阿魏酸酯酶酶化发酵饲料制备及其对肉鸡养分利用率的影响.DOC

1、阿魏酸酯酶酶化发酵饲料制备及其对肉鸡养分利用率的影响王林林，陈云华，陈培钦，李夏兰 (华侨大学化工学院，福建 厦门 361021)摘要：为了降低饲料中抗营养因子，提高饲料转化率，研究阿魏酸酯酶酶化发酵饲料的制备，并研究了该酶化发酵饲料对肉鸡养分利用率的影响。通过正交实验得到发酵饲料较优配方：菌柄干物质 12%、玉米蛋白饲料 26%、棕榈仁粕 11%、谷壳粉为 16%、瓜尔豆粕 5%、玉米粉 5%、糖蜜 3、益生剂 1，其发酵饲料中粗蛋白含量为 22.48%；相对于基础日粮，酶化发酵饲料对肉鸡的干物质、粗灰分、粗蛋白、中性洗涤纤维、酸性洗涤纤维及酸性洗涤木质素的利用率分别提高 5.59 %、38

2、.31%、10.36% 、16.52 %、29.25%、18.99%，且肉鸡对酶化发酵饲料养分利用率比普通发酵饲料高。关键词： 阿魏酸酯酶；发酵饲料；抗营养因子；养分利用率中图分类号：Q 55 文献标志码：APreparation of ferulic acid esterase enzymatic fermented feed and its impact on the nutrient utilization of broilers WANG Lin-lin, CHEN Yun-hua,CHEN Pei-qin, LI Xia-lan(College of Chemical Enginee

3、ring, Huaqiao University, Xiamen, 361021, China)Abstract： In order to reduce the antinutritional factors existed in feed, promote feed conversion ratio, ferulic acid esterase enzymatic fermented feed was studied and the effect of this enzymic fermented feed on nutrient utilization of broilers was re

4、searched at the same time.The optimum feed formula obtained by orthogonal experiments:12% stipe dry matter,26% corn gluten feed,11% palm kernel meal,16% chaff powder,5% guar soybean meal,5% corn flour,3 molasses,1 prebiotic agent,the content of crude protein in this fermented feed was 22.48% under t

5、his condition.Compared with basal diet, enzymatic fermented feed increased feed nutrient utilization such as dry matter, crude ash,crude protein, neutral detergent fiber, acid detergent fiber, acid detergent lignin utilization by 5.59%,38.31%,10.36%,16.52%,29.25%,18.99%,respectively.And the feed nut

6、rient utilization 收稿日期：2014- - ；通讯作者：李夏兰(1965-)，女，博士，教授，硕士生导师，主要从事生物化工研究，E-mail: 基金项目：福建省发改委投资项目（2013-886 ） ；厦门市集美区科技计划项目（2024C 01） 。of broilers raised by enzymatic fermented feed was higher than those raised by common fermented feed.Key Words： Feruloyl esterases; Fermented feed;antinutritional fact

7、ors ;nutrient utilization 在家禽饲养上，玉米是主要的能量饲料，随着我国养禽业规模迅速发展，对饲料原料的需求日益递增，这就促使人们将工农业的废弃物，如麦糟，苹果渣，菌糠做为玉米的替代品。但当这类饲料原料在家禽日粮中含量过多时，往往会造成饲料利用率差、家禽生长不良以及环境污染等问题，从而限制了这类饲料原料在家禽日粮中的广泛应用 1。这主要是与木质纤维原料中的抗营养因子非淀粉多糖（n on-starch polysaccharides， 简 称 NSP）有关 2。 NSP 增加消化道食糜粘性，影响消化道生理及形态，影响肠道菌群，从而阻碍营养物质消化吸收，降低饲料的转化率 3

8、。降解饲料中 NSP 的方法很多，对木质纤维含量高的饲料原料进行酶化或发酵是常用的方法。发酵饲料可提高饲料的适口性，产生大量的活性益生菌，调节畜禽机体胃肠道益生菌平衡，并提高消化酶活性，促进饲料的消化、吸收和利用 5。聚糖酶、纤维素酶、木糖苷酶等在 饲 料 中 的 应 用 报 道 较 多 6,7， 但 是 关 于 阿魏酸酯酶（EC 3.1.1.73，feruloyl esterase，简称 FAE）在饲料中的应用报道较少。课题组研究发现，FAE 与木聚糖酶存在协同作用，能提高麦糟中阿魏酸（4-羟基-3- 甲氧基肉桂酸，ferulic acid，简称 FA）及低聚木糖（xylooligosacc

