1、上海西唐生物科技有限公司 电话:021-55229872 55229873 技术咨询:人热休克蛋白 70(HSP70)ELISA 试剂盒原理本实验采用双抗体夹心 ABC-ELISA 法。用抗人 HSP70 单抗包被于酶标板上，标准品和样品中的 HSP70 与单抗结合，加入生物素化的抗人 HSP70，形成免疫复合物连接在板上，辣根过氧化物酶标记的Streptavidin 与生物素结合，加入底物工作液显蓝色，最后加终止液硫酸，在 450nm 处测 OD 值，HSP70 浓度与 OD 值成正比，可通过绘制标准曲线求出标本中 HSP70 浓度。试剂盒组成（2-8保存）酶标板（Coated Wells）
2、 96孔 酶标抗体工作液（Enzyme Conjugate）12ml10标本稀释液（Sample Buffer） 12ml 20浓缩洗涤液（Wash Buffer） 50ml标准品（Standards）：40ng/ 瓶 2瓶 底物工作液（TMB Solution） 12ml第一抗体工作液（Biotinylated Antibody）12ml 终止液（Stop Solution） 12ml准备试剂与收集血样1. 收集标本：血清、血浆（EDTA） 、细胞培养上清液、组织匀浆等裂解产物尽早检测，2-8保存 48 小时；更长时间须冷冻（-20 或-70 ）保存，避免反复冻融。2. 标准品液配制：使用前
3、加入 0.5ml 蒸馏水混匀，配成 80ng/ml 的溶液。设标准管 8 管，第一管加标本稀释液 900ul，第二至第八管加入标本稀释液 500ul。在第一管中加入 80ng/ml 的标准品溶液 100ul 混匀后用加样器吸出 500ul，移至第二管。如此反复作对倍稀释，从第七管中吸出 500ul 弃去。第八管为空白对照。3. 10标本稀释液用蒸馏水作 1:10 倍稀释（示例：1ml 浓稀释液+9ml 蒸馏水） 。4. 洗涤液：用重蒸水 1:20 稀释（示例：1ml 浓缩洗涤液加入 19ml 的重蒸水）标本激活方法1. 将 450ul 标本稀释液加入到一支 1.5ml 进口聚丙烯管中,再加 1
4、0ul 血清或血浆标本。2. 加 20ul 1 N HCI,盖紧，上下混匀。 28放置 60 2 分钟。3. 加 20ul 1 N NaOH,盖紧，上下混匀。4. 即用，或放-20/-70保存 3 天。计算结果时乘以稀释倍数 50。 （注意：不同的标本 HSP70 的水平可能有较大差异，请根据实际情况灵活掌握稀释度）5. 细胞培养上清或组织匀浆 10 倍稀释(410ul 的标本稀释液50ul 样本20ul 的 1N HCI+20ul的 1N NaOH)。检测程序1. 加样：每孔各加入标准品或待测样品（已激活）100ul，将反应板充分混匀后置 37120 分钟。2. 洗板：用洗涤液将反应板充分洗
5、涤 4-6 次，向滤纸上印干。3. 每孔中加入第一抗体工作液 100ul。将反应板充分混匀后置 3760 分钟。4. 洗板：同前。5. 每孔加酶标抗体工作液 100ul。将反应板置 3730 分钟。6. 洗板：同前。7. 每孔加入底物工作液 100ul，置 37 暗处反应 15 分钟。8. 每孔加入 100ul 终止液混匀。9. 30 分钟内用酶标仪在 450nm 处测吸光值。结果计算与判断1. 所有 OD 值都应减除空白值后再行计算。2. 以标准品 8000、4000 、2000、1000、500、250 、125、0 pg/ml 为横坐标，OD 值为纵坐标，在坐标纸上作图，画出标准曲线。3
6、. 根据样品 OD 值在该曲线图上查出相应 HSP70 含量，再乘上稀释倍数即可。试剂盒性能1. 灵敏度：最小的 HSP70 检测浓度小于 65pg/ml。2. 特异性：可同时检测重组或天然的人 HSP70。不与人其它细胞因子有交叉反应。3. 重复性：板内、板见变异系数均小于 12。注意事项1. 以上标准孔及待测样品均建议做复孔，每次测定应同时做标准曲线。2. 洗涤过程很关键。洗涤不充分将导致精确度误差及 OD 值错误地升高。上海西唐生物科技有限公司 电话:021-55229872 55229873 技术咨询:3. 板条开封后剩余板条要再封好，保持板条干燥。4. 本试剂盒宜置 4oC 冰箱保存。5. 本试剂盒仅用于科研，不能用于临床诊断！
