1、项目名称： 重要病原体变异规律与致病机制研究首席科学家： 金奇 中国医学科学院病原生物学研究所起止年限： 2011.1至 2015.8依托部门： 卫生部二、预期目标总体目标以病原体变异与流行规律及致病机制这两个关键科学问题为核心，充分利用我国流行菌株和临床样本资源，发挥学科间交流与合作的优势，采用现代前沿组学、生物信息学、感染性克隆等先进技术，从病原学、流行病学、细胞生物学、分子生物学、免疫学、疫苗学等角度，深入揭示志贺氏菌、EV71 等肠道病毒、脑膜炎奈瑟菌三种病原体引起的疾病的本质，了解其变异、流行规律、致病机理和机体免疫保护机制，并研制出有可能应用于临床防治的新型疫苗和诊断新技术，为临床
2、救治方案的制订、疫苗的研发、药物靶标的筛选及防控策略的完善等提供理论基础。通过课题的实施，培养一批优秀人才，全面提升我国相关传染病诊防治的整体水平。五年预期目标1、深入揭示志贺氏菌变异规律和致病机制。包括系统分析志贺氏菌的进化起源和变异机制；部分阐明福氏志贺菌血清型转换通路和规律及其对福氏志贺氏菌流行强度的影响；了解福氏志贺氏菌优势血清型菌株的耐药、致病力和环境适应能力特点；揭示毒力大质粒对宿主菌染色体基因表达影响的种类与方式；了解志贺氏菌毒力相关蛋白下调宿主免疫应答的现象和在宿主细胞中的作用靶点及新的作用方式。2、揭示我国 EV1 等变异规律、趋势及其与毒力关系。包括阐明过去 10 年我国大
3、陆流行的 EV71 病毒的型别特点和进化特征；阐明若干与病毒毒力有关的变异位点，鉴别出一组与病毒复制和翻译有关的宿主因子，并部分阐明其作用机制；解析若干 EV71 变异体病毒颗粒和 3C、3D 等重要功能蛋白及其突变体的结构；建立我国 EV71 毒株库，建立感染性克隆、亚基因组复制子等关键性研究技术平台；3、部分阐明 EV71 等病毒的致病与免疫机制。包括揭示 EV71 侵入中枢神经系统的分子机制；部分阐明 EV71 拮抗天然免疫、诱导适应性免疫的机制及其与 EV71 及疾病进展、预后的关系，提出 EV71 灭活疫苗的免疫保护机制和有效性评价指标；建立完善用于 EV71 感染研究的体外血脑屏障
4、模型、新型小鼠感染模型和恒河猴模型等。4、初步揭示脑膜炎奈瑟菌变异规律和致病机制。包括掌握我国主要脑膜炎奈瑟菌流行菌株血清群变异的规律；了解我国脑膜炎奈瑟菌菌株在健康人鼻咽部的粘附和定植对菌株的扩散以及流脑流行的公共卫生学意义；初步阐明了解细菌的粘附和侵袭毒力基因和蛋白的相互关系。5、培养中青年研究骨干 30 人以上，研究生 50-80 名。6、在 SCI 收录杂志上发表论文 80-100 篇。三、研究方案（一）总体学术思路本项目围绕病原体变异规律与致病机制这两个传染病基础研究中的核心科学问题，根据我国传染病防控的需求，以志贺氏痢疾杆菌、EV71 等肠道病毒和脑膜炎奈瑟菌等为研究对象，利用前沿
5、组学、结构生物学等各种前沿生命组学技术，结合生物信息学、感染性克隆、基因工程动物等先进技术，从病原学、流行病学、细胞生物学、分子生物学、免疫学、疫苗学等角度，在病原体基因及其编码产物、宿主分子、细胞、动物和机体等不同层次上，深入揭示志贺氏菌、EV71 等肠道病毒、脑膜炎奈瑟菌等变异规律及其与致病机制关系，同时根据病原体的不同各有侧重：志贺氏菌以优势血清型和编码噬菌体为重点，研究优势血清型菌株的致病性、流行性、耐药性等生物学特性，提出解释我国福氏志贺氏菌流行病学特点的假说，为发展志贺氏菌疫苗和控制志贺氏菌感染提供新的思路和策略。手足口病围绕 EV71 等肠道病毒遗传变异和致病机制两大科学问题，开