9、harides ，简称 XOS）的释放量，有利于麦糟的降解。在优化的工艺条件下，木聚糖酶和 FAE 共同作用植物细胞壁，FA 释放量最高可达 0.97mg/g （干麦糟） ，XOS 的释放量为 161 mg/g （干麦糟） 8。课题组将有关 FAE 的研究成果应用于饲料中，提高国内商品饲料酶降解抗营养因子的效率，又产生两种对动物具有生理活性且无毒安全的 FA 和 XOS。本文报道了 FAE 酶化发酵饲料的制备，及肉鸡饲喂 FAE 酶化发酵饲料时其养分利用率的研究结果。1 材料与实验方法1.1 实验设计选 用 20 日 龄 黄 脚 麻 鸡 ， 实 验 前 称 重 ， 将肉鸡分为 4 组，每组 5

10、 个重复，每个重复9 只鸡。实 验 组 1 为对照组（基础日粮中添加 10%菌柄） ，实 验 组 2 为基础日粮中添加 10%普通发酵饲料（仅添加益生菌剂发酵） ，实 验 组 3 为基础日粮中添加 10%FAE 酶化饲料（仅添加 FAE 酶化） ，实 验 组 4 为基础日粮中添加 10%酶化发酵饲料（添加益生菌剂发酵及FAE 酶化） 。采用地面平养方式饲养，全天光照，每天饲喂 3 次，自由采食、饮水，定时对鸡舍进行消毒清扫（每周两次） ，实 验 时间为 25 d，按正常肉鸡免疫程序进行免疫。肉鸡基础日粮标准参照NY/T33-2004 鸡饲养标准中肉鸡营养需要配制 9，见表1。表 1 肉鸡基础日

11、粮组成及营养水平Tab.1 Composition and nutrient levels of basal diets (air-dry basis)原料 Ingredients 含量 Content % 营养水平 Nutrient levels 含量 Content%玉米 corn 56.30 代谢能 ME（MJ/kg） 2) 12.34豆粕 Bean pulp 20.00 粗蛋白 CP 19.00次粉 Wheat middling 5.00 钙 Ca 0.95麦麸 Wheat bran 7.00 总磷 TP 0.63大豆油 Soybean oil 1.70 有效磷 AP 0.44玉米蛋白

12、粉 Corn protein meal5.00 赖氨酸 Lys 1.00预混料 Premix1) 5.00 蛋氨酸+胱氨酸 Met + Cys0.80合计 Total 100.00 苏氨酸 Thr 0.68色氨酸 Try 0.181） 预混料为福建厦门百穗行科技有限公司提供。Premix was provided by Xiamen Baisuihang Technology Co. Ltd 2） 代谢能为计算值。ME was a calculated value。1.2 实验材料1.2.1 主要器材：酵母粉，英国 OXOID 公司；麦糟，厦门青岛啤酒厂；麦麸，厦门海嘉面粉有限公司；蛋白胨，广

13、东环凯生物科技有限公司；葡萄糖，广东汕头西陇化工厂；硫酸，国药集团化学试剂有限公司；无水乙醇，广东汕头市西陇化工厂；盐酸，上海试剂二厂。超滤膜包Vivaflow 200（ MWCO 30 KD） ，北京赛多利斯仪器有限公司；发酵袋，郑州百益宝生物科技有限公司。1.2.2 发酵饲料原料及益生剂玉米蛋白饲料，山东滨州海星饲料厂；瓜尔豆粕，广饶六合化工有限公司；棕榈仁粕，大连镁达国际贸易有限公司；预混料，厦门百穗行科技有限公司；宝来利来发酵剂，山东宝来利来生物工程公司；杏鲍菇菌柄，福建嘉胜集团大建饲料有限公司提供。1.2.3 鸡苗黄脚麻鸡，厦门五显镇三秀种禽厂。1.2.4 肉鸡喂养实验地点和时间厦门

