1、项目名称： 病毒致癌机制与干预的基础研究首席科学家： 曾益新 中山大学起止年限： 2011.1 至 2015.8依托部门： 教育部二、预期目标总体目标以鼻咽癌、食管癌为模型，结合临床与流行病学，鉴定致瘤 DNA 病毒EBV、HPV 致瘤亚型；阐明致瘤病毒与环境危险因素及宿主易感遗传背景间的交互作用机制；阐明致瘤病毒感染上皮细胞以及诱导其转化的分子机制；发现诊断与治疗的新靶点，为提高病毒感染相关肿瘤的治愈率奠定基础，有望使鼻咽癌、食管癌成为继宫颈癌之后可预防的恶性肿瘤。同时在致瘤病毒感染与肿瘤发生发展的研究领域为我国培养一批优秀人才。 五年预期目标1 鉴定与鼻咽癌、食管癌相关致瘤病毒 EBV、H
2、PV 亚型和变异体。建立致瘤病毒高效感染上皮细胞体外模型并阐明致瘤病毒亚型和变异体高效感染和诱导上皮细胞转化机制。2 阐明 EBV、HPV 与环境危险因素以及基因遗传变异交互 作用机制，为人类认识肿瘤发生发展的分子机制、治疗和干预提供理论依据。3从系统生物学角度阐明鼻咽癌、食管癌细胞内信号通路以及病毒激活导致肿瘤细胞裂解的分子机制，明确病毒感染与微环境相互作用机制，发现 34个新靶点，为发展新的治疗手段奠定基础。4利用创新的减毒活疫苗策略建构得到 EBV 疫苗株，为 EBV 免疫治疗开拓新方向。5预计在 SCI 收录杂志发表论文 80 篇以上，其中 IF5 分以上论文超过 40 篇，争取在Ce
3、ll Nature Science等顶尖杂志上发表高水平论文，申请专利 10 个。6为我国在病毒感染相关恶性肿瘤研究领域培养一批高水平创新性人才，包括培养 15-20 名博士后等青年骨干人才，5060 名博士生，50-60 名硕士生，产生百篇优秀博士论文 1-2 篇。三、研究方案1）学术思路：本项目主要的学术思路是：在鼻咽癌、食管癌高发现场前瞻性流行病学研究的基础上，抓住鼻咽癌、食管癌为感染性相关恶性肿瘤的显著特点，鉴定诱导鼻咽癌、食管癌发生发展的病毒亚型，围绕病毒、环境危险因素、宿主易感遗传背景在感染和转化上皮细胞以及肿瘤的发生发展中的作用和分子机制进行系统研究。力争在鼻咽癌、食管癌的病因学
4、、发病机制、早期干预上取得突破性进展，提出防治的新思路和新方法，使鼻咽癌、食管癌成为可早期预防的恶性肿瘤。本项目中，本团队主要通过鼻咽癌、食管癌相关的致瘤病毒亚型鉴定及致瘤病毒早期感染与转化上皮细胞的机制研究，明确高致瘤性病毒亚型与鼻咽癌和食管癌发病的关系和机制（研究内容一、四） ；基于流行病学研究获得环境危险因素与结合高通量筛选技术筛选出易感基因，研究它们与病毒交互作用机制，更好地解决遗传学、环境、病毒与肿瘤发病之间的关系（研究内容二、三）；系统地阐明病毒在细胞内信号通路调控网络及病毒激活导致肿瘤细胞裂解的分子机制，为筛选出一些具有鼻咽癌、食管癌特异性的诊断与治疗新靶点指明了方向，引导针对新
5、靶点的干预基础研究（研究内容五）。五个课题之间互相关联、互相影响，阐明致瘤病毒致癌机制，为鼻咽癌、食管癌这两种恶性肿瘤的早发现、早诊断、早干预提供实践基础和科学依据，并为提高其治愈率创造可能性。上述研究将推动 EBV、HPV 感染相关其他肿瘤的发病机制和干预研究，使人类在攻克恶性肿瘤的过程中向前迈进坚实的一步。总体的研究方案见下图： EBV、HPV 感染和转化上皮细胞的机制研究 EBV、环境危险因素、宿主易感遗传背景的协同致癌机制 HPV、环境危险因素、宿主易感遗传背景之间交互作用机制鼻咽癌和食管癌相关致瘤病毒致瘤机制及干预 鉴定鼻咽癌与食管癌相关致瘤病毒亚型和变异体 探索致瘤病毒、环境危险因
