1、项目名称： 基于微纳制造的第三代基因测序系统的基础理论研究首席科学家： 易红 东南大学起止年限： 2011.1至 2015.8依托部门： 江苏省科技厅二、预期目标【总体目标】项目围绕“基于微 纳制造的第三代基因 测序系统的基础理论研究” 开展研究，以微纳制造为基础，以微纳 流体动力学的基础理论研究为核心，以单碱基电信号提取与辨识为最终目标，开展 5 个课题的研究工作。总体目标为：在微纳制造方面：挑战现代制造技术的极限，实现 5nm 以下的三维纳通道高精度、可重复的集成制造，制造精度小于 1nm；在微纳流体动力学方面：建立、验证纳尺度下 DNA 聚合物链的流体动力学模型，检验基于连续体假设的经典
2、流体动力学模型在纳尺度下的适用性；在单碱基电信号提取与辨识方面：以单碱基电信号提取与辨识为目标：研究生物大分子物理信息获取的机制，揭示电信号频率谱特征与电子传递之间的关系原理，建立电信号与分子结构之间的数学模型，在此基础上，构建 DNA测序系统，实现单一纳米孔检测大于 10K 序列直接测定。【五年预期目标】本项目是多学科交叉，研究内容涉及微纳制造、微 纳流体力学、生物 电子学、信息科学、生命科学以及物理、表面化学等多学科的研究内容。通过多学科交叉和各研究课题有所侧重，争取在以下几个方面取得具体突破：1、在基于 TEM 微纳制造方面，利用聚焦离子束和电子束沉积技术作为主要手段，分别对硅基、碳基薄
3、膜材料进行纳通道制造，辅以原位反馈技术和相关实验条件控制，实现径向尺寸和轴向尺寸均在 5 纳米以下的硅基纳通道跨尺度的集成制造；利用高分辨的成像技术，对材料加工过程中缺陷的产生和形成过程进行全程实时监测，探索材料结构变化尤其是界面结构变化的规律，结合理论模拟对其变化规律给出合理的解释，建立纳米精度加工条件下的加工机理与理论依据；对材料在加工前后的力学性能进行测量与表征，研究纳米加工、结构尺寸效应对材料力学性能的影响，探讨实现纳米加工、改性的有效方法，总结加工过程中的新规律。2、在基于玻璃基纳米孔的跨尺度制造方面，在理 论上，建立 纳尺度下熔融玻璃管拉制成型的数学模型，研究纳尺度熔融玻璃管在拉制
4、过程中的结构形状变化规律；研究不同应力载荷下熔融玻璃结构应变响应；研究不同的降温过程条件下，纳尺度玻璃凝固成形规律；在实验方面，提出自上而下加工与局域处理融合的工艺方式，实现玻璃基 纳米孔跨微纳尺度制造。3、纳尺度下生物溶液的流变行为的研究， 这部分工作是流体动力学的基础性工作，对流体动力学润滑、生物摩擦学都具有重要的理论意义， 项目组将基于表面力仪研究受限空间内盐溶液、生物溶液的流变特性以及 DNA 聚合物链、固体表面双电层的性质。4、在生物分子在纳通道中的输运及调控方面， 发展多尺度数学模型，建立DNA 分子输运与通道调制电流之间的内在对应关系，结合实验测试，对理论模型进行验证与改进；研究
5、对生物分子在纳通道中输运的主动调控方案，包括光诱导介电泳、流体场效应管等，探索纳通道中 DNA 分子迁移速率的调控机理，增加信号驻留时间。5、在纳通道中生物分子信号的超灵敏检测方法与原理的研究方面，建立超灵敏、多模式检测方案，对微、纳通道流路的尺寸进 行优化，有效去除信号噪声，提高信噪比；基于生物分子在纳通道内输运规律的数学模型，建立生物分子结构特征与调制电流的统计对应关系。6、基于纳通道的生物分子传感器的集成与测试，完成标定所研制的纳流体传感器；用其检测-DNA 片段在纳米通道中的迁移率，达到目前生物传感器的技术指标，能 够对 DNA、蛋白质分子的传输进行检测；能够实现再测序(reseque
6、ncing) 或从头测序(de novo sequencing)。【考核指标和人才培养计划】1、人才培养：预计培养国家教育部“长江学者奖励计 划”岗位或讲座教授 23 名，中科院“ 百人计划” 入选人才 1 名，国家杰出青年科学基金获得者 23 名。培养博士后 510 名，博士生 35-40 名， 硕士生 60 名。2、量化考核指标：预计 5 年内在国内外发表有影响力的研究成果，具体考核指标是指高影响因子 SCI 源刊（ IF 大于 10 以上及本专业顶级期刊）发表学术论文 10 篇，在国际相关领域有 较高影响力的学术期刊发表论文 30 篇。国家发明专利受理或授权 5 项左右。三、研究方案【学
