1、国家重点基础研究发展计划（973 计划）牛奶重要营养品质形成与调控机理研究项目立项申报书项目名称： 牛奶重要营养品质形成与调控机理研究首席科学家： 王加启 中国农业科学院北京畜牧兽医研究所起止年限： 2011.1 至 2015.8依托部门： 农业部二、预期目标（一）总体目标运用现代营养学、营养基因组学和整合生理学等理论与方法，揭示乳成分前体物的生成、利用及其调节 机制， 阐明乳脂肪和乳蛋白合成的分子基础与代谢调控网络，建立调控乳脂肪、乳蛋白含量与组成的理论 和方法， 为改善我国牛奶品质提供理论依据和技术途径。（二）五年预期目标1揭示消化道内乳成分前体物的生成、吸收和转运规律及其调节机制；探明乳
2、成分前体物生成与瘤胃微生物优势菌群之间的关系，鉴定 23 个参与乳成分前体物生成的关键菌群；阐明瘤胃酸中毒时 LPS 的生成机制及其与乳成分前体物生成的关系。2. 揭示肝脏内乳成分前体物的 动态变化和代谢转化规律；阐明 LPS 影响肝脏内乳成分前体物重分配的规律；揭示肝脏内乳成分前体物重分配的细胞重编程分子机制，阐明肝脏内参与乳成分前体物转化与分配的功能基因差异表达及其表观遗传机理。3. 建立乳蛋白最大合成量所需游离氨基酸与小肽的理想模式；鉴定出乳腺上皮细胞摄取氨基酸和小肽的特异性转运蛋白 23 个； 阐明 VFA、氨基酸等乳成分前体物发挥最大协同作用的平衡模式和调控交汇点，揭示乳腺内乳脂肪和
3、乳蛋白合成的互作关系及其调节机理；揭示 LPS 对 乳腺细胞重编程的影响及其机理。4. 筛选确定参与乳脂肪和乳蛋白合成的第一基因组和第二基因组中主要功能基因 1015 个；揭示乳成分前体物与乳腺功能基因的互作关系；探明两个基因组在乳成分合成中的关联性， 获得具有关联性的功能基因 35 个。5. 从机体、细胞和分子水平揭示我国当前牛奶营养品质低下的主要原因，解析乳脂肪和乳蛋白合成的代谢调控网络，建立符合中国饲料资源特色的改善牛奶营养品质的系统整合理论；形成瘤胃“稳态” 调控技 术 23 项；建立干预乳脂肪和乳蛋白合成的关键代谢调控通路的技术途径，经验证试验使乳脂肪和乳蛋白含量分别达到 3.5%和
4、 3.1%；阐明乳脂肪和乳蛋白特征图谱的变化规律，建立鉴别牛奶营养品质的基准。6. 发表 SCI 收录论文 100 篇以上，申请发明专利 1015 项，培养博士和硕士研究生 100120 名，学 术带头人 1015 名，出版专著 35 部。三、研究方案（一）学术思路立足我国不同产地的饲料资源和奶牛生产实际，以“ 科学饲养、健康瘤胃、健康奶牛和优质牛奶” 为目标 ，依据现代动物营养学、 营养基因组学和整合生理学等理论与方法，以瘤胃、肝脏和乳腺内乳成分前体物的生成与利用为核心，深入到组织器官、细胞和分子水平剖析牛奶重要营养品质形成过程中的关键物质代谢和信号转导通路，整合形成乳脂肪和乳蛋白合成的代谢
5、调控网络理论，建立干预关键代谢调控通路的技术途径，揭示我国当前牛奶品质低下的深层次原因，最终实现调控乳脂肪和乳蛋白合成的目标。（二）技术途径立足我国不同产地的饲料资源，针对大规模、中等 规模和农户养殖 3 种主要生产方式，以健康经产奶牛 为试验动物，研究比 较不同日粮结构（粗料型、精料型和混合型）和营养水平（高、中、低）组成的日粮模式下，宏观上，主要应用现代动物营养学的研究方法，以研究乳成分前体物在奶牛消化道（瘤胃、小肠）、肝 脏和乳腺中的生成、吸收、代谢、 转化分配和利用规律为 主线；微观上，采用营养基因组学的理论与方法，深入到第一基因组和第二基因组，鉴定乳蛋白和乳脂肪合成相关功能基因，并研
6、究两个基因组与乳成分前体物生成与利用之间的关系；整体上，应用整合生理学的理论 与方法，系 统整合瘤胃、肝脏和乳腺对乳成分前体物形成乳成分前体物生成与利用的关键物质代谢通路、信号转导通路和神经内分泌调节， 绘制乳脂肪和乳蛋白合成的代谢调控网络，并建立干预代谢调控网络关键通路的技术途径。技术途径如下图：图 1 项目技术途径（三）与国内外同类研究相比的创新性和特色.学术思想具有前瞻性在项目整体设计上始终贯彻“科学饲养、健康瘤胃、健康奶牛和优质牛奶”的科学思路，以整合生物学的基本原理为指导，引入 现 代生命科学提出的“ 细胞编程、重编 程、两个基因组和表观遗传”的新理论和新方法，立足我国优质粗饲料严重