6、展 EV71 等肠道病毒遗传变异规律及其与毒力关系、病毒致病与免疫保护机制的研究，为病毒监测、临床救治、疫苗研发和药靶筛选等提供基础科技支撑，填补研究空白。脑膜炎耐瑟菌重点阐明我国流脑菌株在健康人鼻咽部的粘附和定植对菌株的扩散以及流脑流行的公共卫生学意义；同时，开展荚膜合成基因簇的表达、基因缺失、基因水平转移以及基因重组的调控机制研究，以期了解我国流脑菌株血清群变异的机制和规律，甄别流脑流行株和非流行株，为我国流脑预防控制提供基础性参考数据。（二）技术路线1、志贺氏菌变异规律和致病机制研究本课题将收集和分离志贺氏菌流行株，分析其血清型、耐药性、生化特性、毒力等，选择具有代表性菌株，通过全基因序
7、列分析以及比较基因组学研究，发现不同血清型、耐药性、毒力及生化特性等菌株的基因组差异，重点研究各种志贺氏菌菌株之间致病性质粒、毒力岛、血清型转换噬菌体等可水平转移遗传成分以及与生存环境相关的代谢基因间的差异，并进一步通过噬菌体分离、基因敲除、基因导入、动物毒力评价等分析上述差异与致病力的关系，同时开展志贺氏菌致病性质粒与染色体的协同进化研究、重要毒力蛋白和复合物与宿主相互作用，系统解析志贺氏菌的变异规律与致病性的关系。2、EV71 等病毒变异趋势与毒力关系的研究（1）我国不同地区 EV71 等病毒流行变异规律研究：收集 1998-2009 年我国不同地区的 EV71 分离株，利用基因组步移(g
8、enome walking)、PCR 和 RACE技术等扩增并测定病毒全基因组序列。以发表毒株序列为参考序列，应用比较基因组学等方法进行 EV71 等病毒遗传进化树，探明我国 EV71 病毒的型别特点、分子特征和衍化来源。阐明中国大陆流行的 EV71 病毒的基因变异规律及病毒基因型别进化，阐明不同毒株在不同基因之间的进化关系和病毒衍化来源。（2）EV71 等病毒变异与病毒毒力关系研究：通过对不同地区、不同毒力的 EV71 分离株进行序列比对，利用定点突变技术，在 EV71 基因组中引入突变位点，转录出 RNA 后转染敏感宿主细胞，观察重组病毒的产生效率和噬斑形成能力等，确定 EV71 变异与毒
9、力的关系，并在动物模型上进一步验证。在此基础上，利用大肠杆菌或昆虫细胞表达、纯化重组 EV71 突变体蛋白或病毒样颗粒，优化条件，最终获得质量符合 X 射线衍射实验的单晶体，结合实验室小型 X 射线衍射仪，大型同步辐射实验室获得 EV71 3C 衍射数据，进行数据分析和三维模型建立，完成结构解析。以 EV71 蛋白和非编码区 RN1 为钓饵，利用亲和层析、蛋白质组学等技术，分析鉴别与 EV71 基因组非编码区及 RNA 依赖的 RNA 聚合酶结合的宿主因子，并研究其相互作用机制及其对病毒复制的影响。具体思路如图 2 所示。3、EV71 等病毒致病与免疫保护机制研究（1）EV71 等致病机制研究
10、：建立血脑屏障模型，利用蛋白质组学、免疫学、病理学、动物学等技术体系，进行血脑屏障侵入路线同神经轴突侵入路线的功能性比较研究、筛选和鉴定参与不同 EV71 入侵中枢神经系统路线的相关作用因子，揭示神经毒性分子机制研究，从而阐明 EV71 的神经嗜性机制。利用免疫沉淀、报告基因转染、蛋白质组学、转录组组学、酵母双杂交筛选、RNAi 等技术阐明宿主天然免疫系统对 EV71 的识别机制，病毒对干扰素等天然免疫系统的拮抗机制；利用转基因技术、基因敲除技术等建立 EV71 的小鼠敏感感染模型，利用该模型观察天然免疫与 EV71 致病性的关系及干扰素的治疗作用。（2）手足病免疫保护机制研究：利用流式细胞分
11、析和液态芯片检测、微量中和实验等技术，动态研究临床患者不同病程免疫应答特征，了解重要免疫细胞、免疫因子与病情发生、发展和转归的功能关联性；利用超速离心、流式细胞分析、电镜检测、芯片分析以及高通量荧光定量 PCR 等方法探索 EV71 等病毒感染机体后不同免疫细胞间快速致病信息交流的机制；利用小鼠模型观察CD4 T 细胞与 EV71 致病性及疾病进展的关系；制备 EV71 灭活疫苗，免疫恒河猴，观察猴体病理反应以及细胞与体液免疫反应；用 EV71 进行攻击，观察病理反应和保护作用及病毒排泌情况等，力争进入临床试验，观察疫苗安全性和有效性，提出评价疫苗安全性和有效性的指标。4、脑膜炎奈瑟菌变异与流