6、素、宿主易感遗传背景间在肿瘤发生发展中的交互作用机制 阐明致瘤病毒感染和转化上皮细胞机制 揭示致瘤病毒在细胞内信号通路的调控网络及致瘤病毒激活和细胞裂解机制 发现新特异靶点以及针对靶点有效的干预方式 获得创新的 EBV 疫苗研发策略并建构得到 EBV 疫苗株 食管癌相关HPV 亚型及HPV16 变异体分布与食管癌关系的分子流行病学研究 鼻咽癌致瘤EBV 亚型研究肿瘤病因肿瘤发生发展 肿瘤靶向治疗基础 致瘤病毒在细胞内信号通路调控网络研究 致瘤病毒激活和细胞裂解的机制研究 特异性靶点的发现及进行干预的基础研究 EBV 疫苗研发新策略2）技术途径： 本项目在总体目标的架构下分为 5 个主要的课题方
7、向（见课题设置） ，各课题方向的主要技术途径总结如下： 课题一：以 PCR-测序技术为主，最终发展为高通量质谱测定方法，确定 HPV亚型分布与食管癌相关关系；采用病毒全基因组深度测序技术，并发展 EBVgenome capture 的芯片测序技术，结合生物信息学分析，规模化地系统性筛选、鉴定高发区、高发人群鼻咽癌相关 EBV 亚型以及与食管癌相关HPV16 型变异体。 课题二、三：利用用高密度 SNP 芯片筛查鼻咽癌、食管癌致病基因或位点，揭示在鼻咽癌、食管癌发生发展中起重要作用的遗传变异（CNV 和 SNP） ；运用实时定量 RT-PCR（real -time RT-PCR） 、免疫印迹蛋白
8、定量（Western blot）以及免疫组织化学染色等方法，测定针对位于明确的基因编码区或调控区的 CNV（或 SNP）所处基因或所调控基因在不同基因型个体的组织（包括靶组织）中的表达差异；用生物信息学方法分析编码 miRNA 基因或区域的 CNV；定量分析正常食管或鼻咽组织中特定 CNV 和 miRNA 表达水平间的相关性；建立血清 miRNA 检测方法并用有显著个体差异的 miRNA 进行大样本量的食管癌及鼻咽癌病例-对照研究，探讨以 miRNA 作为食管癌及鼻咽癌预警或早期诊断生物标志的可能性；运用生物化学、分子生物学、转基因或基因沉默（knock-down）等手段揭示在关联研究中发现与
9、食管癌及鼻咽癌密切相关但与肿瘤发生发展功能不清楚的的基因或 miRNA 与肿瘤相关的生物学作用；在全基因组关联研究（GWAS）获得大量的遗传变异信息以及流行病学研究获得的环境危险因素基础上，利用免疫缺陷鼠移植瘤系统确定这两者与 EBV、HPV 存在交互作用，通过平皿培养、三维 Matrigel 培养、病毒载体转染以及 RNA 干扰等技术研究致瘤病毒、环境、遗传相互作用机制。 课题四：利用建立起 EBV 高效感染鼻咽上皮细胞的体外模型，采用外源性转染、shRNA 沉默以及抗体封闭等方法，鉴定潜在上皮细胞 EBV 受体（gHgLR） ；构建携带 GFP 标签的不同 EBV 亚型重组病毒，利用荧光标
10、记跟踪技术观察 EBV 感染上皮细胞过程；利用鼠疱疹病毒 68（MHV-68）和致瘤疱疹病毒从头感染的动物模型，研究病毒颗粒从细胞质膜到细胞核膜转运的分子机制；通过自噬蛋白免疫、荧光跟踪、荧光定量 PCR，研究自噬在 EBV 诱导细胞恶性转化过程中的作用；利用细胞转染技术以及已成熟的细胞内及体外转录翻译方法，揭示 HPV57 型、HPV16 型变异体致癌机制。 课题五：采用基因组芯片、MicroRNA 芯片、DNA 甲基化芯片、蛋白质组分析，研究 EBV 与鼻咽癌相关基因激活的信号通路与鼻咽癌变早期的表观遗传紊乱机制；利用信号传导途径芯片筛选，基因转染表达，改造表达基因质粒，siRNA 沉默，