7、术思路】本项目属于微纳制造与生命科学的交叉，面向第三代基因测序仪的研制，系统地开展微纳制造、微纳流体动力学和超灵敏单分子检测的基础理论、关键问题的研究，研制出具有自主知识产权的第三代基因测序仪的原型器件，推动我国科研重大装备的国产化进程。因此，整个项目的研究工作分为三个方面，如 图 1 所示，通过这三个方面的研究工作，最终研制出第三代基因测序的原型器件。图 1、研究工作的整体框图（1）、以 5nm 以下纳米孔跨尺度制造为目标，研究不同加工条件下，纳米孔结构成型原理、高能束流作用下微纳米结构动力学响应、热响应和结构稳定性，推动微纳制造向高精度、可重复、批量化方向发展。项目以单个碱基辨识为目标牵引
8、，开展纳米孔结 构成型的跨尺度制造方法，研究高能束辐照下高能束、特种能场和微纳米结构材料的相互作用机理，这包括高能束流作用下材料的温度场、应力场、应变场的测试、控制方法及演 变规律；高能束流制造 过程中和过程后，材料组织结构的演变及其性能相关性。在玻璃基纳米孔研究方面，基于 纳米步进直线型超声电机驱动和控制的进给系统，实现对熔融玻璃高精度拉制，探讨不同应力状态下熔融玻璃结构的应变响应和不同温降速率条件下玻璃凝固成形规律，给出玻璃基纳米功能结构的跨尺度制造方法和机理。最后， 总结不同加工手段的加工规律，寻找纳结构的跨尺度制造的新方法、新原理和新工艺， 为微纳流体器件的研制奠定物质基础。（2）、以
9、建立 DNA 聚合物链在纳米孔内的输运规律为目标，研究纳尺度下流体的流变特性、结构尺度效应、表面效应对纳通道下离子输运、生物分子输运规律的影响。项目以实现 生物分子输运的主动控制为目标，建立、 验证纳尺度下 DNA 聚合物链的流体动力学模型， 检验基于连续 体假设的经典流体动力学模型在纳尺度下的适用性；发展新原理、新方法 测试纳尺度下流体的流变参数和表面电势，将流体动力学的研究拓展到 纳流体动力学和聚合物纳流体动力学，发展和丰富人们对流体动力学在微观层次的认知。（3） 、以单碱基电信号提取与辨识为目标：研究生物大分子物理信息获取的机制，揭示电信号频率谱特征与电子传递之间的关系原理，建立电信号与
10、分子结构之间的数学模型，在此基础上，构建 DNA 测序系统，实现单一纳米孔检测大于 10K 序列直接测定。通过构建多维、多模式检测的实验方案，包括基于场效应管原位信号放大原理、微 电容变化检测及隧穿电流信号检测等多种检测模式；通过多相位的分子检测系统，以实现检测信号的多元化，提高检测容量，增 强检测体系的分辩率与区分度；通过不同检测模式的交叉分析，实现对单个碱基辨识。【技术途径】根据上述的总体思路，本项目首先从纳米孔的跨尺度制造出发，研究多种类材料的纳米孔成型原理和方法；在此基础上，通过聚合物流体动力学建模，研究生物分子与纳米孔作用下， 对溶液中离子电流的调制，探讨微弱电信号的超灵敏检测方法；
11、建立生物分子结构与调制电流信号的统计对应关系；发明多模式的检测方案，建立基于纳米孔的 DNA 单碱基超灵敏检测 方案；在原型器件研制的基础上，进 行跨微纳尺度制造工艺优化、微 纳结构尺寸 优化、 检测方案优化，建立第三代基因测序仪的设计、制造原理与方法，研制出第三代基因测序仪的原型系统。具体技术途径如下：（1）、在 5 纳米以下的纳米孔制造方面，我们已掌握原位高压纳米加工手段，即：基于透射电子显微镜技术，利用电子辐照加工技术，独创性地建立了温度可控条件下，实现原位高 压加工与动态表征的新方法，利用直观观察加压前后晶格间距的不同，使人们能 够在最小的尺度上研究纳米材料的各种新现象、新规律。我们