12、行规律及致病机制研究针对流行性脑膜炎，本项目拟通过体外粘附侵袭实验、基因组序列测定、逆转录 PCR、荧光定量 PCR 和 RNA 测序手段分析具有不同流行特征的流脑菌株在致病性上的差异及其可能的产生机制。（三）创新性本项目以志贺氏菌、EV71 等肠道病毒和脑膜炎奈瑟菌等为研究对象，开展系统研究，具有很强的创新性：1、从血清型转换噬菌体入手，研究噬菌体感染的特异性和时序性，揭示噬菌体与福氏志贺菌血清变迁的关系，对于预测、预警流行血清型及血清型变化趋势，阐明细菌性痢疾的流行规律具有重要意义。2、目前手足口病的基础研究在国内外均非常薄弱，空白很多，本研究均为原始创新研究。其中拟开展的我国大陆流行的
13、EV71 等肠道病毒的变异规律和毒力关系研究以及致病机制和免疫保护机制的研究，如 EV71 变异与毒力关系、EV71 病毒颗粒与重要蛋白的结构生物学、EV71 侵入中枢神经系统及其致损伤机制、天然免疫拮抗机制、获得性免疫与疾病进程关系、EV71 灭活疫苗保护机制等重要研究方向均未见系统研究。建立新型小鼠感染模型和恒河猴模型将对阐明 EV71 灭活疫苗的免疫保护机制和有效性评估提供重要理论依据。3、充分利用我国脑膜炎奈瑟菌资源，研究不同来源菌株流行变异规律及粘附侵袭相关基因蛋白调控机制。从分子水平上解释细菌的粘附侵袭相关因子和健康人群的正常携带对流脑流行传播的规律的影响，了解我国不同流行特征的脑
14、膜炎奈瑟菌在致病能力上的差异。系统研究和了解我国不同血清群菌株血清群变异的遗传学基础和调控机制。（四）研究特色1、在志贺氏菌研究方面：发达国家对志贺氏菌的研究，重点已经转移到痢疾志贺氏菌和宋内氏志贺氏菌。我国志贺氏菌研究团队，多年来一直开展福氏志贺氏菌的研究， 在基因组解析、进化理论、O 抗原多样性形成机制解析、新的血清型发现、蛋白质组分析等方面，达到国际水平。本课题是继续以福氏志贺氏菌为主要研究对象开辟新的领域，具有中国特色：（1）从旁基因组和核心基因组两方面着手，全面分析志贺氏菌分化中发生的遗传事件，特别是研究突变和重组对志贺氏菌进化的影响。 （2）将建立第一个福氏志贺氏菌血清型转换噬菌体
15、库，进而与福氏志贺氏菌的优势血清型的流行结合研究，探讨血清型转换通路，了解新的血清型产生机制。2、在 EV71 等病毒研究方面：本项目围绕我国手足口病防控中急需解决的瓶颈难题，结合国际前沿进展，以病原体变异和致病机制为主线，开展 EV71病毒遗传变异规律及其与毒力关系以及 EV71 等病毒复制、致病与免疫保护机制的研究。研究内容系统全面，包括 EV71 遗传变异特征、变异与毒力关系、复制机制、神经嗜性机制、免疫调制机制、疫苗保护机制和动物模型等，涵盖了病毒学、免疫学、细胞生物学、结构生物学、生物信息学、病理学等诸多领域，是迄今为止最为全面的研究，填补多方面空白。课题综合运用了蛋白质组学、转录组
16、学等前沿组学，感染性克隆技术，免疫学，基因工程动物模型技术，生物信息学技术，结构生物学技术等先进技术，体现了传染病和病毒学研究的国际前沿水平。另外，针对不同地区 EV71 流行特征不同，本研究是基于对我国内地 EV71 流行变异规律分析基础上，利用我国毒株进行的，具有我国特色。3、在脑膜炎奈瑟菌研究方面：全球范围内，流脑的流行具有地区性或区域性，不同地区各有特点，流脑疫苗的应用影响到流脑流行和传播的规律。国际上的研究各有侧重。本研究集中国内流脑研究的优势单位，利用现有的近 50 年来的不同时期的流脑菌株，对这些菌株进行致病性和变异性研究，有助于我们更好地了解和掌握中国流脑流行规律的变迁和菌株的