7、不足，奶牛饲料资源利用不合理的现状，以乳成分前体物为主线，在 进行组织器官、分子、细 胞水平研究的同时，进行整合研究，实现宏观研究与微观研究的系统整合，避免了发达国家 项目单薄，只能开展 单一 组织器官研究的片面性；本项目将探索瘤胃代谢异常产物引起机体免疫功能变化和细胞重编程的机理，以及对牛奶营养品质形成的影响，比国际上血液注射单一外源有害成分的研究切合实际，更能够揭示“健康瘤胃”的科学内涵；由此建立的理论体系和技术途径更具有前瞻性。2.技术路线具有新颖性“乳成分前体物”是饲料营养物质向乳脂肪、乳蛋白转化的关键。本项目通过“乳成分前体物 ”将奶牛瘤胃、肝脏和乳腺三个主要器官内营养素代谢及其信号
8、转导途径与基因调控机理联系在一起，由此筛选第一基因组（奶牛机体）和第二基因组（消化道微生物）中参与乳脂肪和乳蛋白合成与调控的功能基因，同时揭示神经内分泌系统通过激素和生长因子的信号调节通路。以整合生理学和营养基因组学为指导，由“表”及“里” ，由 “宏观”向“微观” ，从乳脂肪和乳蛋白合成与 调控的关键物质通路、信号转导 途径和神经内分泌调节等不同的层面实现整合，这一技术路线比国外单一功能器官的研究更能深入揭示牛奶品质控制的关键因素。3.研究成果具有实用性科学理论研究紧密衔接生产技术创新，科学问题源于生产，科学成果回归生产，是取得重大突破的动力。本项目的特色在于立足我国现实饲料资源和奶牛生产实
9、际，揭示当前我国牛奶品 质低下的深层次原因，提出牛奶重要营养品质形成与调控的关键调控网络，建立适合我国国情的乳脂肪和乳蛋白合成调控的理论和技术途径，对于改善我国牛奶品质具有重要的理论价值和现实意义，而且必将进一步提升我国反刍动物营养学科的研究水平，增强其国际影响力。（四）课题设置1、各课题间相互关系本项目立足我国不同产地的饲料资源和生产实际，运用现代营养学、营养基因组学和整合生理学的理论与方法，从奶牛瘤胃、肝 脏和乳腺三个器官切入，以不同典型日粮模式下营养物质转化为乳脂肪和乳蛋白的生物学过程和调节为主线，设置如下 5 个课题（见图 2）：以课题 1、2、3 为纵线 ，从现代营养学的角度分别研究
10、消化道、肝脏和乳腺内乳成分前体物的生成吸收、代谢分配和摄取利用规律及调节机制；而课题 4 以两个基因组为核心，从营养基因组学的角度研究参与乳脂肪和乳蛋白合成的功能基因及其与乳成分前体物之间的关系；课题 5 整合乳脂肪和乳蛋白合成在“ 分子 -细胞- 组织器官-机体”水平的代谢调控网络，并设计和验证干预关键调控通路的营养调控措施，建立改善乳脂肪和乳蛋白的新理论和新方法。图 2 项目课题设置课题 1、消化道内乳成分前体物生成与吸收的规律及其调节机制预期目标：1. 揭示瘤胃和小肠乳成分前体物的生成规律及其吸收和调节机制；2. 探明乳成分前体物生成与瘤胃微生物优势菌群之间的关系，鉴定 23 个参与乳成
11、分前体物生成的关键菌群；3. 阐明瘤胃酸中毒时 LPS 等代谢异常产物生成的机制及其对乳成分前体物生成与吸收的效应。研究内容：1. 瘤胃内乳脂肪前体物的生成、吸收及其调节研究不同日粮模式下主要乳脂肪前体物挥发性脂肪酸（VFA）在瘤胃内的生成量和比例及其与瘤胃发酵调控的关系，VFA 在瘤胃上皮细胞的吸收机制；探讨不同来源的日粮长链脂肪酸在瘤胃内的氢化效率及其影响规律与机制。2. 瘤胃和小肠乳蛋白前体物的生成、吸收与调节研究主要乳蛋白前体物小肠可代谢氨基酸、小肽的生成量及其比例与瘤胃微生物蛋白合成量和效率、日粮非降解蛋白的关系；探索氨基酸和小肽在小肠贴膜上皮细胞的转运通路、吸收 动力学及其调节机制
12、。3. 乳成分前体物生成与瘤胃微生物区系之间的关系应用基因与基因组文库等微生物分子生态学技术，研究饲料组合效应、能氮平衡、氮硫平衡、氨基酸补饲、激素与生 长因子等对 瘤胃微生物种群结构、数量和功能的影响，鉴别参与乳脂肪和乳蛋白前体物生成的关键菌群；应用体外共培养、特定微生物驱除等技术 ，研究 细菌、真菌或原虫在乳成分前体物生成 过程中的互作及其调节机制；解析日粮-瘤胃微生物-乳成分前体物三者之间的相互关系。4. 瘤胃内 LPS 等代谢异常产物的生成机制及其对乳成分前体物生成与吸收的影响研究瘤胃酸中毒时，瘤胃微生物区系紊乱导致的代谢异常产物 LPS 等的生成、吸收机制及其控制；探讨瘤胃内 LPS