12、将利用透射电镜中的电子束作为纳米加工工具，分别对各种碳纳米材料（碳洋葱、碳纳米管、石墨烯等）、硅基材料（ Si，SiO2，Si3N4 等薄膜材料）进行基本的纳米加工工艺研究，如原子剥离、纳米钻孔、纳 米切割与焊接等，最终与聚焦离子束加工和在线沉积技术相配合实现碳基、硅基纳通道跨尺度的集成制造；利用高分辨的成像技术，对 材料加工过程中缺陷的产生和形成过程进行全程实时监测，分析被加工材料结 构变化尤其是界面结构变化的规律，结合理论计算与计算机模拟对其变化规律给出合理的解释，建立纳米精度加工条件下的加工机理与理论依据；利用纳米单体原位测量系统（配有透射电镜上专用的 STM TEM样品架 ），对材料在
13、加工前后的力、电性能进行原位 测量与表征，研究 纳米加工对材料的性能的影响，探讨实现纳米加工改性的有效方法，发现及解释加工过程中的新现象、新规律。（2）、在玻璃基纳米孔跨尺度制造方面，我们的思路是采用玻璃材料实现纳米孔的制造：在硅基材料纳米孔制造中，一般在纳米薄膜材料上构造出纳米孔，纳米薄膜对基体的黏附强度、纳米薄膜的结构强度都影响器件的使用寿命，如果能在玻璃基材料上实现微、 纳米孔的跨尺度制造， 则 材料单一，并且微 纳米孔结构一体化能够满足结构强度的要求，我们目前纳米孔的尺度能做到 100nm，通过本项目的研究，我们将基于 纳米步进直线型超声电机驱动和控制的进给系统，实现对熔融玻璃高精度拉
14、制，制造出具有纳米尖端的玻璃锥形通道，再对纳米尖端进行局域处理，实现纳米尖端尺寸满足纳米孔特征尺寸要求，从而实现 5nm 以下纳米孔的跨尺度制造。通过对纳尺度下熔融的中空玻璃管拉伸凝固过程的理论与实验研究，探讨不同应力状态下熔融玻璃结构的应变响应和不同温降速率条件下玻璃凝固成形规律，给 出玻璃基纳米功能结构的跨尺度制造方法和机理。（3）、在微纳流体动力学的建模方面，研究 DNA 聚合物链在纳尺度下的运动规律以及溶液浓度、壁面电荷密度、外电场作用下对 DNA 聚合物链空间形态的影响。这个工作不仅是微纳流体器件研制的基础，也是生命科学的基础性工作，同时对纳米流体动力学的基础理论研究也具有重要的理论
15、意义。本项目在分子动力学、蒙托卡洛模型的研究方面具有较好的工作基础。我们在过去的工作基础上，发展粗粒化分子动力学模拟方法，考 虑 DNA 分子的全局特征，包括分子长度、序列和第二结构等，结合纳通道几何尺度、外加电场力、DNA 与通道壁面相互作用、溶液离子浓度等环境参数，研究 DNA 分子在纳通道内的输运规律；在粗粒化分子动力学模拟的基础上，发展多尺度数学模型，建立 DNA 分子输运与通道调制电流之间的内在对应关系，结合实验测试，对理论模型进行验证与改进。在理论建模的基础上，研究和探讨纳通道中 DNA 分子迁移速率的 调控方法和调控机理，延长 DNA 聚合物 链的过孔时间。 这些问题的解决将为纳
16、通道生物传感器的设计与优化提供理论指导。（4）、在微弱电信号检测方面，我们拟建立超灵敏、多模式检测方案，对微、纳通道流路的尺寸进行优化，有效去除信号噪声，提高信噪比。纳米孔用于基因测序的最大障碍在于核酸分子过孔速度与过孔信号检测两个方面。过孔速度与基因序列测定效率明显相关，根据其它小组研究结果，核酸过孔的速度使用了磁镊、光镊及纳米颗粒、溶液粘度来降速。本 项目的研究是提高 检测仪器的频率响应速度及降低环境噪音等来提高检测效率，同时在多相检测信号下建立模式识别。另一方面，在一定电压差的情况下，分子快速运动有利于减少分子振荡带来的检测信号不稳定、单一碱基过孔速度差异巨大的弊端，由于快速过孔效应，核
17、酸与孔壁之间的充放电现象造成的影响也会大大降低。我们将在过去工作的基础上，将着重解决以下几个问题：（1）过孔核酸与纳米孔间形成高频多相位弱信号检测及其模型的建立；（2）纳米孔中的分子组装及表面处理，以有效降低系统噪音；并可形成稳定的固有电容，利于碱基识别的数学模型的建立；（3）侧向近孔纳米电极的制作，及固有噪音的抑制；纳米孔电子噪音模型的建立及其在信号检测中的应用；（4）基于生物分子在纳通道内输运规律的数学模型，建立生物分子结构特征与调制电流的统计对应关系。【创新点】本项目面向第三代基因测序原型系统的研制，系统地开展微纳制造、生物分子在纳通道内的输运和超灵敏单分子检测的基础理论、关键问题的研究
