和钟表的润滑油，也是油漆的好原料。榨油后的残渣又是优良的饲料及肥料，树皮及叶可提取拷胶，木材坚硬，纹理细致，是上等家具和建筑良材。其树形通直高大，枝叶茂密，也是优良的城乡园林绿化树种。目前，播种仍是梾木最常用的引种育苗方法，但是梾木种实具有明显的休眠习性，种皮坚硬，未经处理的种子当年几乎不能发芽，即使经过层积处理一般也要23年才能发芽，这给生产上实生苗的培育带来一定难度，并成为本植物引种栽培和应
8、用推广的主要制约因子。近年来，有关低温层积和激素破除本属种子的休眠已有研究报道 3-4，但相关机制尚不清楚。为深入了解梾木种实休眠的内在机理，本文通过梾木种子贮藏期内源激素质量分数的测定，分析了内源激素与种子休眠的关系，以期为本植物的引种与繁育，促进其在林业生产上的应用提供理论依据。1 材料与方法1.1 材料及处理供试种子来源于河南小秦岭自然保护区（河南灵宝市）。种实于2011年10月采集，经揉搓、脱肉、冲洗、晾干，获得纯净的种子2kg。种子为圆球型，浅肉红色，直径4.365.43mm，百粒重5.3145.805g（图1）。实验于2011 年10 月至2012年10月进行。种子脱肉后图 1梾木
9、果实脱肉后的种子形态Fig. 1 The seed form of Cornus macrophylla after broken pulpComment W用2: 称取什么样品？2采用混沙湿藏，将种子和湿沙（含水量4045%）按照体积比1：3的比例混合，置于05冷库中贮藏。湿沙为新鲜河沙，并经高温灭菌消毒。从2011年10月开始每月中旬取样1 次，重复3 次，至2012年10月共取样11 次。取样时将种子自湿沙中筛出，自来水冲洗，并用吸水纸吸干水分，人工去除种皮、筛拣，获得纯净的种胚置于68超低温冰箱中待测。1.2 内源激素质量分数的测定分别称取样品0.5 g，液氮速冻后，加4 ml 提取液
10、（80%冷甲醇）冰浴研磨至匀浆，转入10 ml 试管中。摇匀后在4 下放置4 h， 1 000 g 离心15 min，取上清液。沉淀中加1 ml 提取液，搅匀，置于4下再提取1 h，后离心，合并上清液并记录体积，残渣弃去。上清液过C18 固相萃取柱纯化。测定方法采用酶联免疫法（ELISA） 5，试剂盒由中国农业大学农学院提供。所有样品均重复测定3次，取平均值，应用EXCELL作图，并作统计分析。2 结果与分析2.1 低温层积过程中种胚内源激素质量分数的变化2.1.1 IAA质量分数的变化低温层积过程中梾木种胚 IAA质量分数的变化见图 2所示。从整体趋势来看，IAA 质量分数在层积初期剧烈降低
11、，持续一段时间后随着处理时间的延长 IAA质量分数显著升高，但后期 IAA质量分数剧烈下降。未层积处理的种子测得的 IAA质量分数为 103.040 ngg-1 FW，层积处理 30 d后 IAA质量分数降至 54.225 ngg-1 FW。层积 60 d后 IAA质量分数开始逐渐上升，到 240 d时升到最大值（125.291 ngg-1 FW） ，随后 IAA质量分数随处理时间的延长而下滑。2.1.2 ABA质量分数的变化梾木种胚 ABA质量分数的变化态势与 IAA截然不同（图 3-A） 。种胚中 ABA质量分数在层积处理前最高，处理后 ABA质量分数一直下降，并在层积处理 180d后降到
12、极值（156.063 ngg-1 FW） ，这时 ABA质量分数是层积处理开始前（235.599 ngg-1 FW）的 0.6624倍。尽管随后 ABA质量分数有所回升，但总的趋势是随着层积处理时间的延长，ABA质量分数趋于下降。2.1.3 GA1/3质量分数的变化GA1/3质量分数的变化见图 3-B所示。在层积处理前期（30120d）基本呈波动变化。在层积处理前 GA1/3质量分数为 6.340 ngg-1 FW，在层积处理后第 120 d出现最大值（7.264 ngg-1 FW） ，期间有 2次低值，分别在第 30 d和 90 d出现极值（5.347、5.634 ngg-1 FW） 。层积
13、处理 120 d后又有所下降，但从第 210 d开始，种子内 GA1/3质量分数的变化一直很平稳。2.1.4 ZRs与 iPAs质量分数的变化一般认为，细胞分裂素（CTK）具有促进细胞分裂、抑制器官老化、诱导花芽分化及延缓叶片衰老的作用 6。梾木 种胚细胞分裂素 ZRs质量分数的变化见图 3-C。从总体变化趋势来看，规律不很明显。在层积处理前，梾木种子中 ZRS的质量分数为 9.262 ngg-1 FW。层积 30 d后，ZR S的质量分数下降，并出现低谷（6.473 ngg-1 FW），随后开始升高。在层积 150 d后，ZR S的质量分数为 11.749 ngg-1 FW，随着时间的延长，