13、 等代谢异常产物对 VFA 生成与吸收及微生物蛋白质合成的影响，以及 LPS 等产物对瘤胃上皮细胞功能的影响。经费比例：20%承担单位：浙江大学、南京农业大学、中国 农业大学课题负责人：刘建新学术骨干：王佳堃、吴跃明、沈赞明、毛胜勇、 杨红建、李胜利课题 2、肝脏内乳成分前体物的代谢、分配及其分子机理预期目标：1. 揭示肝脏内乳成分前体物的动态变化和代谢转化规律；2. 阐明 LPS 影响肝脏内乳成分前体物重分配的 规 律；3. 揭示肝 脏 内乳成分前体物重分配的 细胞“重编程”分子机制以及肝脏内参与乳成分前体物转化与分配的功能基因差异表达及其表观遗传机理。研究内容：1. 肝脏内乳成分前体物的代
14、谢与分配规律应用肝脏慢性血管瘘和血流量测定技术，实时测定不同日粮模式下肝脏门脉引流区和肝静脉中脂肪酸和氨基酸等乳成分前体物的总流量和组成，研究肝脏内乳成分前体物的动态变化、吸收转化和分配。2. 瘤胃代谢异常产物 LPS 对肝脏内乳成分前体物重分配的影响通过测定进出肝脏的 LPS 的动态变化，确定肝脏对 LPS 的清除效率；结合体内和体外方法研究 LPS 引起的肝脏免疫防御反应 ，分析 LPS 对肝细胞免疫活性的影响，研究 LPS 引起的免疫防御反应对肝脏内乳成分前体物重分配的作用。3. 肝脏内乳成分前体物重分配的细胞“重编程”分子机制采用肝脏活体取样和基因表达谱芯片技术，比较不同日粮模式下，肝
15、脏细胞基因表达谱差异，研究乳成分前体物与功能基因表达的互作关系；分析在代谢异常产物 LPS 作用下，肝脏乳成分前体物代谢功能基因与免疫相关基因表达谱发生变化的细胞“ 重编程” 现 象及表观遗传机理。经费比例：18%承担单位：南京农业大学、河南农业大学课题负责人：沈向真学术骨干：倪迎冬、张源淑、庄苏、杨国宇、王林枫课题 3、乳腺对乳成分前体物的摄取、利用及其 调节机理预期目标：1. 建立乳蛋白最大合成量所需游离氨基酸和小肽的理想模式；2. 鉴定出参与乳腺上皮细胞摄取氨基酸和小肽的特异性转运蛋白 2-3 个；3. 提出挥发性脂肪酸和氨基酸等乳成分前体物发挥最大协同作用的平衡模式与调控交汇点，揭示乳
16、腺内乳脂肪和乳蛋白合成的调节机理；4. 揭示代谢异常产物对乳腺细胞“重编程” 影响的机理。研究内容：1. 乳腺对乳脂肪前体物的摄取、利用与调节应用乳腺动静脉血插管技术，测定不同日粮模式下乳腺内乙酸、- 羟基丁酸和长链脂肪酸等乳脂肪前体物流量与组成的动态变化，研究不饱和脂肪酸对乳腺内从头合成脂肪酸（C 4C 16）关键酶（乙酰辅酶 A 羧化酶、脂肪酸合成酶等）基因表达和长链脂肪酸（来自血液 VLDL 等）摄取效率的影响及其机制，研究催乳素、胰岛 素和类胰岛素生长 因子-I 等对乳腺内乳脂肪合成的调节作用。2. 乳腺对乳蛋白前体物的摄取、利用与调节测定不同日粮模式下进入乳腺的氨基酸和小肽流量与组成
17、，鉴定参与乳腺上皮细胞摄取的关键氨基酸和小肽的特异性转运蛋白；利用转录组学和蛋白质组学方法，筛选乳蛋白最大合成量所需游离氨基酸和小肽的理想模式，研究激素（催乳素等）、功能性氨基酸(亮氨酸等)对乳腺中 -酪蛋白和 -乳清蛋白合成的调节作用。3. 乳腺细胞内乳脂肪和乳蛋白合成的互作关系应用精准灌注和乳腺细胞体外三维培养等技术，分析乳腺上皮细胞内乳脂肪和乳蛋白合成对乳成分前体物利用的协同与竞争关系，确定挥发性脂肪酸、氨基酸等乳成分前体物发挥最大协同作用的平衡模式和调控交汇点，研究乳成分前体物组成、激素和生长因子等对乳腺细胞内乳脂肪和乳蛋白合成的关键酶活性、细胞信号转导途径以及候 选基因表达的影响，确定调控交汇点。4. 瘤胃代谢异常产物 LPS 对乳腺细胞“重编程”的影响研究瘤胃代谢异常产物 LPS 进入乳腺后引起的乳脂肪和乳蛋白合成代 谢与免疫功能的变化，探讨乳腺上皮细胞“重编程”规律及其表观遗传机理。