11、蛋白定量测定蛋白生物化学活性的测定，以及细胞生物活性的测定，来分析研究 HPV E6 E7 对信号传导途径的作用，尤其是 NF-kB，ERK、 Akt、STAT3、和 Wnt 等途径；在 EBV 疫苗研发新策略研究中，利用细菌人工染色体基因突变的方法构建重组病毒，并利用全身发光成像技术来监测病毒在活物体内的感染并跟踪在一定时间内相同宿主体内的病毒感染。3）创新点与特色 1. 本项目以中国高发的常见恶性肿瘤鼻咽癌和食管癌为研究对象，阐明相关肿瘤的发病机制，发现预防、诊断和治疗新靶点，为提高病毒相关肿瘤的治愈率奠定基础。2. 以致瘤性 DNA 病毒为核心，从致瘤病毒、环境危险因素以及宿主遗传易感背
12、景之间交互作用的角度，更全面、更系统地阐明鼻咽癌和食管癌发生发展的分子机制，并为发现诊断与治疗新靶点提供理论依据。3. 通过对不同地区、不同来源的 EBV、HPV 进行全序列测定，进行序列比较和功能分析，鉴定鼻咽癌、食管癌相关高致瘤性病毒亚型和变异体。4. 采用课题组建立的病毒高效感染上皮细胞的体外模型，阐明致瘤病毒感染上皮细胞机制。EBV 感染上皮细胞的机制尚未得到阐明，本团队将在课题组特有的 EBV 高效感染的细胞模型基础上，筛选并鉴定介导 EBV感染鼻咽上皮细胞的受体，阐明 EBV 感染上皮细胞的机制。目前文献中较少报道 HPV 感染食管上皮细胞机制，本团队将建立 HPV 感染食管上皮的
13、三维模型并进一步研究其感染机制。5. 有关致瘤病毒感染与微环境相互作用的研究在国际上才刚刚展开，目前尚缺乏系统和深入的研究；结合本团队前期研究，本项目将明确鼻咽部微环境改变与鼻咽癌发生、EBV 潜伏感染的可能关系；筛选鉴定 EBV潜伏感染及鼻咽癌发生相关的细菌种群，为鼻咽癌的早期干预提供新线索。6. 本项目对 EBV 激活导致细胞裂解机制以及有关 EBV 免疫预防新策略进行研究，探索鼻咽癌治疗新方法。7. 技术方法创新：a. 首次运用高密度全基因组关联分析，并结合深度测序和计算生物学方法，利用鼻咽癌、食管癌高发现场的病源优势，对患者进行高通量筛查，发现鼻咽癌、食管癌易感基因。b. 建立适用于食
14、管组织的高通量 HPV 测定技术平台，技术平台将同时具有高灵敏度与特异度。高通量与特异性相结合的方法建立对了解 HPV感染规律、型别至关重要，也使得大样本横向与纵向调查成为可能。方法建立过程中所出现的问题与积累的经验对各部位 HPV 相关研究具有重要借鉴意义。c. 建立起的致瘤病毒高效感染上皮细胞体外三维模型，为将来深入研究提供平台。4）取得重大突破的可行性分析：1、科学假设上的可行性。本团队在国际上率先完成鼻咽癌相关 EBV 的全基因序列测定，发现了EBV-LMP1 作用的新机制并提出了 EBV LMP1 介导的信号转导网络模式图；定位了鼻咽癌遗传易感基因、发现系列易患性基因。在食管癌研究方
15、面，本团队的大型病例对照研究明确提示 HPV 感染是食管癌发生的危险因素。尤其重要的是在食管癌组织中不仅存在 HPV DNA 感染，同时存在 HPV 癌基因 E6、E7 的表达，提示 HPV 感染与食管癌变的直接联系；发现多个基因的多态性与食管癌的易患性有关，其中包括细胞死亡通路关键基因、炎症相关基因、DNA 修复和细胞周期控制基因，并且证明与吸烟等环境因素存在交互作用。这些研究工作为本项目的深入研究打下坚实基础。2、资源上的可行性。本团队首先在广州、中山、四会三地建立了鼻咽癌高发现场，对广东省鼻咽癌高发区近 10 万人群进行长达 15 年的前瞻性研究，因此具有扎实的现场研究基础。本团队依托的
16、华南肿瘤学国家重点实验设有专门的标本库，有专人管理和维护，临床资源丰富。在食管癌高发区河南安阳地区本团队建立随访现场，进行每两年一次的 HPV 感染与食管癌及其相关癌前病变进展的随访监测。截至目前，已完成第一个时间断面的基线人群问卷调查和生物学样本采集，基线调查样本量为 8000 余人，收集该人群各类生物样品 4 万多份。更重要的是，通过前期病例对照研究与队列研究的基线调研，本团队柯杨课题组与现场各级相关行政部门、当地群众建立了互相信任、互相支持的良好合作关系。3、技术上的可行性。本团队单位实验室具备充足的实验条件完成本项目，拥有系统的肿瘤发生发展相关的信号转导通路研究平台、蛋白质分析、蛋白质