14、又出现短暂的下降。在层积 300 d后，ZR S的质量分数为 12.139 ngg-1 FW，为整个处理期间最高值。图 2 梾木种胚低温层积过程中 IAA质量分数的变化Fig.2 Changes of IAA content in C. macrophylla seeds during cold stratification0204060801001201400 60 120 180 240 300 360层 积 天 数 Days/dIAA(ngg-1FW)3iPAs 质量分数的变化相对较为平稳，呈渐趋增高趋势。在层积处理 0180d 期间，iPAs 质量分数变化幅度很小，在层积处理 180d
15、 后升至最大值（6.722 ngg-1 FW）。随后开始减低，但仍高于层积处理前的质量分数（4.338 ngg-1 FW）。在层积处理 270d 后再次升到极值（6.318 ngg-1 FW），随后又有所降低。2.2 低温层积过程中种胚内源激素质量分数比例的变化许多研究表明，不同植物激素对植物生理活动的影响不是孤立地发生作用，它们之间相辅相成，既相互制约又相互促进 7-8。将梾木种子4种激素（IAA、GA 1/3、ZRs 、iPAs）平均值与ABA相比较，其结果见图4。就iPA S/ABA、ZRs/ABA 二者的变化来看，变化趋势基本相似。在处理前期（0180 d）二者为上升，但后期（180
16、d后）波动较大，并出现了短暂下降。GA 1/3/ABA尽管在不同时期有一定的波动，但整个层积处理期间基本是随着处理时间的延长显示逐步上升的趋势。由此可以推断，GA 1/3/ABA高水平的比值变化可能有助于内源抑制物质的降低，从而有利于种子发芽。由于IAA质量分数的绝对值变化较大，所以IAA/ABA的变动曲线波动幅度较大。IAA/ABA在处理240 d 之前基本上是上升的，但处理240 d后又趋于明显下降。图 3 梾木种胚低温层积过程中 ABA、GA 1/3、ZRs 和 iPAs 质量分数的变化Fig.3 Changes of ABA,GA1/3,ZRs and iPAs content in
17、C. macrophylla seeds during cold stratificationC024681012140 60 120 180 240 300 360层 积 天 数 Days/dZRs(ngg-1FW) D0123456780 60 120 180 240 300 360层 积 天 数 Days/diPAs(ngg-1FW)B4.04.55.05.56.06.57.07.58.00 60 120 180 240 300 360层 积 天 数 Days/dGA1/3(ngg-1FW)A1001301601902202502800 60 120 180 240 300 360层 积
18、 天 数 Days/dABA(ngg-1FW)Comment W用3: 此话过于笼统。43 结论与讨论一般认为，内源ABA涉及种子休眠状态的诱导，对种子内胚的发育、RNA和蛋白质合成上都起到了非常重要的调节作用。它可能降低胚的吸水能力和渗透势，阻碍了胚根的伸长，抑制种子萌发 9-11。因此，ABA 被认为是控制种子休眠的主要因素 12。本研究表明，在整个低温层积时间内，梾木种胚内ABA随时间的变化总体是减小的，这与肉苁蓉（Cistanche deserticola） 13-14、珙桐（Davidia involucrata） 15、紫椴（Tilia amurensis） 16、青钱柳（Cycl
19、ocarya paliurus ） 17等深休眠植物种胚的试验结果基本相似。随着低温层积持续时间的延长，深休眠种子中ABA含量的下降，这可能是种子萌发前的启动信号，对维持种子内部内含涵物的生理反应，逐渐解除休眠上起到了关键作用。有关IAA 在解除种子休眠方面的作用有不同的研究报道。一种结果表明，在层积处理中，休眠种子中IAA含量总体上是上升的，对解除休眠起到一定的积极作用，如Kochankov 等 19认为IAA 参与了休眠调节，杨万霞等 18通过层积试验认为，青钱柳种子的在层积处理中，种子中IAA 含量总体呈上升趋势，对解除休眠起促进作用；另有一些研究则表明种子休眠的解除过程与IAA含量关系