14、集美区仙灵旗农庄，实验时间为 2013 年 4 月-5 月。1.3 实验方法1.3.1 FAE 粗酶液的制备1.3.1.1 培养基成分和培养条件（1）菌种：黑曲霉，实验室自行筛选并保藏。（2）培养基成分：种子培养基：PDA 培养基，36，200 rpm/min 培养 2 d10。发酵培养基：麦糟晒干粉碎过 100 目筛，麦麸烘干粉碎过 100 目筛，麦糟、麦麸以 1:4 比例加入白瓷盘中并按 1:1.5 比例添加营养盐溶液，混匀， 121灭菌 30 min，接种 1.5 mL 菌液，36培养 6 d。营养盐溶液：蛋白胨 2 g，酵母粉 4 g，NaH 2PO42H2O 1.52 g，KH 2P

15、O4 1 g，CaCl 2 0.3 g，MgSO 47H2O 0.3 g，Na 2HPO412H2O 31.4 g，Na 2HPO42H2O 15.6 g，用蒸馏水定容至 1 L。1.3.1.2 制备方法发酵料中加入 8 倍体积的蒸馏水，33，180 r/min 中抽提 2.5 h，静置，用八层纱布过滤，得滤液。滤液在进口压力为 0.1 MPa、流速为 200 mL/min 及 20下超滤浓缩，得粗酶液。1.3.2 粗蛋白含量测定按GBT 6432-1994 饲料中粗蛋白测定方法 分析 11。1.3.3 粗灰分含量测定按GB/T 6438-2007 饲料中粗灰分的测定分析 12。1.3.4 发

16、酵饲料感官鉴定发酵饲料感官品质根据中国农业科学院畜牧业研究所提出的饲料感观品质鉴定标准评定 13。1.3.5 中性洗涤纤维、酸性洗涤纤维和酸性洗涤木质素测定中性洗涤纤维（neutral detergent fiber，简称 NDF）按 GBT 20806-2006 饲料中中性洗涤纤维的测定分析 14；酸性洗涤纤维（acid detergent fiber，简称 ADF）按NY_T 1459-2007 饲料中酸性洗涤纤维的测定 分析 15；酸性洗涤木质素（acid detergent lignin，简称 ADL）按 GBT 20805-2006 饲料中酸性洗涤木质素的测定分析 16。1.3.6

17、发酵饲料制备将发酵原料、益生剂、FAE 粗酶液及糖蜜，搅拌均匀，装入发酵袋中，每袋质量为1000g，室温自然发酵 7 d，定时采样检测。1.3.7 发酵饲料配方的优化选用发酵饲料中的四因素（菌柄、玉米蛋白饲料、棕榈仁粕、谷壳粉） ，各因素选择三水平，根据正交实验表设计实验。以发酵 7 d 的总蛋白为目标函数进行极差 R 分析，确定优化配方。 1.3.8 养分利用率测定挑选生长状况良好、重量相近的肉鸡作为实验对象，每组 5 个平行，每个平行 3 只，定时喂养相应饲料，自由饮水。采用四分法进行全粪收集，称重后按每 100 g 鲜样加 10%硫酸 10 mL 和 0.5 mL 甲醛溶液，密封袋口，4

18、冷存，收集 41-45 日龄肉鸡的排泄物，挑出杂物后 65烘干后，室温回潮 24 h，粉碎过 65 目。测定原料和排泄物中粗蛋白、粗灰分、干物质、NDF、ADF 、ADL 含量，计算养分利用率。 实 验 结果采用 SPSS 19.0 软件的ANOVA 进行方差分析，Duncan 法进行多重比较，各组数据以平均数标准差（meanSE）表示。2.实验结果与讨论2.1 发酵饲料配方优化2.1.2 发酵配方优化实验正交实验设计表及其实验结果见表格 1。表 2 正交实验设计及结果Tab2 The result of orthogonal experiment项目（Items）(%)实验号(Test nu