17、大规模纯化与复性技术平台；已建立完善的三维细胞培养平台、形成了技术可靠的分子遗传学、分子病毒学、细胞生物学、分子药理学实验技术平台；已建立了成熟的 RNA 干扰技术以及小鼠荷瘤动物实验模型；具有信号通路研究基础和技术平台；分子相互作用与新药筛选技术平台；生物信息学及结构模拟技术平台、组织芯片研究平台。4、人才上的可行性。本项目以曾益新院士牵头，课题负责人均是从事鼻咽癌、食管癌研究工作、活跃在鼻咽癌、食管癌研究工作的中青年学术带头人，对于鼻咽癌、食管癌的研究具有非常丰富的经验。学术骨干包含肿瘤病毒学、肿瘤分子遗传学、肿瘤细胞生物学和信号转导等研究领域第一线中青年学术主力军，体现了学科的交叉和有机
18、融合。课题设置1) 课题设置的思路本研究项目从发现和鉴定与我国常见感染相关恶性肿瘤鼻咽癌与食管癌的致瘤病毒亚型出发，分别从环境危险因素、宿主易感遗传背景这两方面研究和相关致瘤病毒亚型的相互作用机制，并阐述致瘤病毒亚型感染和转化上皮细胞机制，以及揭示致瘤病毒在细胞内信号通路的调控网络及致瘤病毒激活和细胞裂解机制，在上述基础上发现诊断和治疗新靶点进行干预的基础研究，为提高致瘤病毒相关肿瘤的治愈率、降低发病率奠定基础。课题的设置围绕这一学术思路展开，分为 5 个分课题：（1）鼻咽癌与食管癌相关致瘤病毒亚型和变异体研究；（2）EBV、环境和遗传的交互作用在鼻咽癌发病中的研究；（3）HPV、环境和遗传的
19、交互作用在食管癌发病中的研究；（4）致瘤病毒感染和转化上皮细胞的机制研究；（5）致瘤病毒及细胞内信号通路靶向治疗的基础研究。课题的设置主要考虑当前肿瘤领域的研究重点和发展趋势，并结合我国常见恶性肿瘤诊治水平提高的需要。所设置的 5 个分课题从不同角度研究致瘤病毒与肿瘤发生发展的关系。课题一将全面识别、筛选和鉴定鼻咽癌与食管癌相关 EBV、HPV 亚型。课题二与课题三将探索致瘤病毒 EBV 和 HPV、环境以及宿主遗传因素的交互作用，阐明鼻咽癌、食管癌发病机制。课题四将阐述致瘤病毒感染正常上皮细胞的途径、受体及其协助因子，以阐明其感染机制，及其感染细胞后，诱导细胞恶性转化机制以及与微环境相互作用
20、机制。课题五将进行致瘤病毒及细胞内信号通路靶向治疗的基础研究。本团队长期从事肿瘤及病毒的研究，并已取得一系列重要的研究成果，具有极大可能在致瘤病毒相关恶性肿瘤的研究领域取得突破性进展。2) 各课题研究内容及其与项目预期目标的关系本项目共设五个课题，各课题间息息相关，形成了一个有机的网络。课题一鉴定与鼻咽癌、食管癌相关致瘤病毒亚型和变异体与课题四研究致瘤病毒感染与转化上皮细胞以及病毒感染与微环境相互作用的机制，为阐明致瘤病毒的致瘤机制奠定基础；课题二和三从致瘤病毒、环境、宿主遗传背景交互作用的角度研究在鼻咽癌、食管癌发生发展中的机制；课题五从致瘤病毒在细胞内信号调控网络、病毒激活导致细胞裂解机制等方面揭示致瘤病毒致瘤机制，以及基于机制研究基础上发现新靶点并进一步针对新靶点的进行干预基础研究。总体说来本团队在这样一个不断探索的过程中获得的研究成果和发现，将为解决本项目的科学问题，为以后临床转化奠定基础。五个课题是预期目标的有机组成部分，其相互关系如下图所示：课题五：致瘤病毒致癌机制课题一：致瘤病毒亚型及变异体鉴定课题四：致瘤病毒感染和转化上皮细胞机制课题二、三：致瘤病毒、环境因素、宿主遗传背景交互作用机制细胞内信号通路、病毒激活导致细胞裂解机制研究靶点发现及干预的基础研究
