国家重点基础研究发展计划(973计划)项目申报书-感音神经性聋发病机制及干预措施的基础研究.doc

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资源描述

1、项目名称: 感音神经性聋发病机制及干预措施的基础研究首席科学家: 李华伟 复旦大学起止年限: 2011.1至 2015.8依托部门: 教育部 上海市科委二、预期目标本项目的总体目标:本项目以人类最常见的感官或功能缺陷性疾病感音神经性聋为研究对象,围绕“毛细胞和螺旋神经节神经元损伤机制、保护措施及听觉功能重建”这个感音神经性聋防治的关键科学问题,阐明遗传、环境及老化等因素所致感音神经性聋的机制,探索新的感音神经性聋干预措施,降低常见感音神经性聋的发病率,为提高我国常见感音神经性聋的早期诊断和治疗水平提供实验依据。总体提高我国在感音神经性聋的基础研究和临床防治研究的国际竞争力。五年预期目标:1.

2、阐明遗传、环境和老化等因素导致感音神经性聋的机制及各种有害因素在致聋机制中的相互作用;2. 为建立规范化的遗传性聋产前诊断和老年性聋早期分子诊断技术及预防体系提供实验依据;3. 建立耳蜗毛细胞和螺旋神经节神经元的保护措施及干预感音神经性聋的生物学技术和理论;4. 培养一批我国具有国际竞争力的优秀听觉医学研究人才,以六个课题单位为基地,预计培养国家杰出青年科学基金获得者、教育部“长江学者特聘教授”和中科院“百人计划”入选人才共3-5 名;教育部“新世纪人才计划”6-8 名。培养一批优秀的博士后、博士研究生和硕士研究生。5. 在国际重要杂志发表 IF5.0 的论文20 篇以上,IF10 的论文5

3、篇以上,IF20的论文1 篇以上。6. 争取获得 1-2 项国家级科技进步奖。三、研究方案1)学术思路:本项目围绕“毛细胞及螺旋神经节神经元损伤机制、保护措施及功能重建”这个感音神经性聋防治的关键科学问题,探索感音神经性聋的发病机制及有效的干预措施,研究重点是揭示重度感音神经性聋的发病机制、病理生理过程及生物学干预策略。毛细胞及螺旋神经节神经元损伤机制:研究遗传、环境(感染、噪声、耳毒性药物)及老化等因素所致毛细胞及螺旋神经节神经元损伤的致聋机制,发现遗传性聋相关的新致聋基因,研究我国常见致聋基因的功能及耳蜗损伤机制;研究遗传因素与环境因素在耳蜗毛细胞及螺旋神经节神经元损伤中的相互作用,探索老

4、年性聋的发病机制。遗传、老化因素所致毛细胞及螺旋神经节神经元的早期诊断:在致聋机制研究的基础上,研究遗传性耳聋产前分子诊断及老年性聋分子诊断技术与理论,为建立感音神经性聋的防控体系提供依据。毛细胞及螺旋神经节神经元损伤保护及功能重建:建立安全有效的耳蜗基因转染技术,探索保护耳蜗毛细胞免于损伤的抗凋亡等理论与技术;探索转基因策略修复基因缺陷所致耳蜗毛细胞损伤的机制;采用声刺激诱导植入耳蜗的经过基因修饰的干细胞定向分化,研究植入干细胞定向分化为毛细胞及螺旋神经节神经元的分子机制,探索细胞替代策略重建听觉功能的有效途径;通过调控细胞周期因子激活耳蜗毛细胞再生,鉴定再生毛细胞的功能,为细胞再生途径重建

5、听觉功能提供理论依据。通过本项目的系统研究,以期阐明我国常见感音神经性聋的发病机制及病理生理过程,为建立遗传性聋产前诊断和老年性聋分子诊断技术奠定基础,探索耳蜗毛细胞保护和听觉功能重建生物学技术,为提高我国感音神经性聋的防治水平提供理论依据。2)技术途径:参考下列技术路线示意图。1. 遗传性聋相关新基因识别及其功能的研究1) 耳聋相关新基因发现及功能鉴定:用我们课题组收集的遗传性耳聋家系资源,运用大家系连锁定位分析,全基因组关联分析,基因功能性克隆等策略在耳聋患者样本中发现新的耳聋基因及新突变位点;在斑马鱼和小鼠的干细胞阶段上调或下调新发现耳聋基因,观察两种模式动物耳蜗和听力发育情况,研究新发