19、mber ）A 菌柄干物质 Dry matter of stipeB 玉米蛋白饲料 Corn gluten feedC 棕榈仁粕 Palm kernel mealD 谷壳粉Chaff powder四种物质比例 Proportion of four substances粗蛋白含量 Content of crude protein1 10 20 8 16 54 21.012 10 23 11 18 62 21.873 10 26 14 20 70 21.404 11 20 11 20 62 17.775 11 23 14 16 64 21.956 11 26 8 18 63 21.797 12 2

20、0 14 18 64 22.178 12 23 8 20 63 21.679 12 26 11 16 65 22.48 21.43 20.48 21.49 21.81 20.50 21.83 20.71 22.11 22.27 21.89 22.01 0.28R 1.77 1.41 1.30 1.83经极差 R 分析，发酵原料中菌柄干物质、玉米蛋白饲料、棕榈仁粕、谷壳粉四因素对发酵效果的影响大小为谷壳粉菌柄干物质玉米蛋白饲料棕榈仁粕，说明谷壳粉的添加量是影响饲料发酵的关键因素。在实验结果测定中，粗蛋白量最高的组合为第 9 实验组：12%菌脚干物质，26%玉米蛋白饲料，11%棕榈仁粕、16% 谷

21、壳粉，其发酵饲料粗蛋白含量相对最高，为 22.48%。2.1.3 饲料感官评定对表 2 中的各实验组的饲料进行感官评定，结果见表 3。表 3 正交实验中各组饲料感官评定Tab3 The sensory evaluation of feeds发酵天数 Fermentation time实验组Experimental group 1 2 3 4 5 6 7 8 9第 1d Day1 气味 Odor 酸味较淡 酸味较淡 酸味较淡 酸味较淡 酸味较淡 酸味较淡 酸味较淡 酸味较淡 酸味较淡颜色 Color 淡黄色 淡黄色 淡黄色 淡黄色 淡黄色 淡黄色 淡黄色 淡黄色 淡黄色第 2d Day2 气味

22、Odor 酒味淡 酒味淡 酒味淡 酒味淡 酒味淡 酒味淡 酒味淡 酒味淡 酒味淡颜色 Color 淡黄变暗淡黄变暗淡黄变暗淡黄变暗淡黄变暗淡黄变暗淡黄变暗淡黄变暗淡黄变暗第 3d Day3 气味 Odor 酒味重 酒味重 酒味重 酒味重 酒味重 酒味重 酒味重 酒味重 酒味重颜色 Color 淡黄色 淡黄色 淡黄色 淡黄色 淡黄色 淡黄色 淡黄色 淡黄色 淡黄色第 4d Day4 气味 Odor 酒味浓重 酒味浓重 酒味浓重 酒味浓重 酒味浓重 酒味浓重 酒味浓重 酒味淡 酒味淡颜色 Color 淡黄色 淡黄色 淡黄色 淡黄色 淡黄色 淡黄色 褐色 金黄色 淡黄色第 5d Day5 气味 Od

23、or 酸味较淡 酸味较淡 酸味较淡 酸味较淡 酸味较淡 香味淡 酸味 香味淡 香味淡颜色 Color 淡黄色 淡黄色 淡黄色 褐色 黄褐色 淡黄色 褐色 金黄色 金黄色第 6d Day6 气味 Odor 酒味 酒味淡 酒味淡 酒味淡 酒味淡 香味淡 酸味 香味淡 酒味淡颜色 Color 淡黄色 淡黄色 淡黄色 褐色 淡黄色 金黄色 褐色 金黄色 金黄色气味 Odor 酒味淡 酒味淡 酒味淡 酸味较淡 酒味淡 酒味淡 酸味较重 香味淡 香味淡第 7d Day7颜色 Color 淡黄色 淡黄色 淡黄色 褐色 淡黄色 亮黄色 深褐色 金黄色 金黄色在发酵第 7 d，第 8 组和第 9 组饲料颜色呈金

24、黄色，且有淡香气味，发酵饲料感观较好。其中酸味可能是产生酸性物质如乳酸等物质，香味可能是产生了如酯类、酚类等物质，酒味是由于发酵产生乙醇。结合 2.1.2 实验结果，选用第 9 组为发酵培养基的优化的结果。2.2 发酵饲料对肉鸡养分利用率的影响2.2.1 发酵饲料对物质利用率影响2.2.1.1 发酵饲料对 NDF 利用率的影响4142434452530354045NDF利/%利/d 利 FAE 利 利 图 1 发酵饲料对 NDF 利用率的影响Fig.1 Effect of fermented feed on NDFs utilization 由图 1 表明，四个实 验 组中 NDF 利用率都呈