18、，可望在以下三方面产生创新性成果：（1（ 通过对微纳制造的基础理论、关键工艺与关键设备的研究，实现 5nm以下三维纳米孔的跨尺度制造，突破现代制造的极限，可望在纳结构成型、多种类材料跨微纳尺度制造方面取得突破。我们在碳基、硅基纳米孔的跨尺度制造方面，利用我们已掌握的原位 电子束辐照纳米加工手段实现对这两类材料纳米孔的加工。尤其在碳基纳米孔的加工方面，将采取高温下电子辐照诱导的纳米加工方法，该 方法创新性的结合了 电子辐照效应与高温退火效应的双重效果，使得在进行纳米孔结构加工的同时保持孔周边膜结构的完整性。目前基于透射电子显微镜利用电子束进行纳米孔加工时，基本是在室温下开展，由于在进行孔加工和观
19、测过程中，电子束不可避免的将辐照到整个膜结构，使得纳米孔周边的膜结构受到辐照损伤，从而将大大降低其力学性能。我们提出的方法，将在电子辐照效应与高温退火效应有效结合的基础上进行，即保证了纳米孔的高精度加工，又保证了孔周边结构的完整不受破坏，从而满足对其较高力学性能的要求。在精度控制方面，利用我们已掌握的原位高压纳米加工手段和基于反馈控制的薄膜生长工艺，可以 实现精确的纳米加工，加工精度能够控制在 1nm 以下，从而实现对这两类材料纳米孔的微纳制造。（2（ 在玻璃基纳米孔的加工方面，本项目提出在玻璃基上进行跨微纳尺度制造，基于纳米步进直线型超声电机驱动和控制的进给系统，运用自上而下的熔融玻璃拉伸的
20、微纳加工方法与用纳米级局域化处理方法相结合，以此构建固态纳米孔跨微纳尺度加工的新原理、新工艺，具有原始创新性。该制造方法能有效降低制造难度和成本，提高结构稳定性。目前大部分固态纳米孔的制备，都是基于固态薄膜材料进行，由于薄膜材料特性限制， 导致其制造成本高，力学结构稳定性差，噪音影响大；我们提出的制造方案，能够实现材料的单一化（璃材）和结构一体化，因此，结构稳定性高、寿命 长和噪音信号小。（3（ 有望发现纳尺度下流体动力学、聚合物流体动力学的新现象、新规律：在前期工作中，我们发现对于同样的盐溶液， 纳 米尺度下的限制效应会诱导出宏观条件下不会出现的壁面电荷倒置的现象，其次，宏观条件下边界层效应
21、可以忽略不计，但在纳尺度下，双电层的重叠和边界层 内溶液、离子的分 层结构对纳尺度下离子通道、蛋白质输 运会产生决定性的影响。另一方面， 纳通道内溶液本身的流变特性也会发生变化，目前，由于实验数据的 匮乏， 严重制约对纳尺度下流体动力学规律的认识，本 项目有望在纳流变参数测量、纳流体动力学的建模方面取得创新。（4（ 基于纳米孔的基因测序原理，本项目的研究目标是高精度、可重复、大批量制造出 5nm 以下三维纳米孔结构；通过多学科交叉（制造、材料、物理、化学、流体动力学、生物、信息），发明和完善纳通道内多模式信号检测方法，实现对单个碱基的辨识，研制出具有自主知识产权的第三代基因测序仪的原型系统，推
22、动我国科研重大装备的国产化进程。所构建 DNA 测序系统，信号灵敏度达到 10pA，频率响应为 1 KHz3 MHz，单一单链 核酸 1M 碱基长度核酸分子通过纳米孔至少形成 2M 个数字信号；构建标准序列 库，在检测过程可实现噪音的控制与噪音模型的建立，实现再测序(resequencing) 或从头测序(de novo sequencing)；对 于基因测序的核酸单链，实现单一纳米孔中检测大于 10K 序列直接测定。【组织方式】项目组织了国内优势研究单位的多个强有力的学术群体，依托 5 个国家重点实验室和 3 个部、省重点室，在发挥各自专长的同 时，也将定期 组织学术交流，避免分散、孤立和重复研究，还将与国际同行加强交流、保持密切的学术联系，保证研究工作的前沿性。为了项目的顺利、高效实施，我们拟设立核心领导小组和管理组。 项目参加