20、不大，过高的IAA 含量甚至起到负面作用。李金克等 20对红松（Pinus koraiensis）休眠机理的研究中认为，高浓度的IAA对种子发芽不利；高红兵等 21在东北红豆杉(Taxus cuspidata ) 种子层积过程中，认为少量IAA的增加是由于胚的生长引起的，IAA与其休眠和萌发关系不大；黄丹 22在研究美国桂花(Osmanthus americanus) 时也发现，美国桂花种子在层积过程中其IAA含量变化不明显。本研究表明，在低温层积持续期间，前期梾木种胚IAA 含量是增加的，但是达到一定高度以后又有所下降。因此，认为作为促进剂的IAA 在解除梾木种子休眠过程中起到一定的作用。林
21、木种子在萌发过程中受到种子内部多种物质的协同控制，种子的休眠与萌发取决于内源生长抑制剂和生长激素剂之间的平衡力 23-24。Wareing Saunders25认为，GA 1/3通过与ABA和环境因子的复杂作A00.10.20.30.40.50.60.70 60 120 180 240 300 360层 积 天 数 Days/dIAA/ABAC00.010.020.030.040.050.060.070.080 60 120 180 240 300 360层 积 天 数 Days/dZRs/ABA D00.010.020.030.040.050 60 120 180 240 300 360层
22、积 天 数 Days/diPAs/ABAB00.010.020.030.040.050 60 120 180 240 300 360层 积 天 数 Days/dGA1/3/ABA图 4 梾木种胚低温层积过程 IAA、GA 1/3、ZRs iPAs 和 ABA比例的变化Fig.4 Changes in ratios of IAA、GA 1/3、ZRs iPAs and ABA in C. macrophylla seeds during cold stratificationComment W用4: 层积了多长时间？是否为层积不同时间的混合种子？5用正调节休眠的解除释放和种子萌发，这种观点在莴苣
23、(Lactuca sativa)26、野茉莉（Styrax japonicus） 27、水曲柳（Fraxinus mandshurica ） 28、冬青属（Ilex） 29等许多植物研究中得到证实。Bewley 30认为GA 1/3并不参与对休眠本身的调控，而是对促进和维持发芽起作用，拮抗ABA，即作用于ABA的发芽抑制作用。本研究中随层积处理时间的延长，梾木种子中GA 1/3质量分数以及GA 1/3/ABA之比值均逐渐增大( 图3B ，图4B)，而ABA的质量分数趋于下降（图3A ）。因此，可以认为GA 1/3在打破梾木种子休眠、促进种子萌发起到重要作用，这种作用可能是通过ABA和GA 1/
24、3的平衡和拮抗来调节控制。GA 1/3/ABA高比值变化有助于种子萌发抑制物质的降低，从而有利于种子发芽。如此变化特点在很多经济林木上也有类似报道13,14,17 。而IAA/ABA在处理240 d之前基本上是上升的，但处理240 d后又趋于明显下降，相关机制还有待于进一步研究。植物种胚休眠及休眠的解除是十分复杂的生理现象，内源激素的变化及相互关系是控制休眠的内因，外部环境的变化也是必要的外因 23。低温层积处理是目前仍是解除种子深休眠的主要手段 9,31。应用本实验的节余种子进行播种，经统计有70%以上的发芽，而未处理种子发芽率为0，说明低温层积处理对解除梾木种子的深休眠十分奏效。但是，对于
25、不同植物种子，以及不同的处理方式，层积处理解除释放休眠所需要的时间是不同。例如红豆杉（Taxus chenisis）胚休眠与抑制物存在，砂藏16个月才能萌发，而美国山核桃（Caraya illinoensis），胚休眠需要低温层积30150天以上 31。通常，木本植物的种子需要较长的冷处理时间（一般6990d）， 但也有的树种需要长达180天。本研究中梾木种胚几种内源激素随层积时间的变化，可为分析该植物的休眠解除释放所需要的时间提供理论参考。 参 考 文 献1. 中国树木编辑委员会.中国树木志(第2卷). 北京: 中国林业出版社 . 1985,1686-1687.2. 吴志曾.梾木栽培技术J.
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