25、上升趋势，但酶化发酵饲料中 NDF 利用率最大，肉鸡第 45 日龄达到 37.41%，效果最明显；其次为普通发酵饲料和 FAE 酶化饲料，分别为 36.9%、34.79%，而基础日粮利用率最小为 31.3%。这是因为酶化发酵饲料中含有益生菌分泌的木聚糖酶和 FAE，共同促进 NDF 的降解，而其他组饲料只有单独添加的益生菌或者是 FAE，导致木聚糖酶和 FAE 的协同作用弱，导致 NDF 利用率不如酶化发酵饲料。2.2.1.2 发酵饲料对 ADF 利用率的影响4142434453054050560ADF利/%利/d 利 FAE 利 利图 2 发酵饲料对 ADF 利用率的影响Fig.2 Effe

26、ct of fermented feed on ADFs utilization图 2 表明，ADF 利用率均有提升趋势，酶化发酵饲料、普通发酵饲料、FAE 酶化饲料及基础日粮中 ADF 利用率在肉鸡 45 日龄分别为 52.85、50.12%、42.56% 及 42.3%。基础日粮中由于未有益生菌和 FAE，导致测得 ADF 的利用率与其他三组相比最低。2.2.1.3 发酵饲料对 ADL 利用率的影响41424344504505605705ADL利/%利/d 利 FAE 利 利图 3 发酵饲料对 ADL 利用率的影响Fig.3 Effect of fermented feed on ADLs

27、 utilization图 3 表明，四个实验组 ADL 利用率均有提升趋势，肉鸡第 45 日龄，酶化发酵饲料中ADL 利用率最高达 63.87%，基础日粮利用率最低为 53.59%。FAE 能够协同益生菌产生的木质纤维降解酶降解木质纤维，降低 ADL 含量。2.2.1.4 发酵饲料对粗蛋白利用率的影响414243445560657075利/%利/d 利 FAE 利 利 图 4 发酵饲料对蛋白质利用率的影响Fig.4 Effect of fermented feed on crude proteins utilization图 4 表明，四个实验组都提高粗蛋白利用率，在第 45 日龄肉鸡中酶化

28、发酵饲料中粗蛋白利用率最高为 70.21%，表明该组肉鸡对粗蛋白吸收较好，其次为普通发酵饲料和 FAE酶化饲料，分别为 66.07%、 64.50%；而基础日粮利用率最小为 63.70%。由于酶化发酵饲料中含有的益生菌分泌的蛋白酶，且发酵过程产生了低聚木糖，低聚木糖又有利于益生菌的增殖，使得粗蛋白更易被肉鸡利用。2.2.2 发酵饲料的养分利用率按四分法取若干饲料样品和粪便样品，经处理后，测定各养分利用率，结果如表4。表 4 各饲料养分利用率的实验结果Tab4 Fermented feed on the impact of nutrient utilization组 别 groups指标 Ite

29、ms 基础日粮Basal dietFAE 酶化饲料FAE enzymatic feed普通发酵饲料Common fermented feed酶化发酵饲料Enzymatic fermented feed干物质（%） 71.04b2.02 73.61ab0.6 72.31ab1.8 75.01a0.92粗蛋白（%） 63.70c0.92 67.07b3.41 64.60c0.87 70.30a1.22粗灰分（%） 15.40c0.89 18.70b1.32 16.70c0.45 21.30a1.3NDF（%） 31.30b2.44 35.5ab0.9 33.70ab0.4 36.47a2.7ADF

30、（%） 40.00b1.8 49.00a2.00 41.40b1.5 51.70a0.3ADL（% ） 53.70d1.13 59.00b0.80 55.90c0.85 63.90a1.42同一行所列数据，小写字母完全不同者为差异显著（P0.05） ，大写字母完全不同者为差异极显著(P0.01)。从表 4 可知，与基础日粮相比，FAE 酶化饲料、普通发酵饲料和酶化发酵饲料均有提高干物质利用率的趋势，分别提高了 3.62%、1.79% 、5.59 %，效果较为明显，差异显著(P0.05） ；而对于粗灰分， FAE 酶化饲料、普通发酵饲料和酶化发酵饲料相对于基础日粮提高 21.43%，8.44%，