6、现耳聋基因的功能。2) 遗传性耳聋基因型和听力表型的相关研究:联合耳聋基因筛查与听力筛查,通过对多种聋病表型(如耳聋发病时间、听力损失程度、受环境因素影响等)的归类研究建立不同遗传性耳聋的基因型-表型关联联系。3)研究遗传性聋规范化产前诊断技术:以母体外周血胎儿细胞分离与胎儿DNA富集为研究重点,开发非创伤性产前诊断技术;结合产前诊断需求和高通量基因筛查技术平台,研究并初步建立规范性聋病产前诊断体系,对其模式、效果进行评估。2. 我国常见耳聋相关基因致聋机制的研究1)遗传性聋相关基因表观遗传学研究:采用芯片技术系统观察遗传感音性聋耳聋相关基因DNA 甲基化、微小RNA、组蛋白乙酰化和甲基化变化

7、,在更多的样本中运用MassArray 技术高通量验证这些变化发生的比率。针对研究中发现的表观遗传学变化的基因,将它们分别和组合地在耳蜗干细胞中下调或上调,观察相应靶基因和信号通路的变化,以及耳蜗干细胞的分化情况。2)常见耳聋相关基因致聋机制:应用RNAi 技术、锌指核酶技术、精原细胞注射技术和转基因技术,研究我国常见耳聋相关基因(Connexin 基因、EVA 相关基因SLC26A4 和Foxi1 等)突变所致耳蜗内环境平衡紊乱的机制及毛细胞功能障碍。3)转基因技术纠正遗传缺陷所致耳聋的实验研究:(1) 干预Connexin 基因突变导致耳聋的实验研究。转染野生型Connexin26 或30

8、 基因修复Cx26 及Cx30 突变鼠耳蜗损伤。(2) 干预EVA 的实验研究。以EVA 耳聋动物模型SLC26A4-/-基因敲除小鼠为对象,针对SLC26A4 、 FOXI1、 KCNJ10 三个靶基因进行基因纠正的实验研究。3. 耳蜗毛细胞损伤及保护机制的研究1)耳蜗损伤机制研究:以毛细胞和螺旋神经节神经元线粒体为核心,观察不同环境因素作用下毛细胞及螺旋神经节神经元死亡形式及相关信号途径的活化,研究耳蜗毛细胞及螺旋神经节神经元凋亡途径。(1) 线粒体MPTP 状态与耳蜗损伤的关系:检测线粒体膜电位及环境因素作用下线粒体MPTP 亚单位基因的表达;(2) 毛细胞损伤过程中氧化应激反应与耳蜗损

9、伤的关系:检测环境因素作用下内耳自由基及氧化应激相关基因的表达;(3) 内耳miRNA 的表达及其对线粒体相关基因、凋亡基因及毛细胞功能的影响。2) 毛细胞保护措施实验研究:(1) MPTP 亚单位配体对线粒体 MPTP 开启的调控及 Bif-1 表达对毛细胞的保护作用。(2) 调控氧化应激反应与毛细胞损伤保护,以及抗凋亡基因XIAP 耳蜗局部转染对耳蜗毛细胞及螺旋神经节神经元的保护作用。(3) RNA 干扰对毛细胞及螺旋神经节神经元损伤的保护作用。(4) 研究安全、有效、便于临床应用的耳蜗局部给药途径。4. 老年性聋发病机制及预防措施的研究1)老年性聋模型耳蜗毛细胞及螺旋神经节神经元损伤机制

10、研究:(1) 我们已经建立了大鼠CD 老年性聋大鼠模型,研究大鼠 CD 模型对环境因素易感性,针对易感基因测序,发现新的核基因和线粒体基因突变。(2) 研究各模型(CD 大鼠,C57BL/6 小鼠和DBA/2J 小鼠)内耳酶功能及神经生理学改变。(3) 以线粒体基因组为核心,研究核基因和线粒体基因相互作用的机制及发现新的基因突变;研究调控蛋白质输入及抗氧化剂对线粒体缺失大鼠模型耳蜗损伤的保护机制;研究mtDNA-4834bp 缺失模型中相关氧化磷酸化在耳蜗毛细胞损伤中的作用及其机制;(4) 建立CD 缺失的边缘细胞及螺旋神经节细胞系,研究老年性聋相关基因及抗衰老基因与CD 的相互作用及机制。2