31、38.31% ，差异显著（P0.05） ；粗蛋白利用率方面，FAE 酶化饲料、普通发酵饲料和酶化发酵饲料则分别提高了 5.29 %、1.41 %、10.36%，差异显著（P0.05 ） ，本实验结果与杨道秀等 17将 FAE 及商品饲料酶“溢多酶 ”（主要含木聚糖酶、纤维素酶、淀粉酶等）添加入饲料中，试制酶化饲料饲喂肉鸡的结果类似，但本实验结果因发酵过程产生蛋白酶，其粗蛋白利用相对较高。由表 4 可知，FAE 酶化饲料、普通发酵饲料和酶化发酵饲料均能提高 NDF 的利用率，与基础日粮相比分别提高了 13.42%，7.67 %，16.52 %，差异显著（P0.05 ） ；添加 FAE 酶化饲料，

32、普通发酵饲料和酶化发酵饲料均能提高 ADF 的利用率，与基础日粮相比分别提高了 22.5 %，3.50%，29.25% ，差异显著（P0.05） 。在利用 ADL 中，FAE 酶化饲料、普通发酵饲料和酶化发酵饲料与基础日粮相比，分别提高了 9.87%、4.09% 、18.99%，差异显著（P0.05） 。可见酶化发酵饲料中的 FAE 和益生菌分泌的 NSP 降解酶能较好的提高木质纤维的利用率，提高饲料品质，促进肉鸡对养分的利用 18, 19。与杨道秀等 17的实验结果相比较，NDF 、ADF 及 ADL 利用率更高，可能原因是 杨道秀等添加的仅是木聚糖酶为主的酶制剂，其他的木质纤维酶酶活较低，

33、而本实验中添加了益生菌剂，分泌的木质纤维降解酶酶系更为丰富所致。3 小结（1）发酵饲料的优化发酵配方为：杏鲍菇菌柄的干物质含量为 12%、玉米蛋白饲料含量为 26%，棕榈仁粕含量为 11%，谷壳粉含量为 16%；玉米粉 5%，糖蜜 3、益生剂 1，其发酵饲料中粗蛋白含量为 22.48%。饲料为金黄色，有香味，评价良好。（2）相对基础日粮，发酵饲料及酶化饲料均能提高干物质，粗灰分，粗蛋白，NDF，ADF，ADL 等利用率，而酶化发酵饲料提高得最为明显，分别提升为 5.59 %，38.31% ，10.36%，16.52 %，29.25% ，18.99% 。酶化发酵饲料对肉鸡的养分利用率促进效果最好

34、。参考文献 （Reference):1 陆文清, 胡起源. 微生物发酵饲料的生产与应用J. 饲料与畜牧 , 2008, (7): 5-9.2 Ravindran V, Son J. Feed enzyme technology: present status and future developmentsJ. Recent patents on food, nutrition & agriculture, 2011, 3(2):102.3 Yu P, McKinnon J, Christensen D. Improving the nutritional value of oat hulls

35、for ruminant animals with pretreatment of a multienzyme cocktail: In vitro studiesJ. Journal of animal science, 2005, 83(5): 1133.4 郑光辉.浅析微生物发酵饲料的应用与发展前景J.河南农业,2012,(4) :50-51.5 陆文清, 胡起源. 微生物发酵饲料的生产与应用J.饲料与畜牧 , 2008, (7): 5-9.6 Choct M. Enzymes for the feed industry: past, present and futureJ. Worlds Poultry Science Journal, 2006, 62(1): 5-16.7 Sinha AK, Kumar V, Makkar HPS, et al. Non-starch polysaccharides and their role in fish nutrition A reviewJ. Food Chemistry, 2011, 127(4): 1409-1426.8 李夏兰, 程珊影, 杨道秀, 等. 阿魏酸酯酶和木聚糖酶协同降解麦糟 J. 化工进展, 2012, 31(005):1096-1102.