11、)研究老年性聋早期分子诊断技术:根据研究内容1)的研究结果,筛选老年性聋的易感基因,经过临床收集的老年性聋资料验证,探索老年性聋的早期分子诊断技术及理论依据。5. 声刺激诱导耳蜗植入干细胞分化机制的研究1)基因修饰胚胎干细胞及诱导性多潜能干细胞分化为毛细胞的实验研究(1) 将构建的pax2-IRES-math1-EGFP 基因修饰的干细胞经鼓阶移植到毛细胞损伤的动物模型耳蜗,利用声刺激诱导移植细胞定向分化后,用免疫组化及电镜技术鉴定细胞分化情况。(2) 采用膜片钳技术结合FM1-43 荧光染色技术鉴定干细胞源毛细胞的功能。以膜片钳技术检测EGFP 阳性的干细胞源毛细胞电生理特征,并用毛细胞标志

12、物标记确认毛细胞,结合毛细胞离子通道特征、毛细胞换能和适应性及非特异性离子通道鉴定干细胞源毛细胞的功能。2)定向诱导干细胞分化为螺旋神经节神经元(1) 将螺旋神经元损伤的动物模型在干细胞移植后分为两组,分别接受60 dB和90 dB SPL 白噪声刺激,应用听力学技术检测实验动物听力恢复情况;采用荧光金标记技术观察分化神经元轴浆转运及纤维投射,用免疫组化和分子生物学技术检测移植后信号分子及神经营养因子的表达情况,观察移植细胞迁移及移植后细胞向神经元分化的比例和表达神经递质的情况,评估不同强度声刺激对移植细胞分化、迁移的影响及其分子机制。(2) 采用膜片钳结合免疫组化技术对具有神经元标志物的移植

13、细胞在荧光显微镜下行单细胞的电生理研究,检测移植细胞分化的螺旋神经节神经元电生理特征。6. 激活耳蜗毛细胞再生的研究1)调控细胞周期因子激活耳蜗毛细胞再生:构建Ad.raf-1-IRES-EGFP 病毒载体,研究转基因技术过量表达raf-1 基因在体外毛细胞损伤模型上诱导耳蜗感觉上皮细胞再生情况;研究耳蜗再生细胞分化为毛细胞和支持细胞的能力以及过量表达raf-1 基因后耳蜗残存细胞Rb 基因表达,并检测pRb 蛋白表达及其磷酸化情况,研究毛细胞再生的机制。2)同时转染激活前体细胞增殖和促毛细胞分化基因激活毛细胞再生:采用已构建的Ad.pax2-IRES-math1 腺病毒载体,观察过量表达Pa

14、x2 及Math1 基因对成年鼠耳蜗支持细胞增殖和分化的影响,试图过量表达Pax2 激活支持细胞增殖,同时在增殖细胞中表达Math1 诱导增殖细胞向毛细胞分化,从而诱导成年鼠耳蜗毛细胞再生。3)再生毛细胞功能鉴定:采用膜片钳技术结合FM1-43 荧光染色技术鉴定再生毛细胞的功能。结合毛细胞离子通道特征、毛细胞换能及适应性和非特异性离子通道的实验结果鉴定再生毛细胞功能。3) 创新点与特色:1. 围绕“毛细胞及螺旋神经节神经元损伤机制、保护措施及功能重建”这个感音神经性聋防治的关键科学问题,对我国感音神经性聋的发病机制及有效的干预措施开展具有世界前沿水平的研究;2. 在研究内容和思路上,从核酸、蛋

15、白、细胞及耳蜗结构等不同层面,针对我国常见感音神经性聋的发病机制展开研究,阐明遗传因素、环境因素(噪声、耳毒性药物、感染等)和老化因素导致感音神经性聋的途径及其相互作用机制,建立有效的耳蜗毛细胞和螺旋神经节神经元保护措施和探索生物学重建耳蜗功能的途径。致聋机制研究和有效的干预措施研究并重,通过机制研究的结果为干预措施提供依据;3. 在研究策略上,采用基础研究结合临床研究的策略,重点研究关键的科学核心问题,为建立我国常见感音神经性聋的早期诊断、有效的预防及生物学干预措施提供理论依据;4. 在临床资源上,课题组单位有3 个国家耳鼻喉科重点学科、一个卫生部听觉医学重点实验室及一个卫生部新生儿听力筛查中心(已建立全国新生儿听力筛查网络),我们已经拥有了庞大的感音神经性聋家系的DNA 样本库。

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