17、变异流行规律和菌株的毒力特征，为我国流脑的防控和流行预测提供基础性数据。（五）可行性分析1、理论上可行：本研究所涉及的痢疾变异规律、EV71 遗传变异特征、变异与毒力关系、致病和免疫保护机制和动物模型的研究、脑膜炎奈瑟菌等变异规律和致病机制等研究均基于国际相关领域的最新进展，在其他病原体有成功经验可循，部分研究已经取得初步成果。 2、具有资源优势：研究团队中的中国疾病预防控制中心传染病预防控制所新病原室，长期从事细菌性痢疾等细菌性腹泻病的研究，是国家细菌性痢疾监测网络菌株收集、鉴定和保藏单位，已经收集和保存不同年代、不同地区、不同血清型痢疾杆菌 4000 余株，其中福氏志贺菌 2000 余株，
18、涵盖目前已知的 15个血清型。中国医学科学院病原生物研究所、中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所等单位分离、收集了 EV71 毒株 600 余株，研究单位和北京地坛医院以及多个省级疾控中心建立了良好合作关系，可获得研究所需临床样本，另外研究所需的细胞株、克隆、细胞系、抗体等均已收集齐备；中国疾病预防控制中心传染病预防控制所呼吸道病原保存有近 50 年来的不同时期的流脑菌株和样本，保存有我国自 1956 年以来脑膜炎奈瑟菌菌株 3000 多株，这些菌株能够代表建国以来我国流脑流行期间以及流行间期脑膜炎奈瑟菌菌株的整体状况。另外，通过购买或者国际交流与合作，还获得了世界其它流脑流行国家、地区的脑膜
19、炎奈瑟菌代表株。3、具有成熟的技术平台：研究团队的中国医学科学院和南开大学团队已投资建成了具备国际通行标准的基因组学、功能基因组学、蛋白质组学和生物信息学研发平台，为计划的实施奠定了物质基础。军事医学科学院生物工程研究所团队（病原微生物生物安全国家重点实验室） ，建立了微生物蛋白质组学研究平台，并且熟练掌握了进行毒力评价研究的多种方法和模型。中国医学科学院实验动物研究所建立了基因工程动物模型技术平台、医学生物学研究所建立了灵长类动物平台，均可为本项目的开展提供支撑。本研究所需各类实验技术均已被研究团队熟练掌握，并具备研究所需的生物安全二级实验室等保障条件，开展本研究不存严重技术障碍。 4、具有
20、高素质的研究团队：本项目集成了来自重大疾病研究国家实验室（筹）以及病毒基因工程、病毒学、传染病预防控制、医学分子生物学、病原微生物生物安全等五个国家重点实验室等的高水平科研力量，拥有国内痢疾、手足口病和流脑等研究最强的研究队伍，部分骨干参与了本项目前两期的研究，具有良好的工作基础，为本项目的完成提供了重要保障。（六）课题设置课题设置思路：本项目继续围绕病原体变异规律与致病机制这两个传染病基础研究中的核心科学问题，根据我国传染病防控需求，选择四种重要病原体分别研究其变异规律及其与致病机制的关系，包括现阶段居于我国传染病发病率前列的痢疾、手足口病以及流行型别和模式发生转变、对社会造成严重冲击的流脑
21、等重要传染病的病原体，其中以手足口病和痢疾为研究重点。围绕项目的科学问题、主要研究内容和目标，拟设置“志贺氏菌变异规律和致病机制研究” 、 “EV71 等病毒变异与毒力关系的研究” 、 “EV71 等病毒致病与免疫机制研究”和“脑膜炎奈瑟菌变异规律和致病机制研究”四个课题。为突出重点，其中考虑到我国当前手足口病研究基础薄弱，国内以前对相关研究资助较少，而近年疫情上升迅猛，国内外普遍关注，特设置两个课题，以加强相关研究；痢疾研究基础较好，单独设置一个课题；流脑单独设置一个课题。课题间的联系及其与项目目标的关系：本项目的 4 个课题分别针对志贺氏菌、EV71 等病毒和脑膜炎奈瑟菌开展研究，都是围绕
22、病原体变异规律和致病机制关系展开，涵盖细菌、病毒等不同微生物，相关研究将从不同侧面显示病原体的变异特征、导致疾病本质和相关机制，有助于发现、揭示共性问题和规律，从而从整体上提高我们对于传染病的认识，因此这 4 个课题是围绕项目目标的有机统一的整体。其中课题 2 和 3 从病毒变异和致病机制两个方面对 EV71 进行研究，但又各有侧重，这两个课题的研究成果结合起来将对手足口病的临床诊治、预防控制、疫苗和药物研发等提供基础。课题 1：志贺氏菌变异规律和致病机制研究主要研究内容：（1）志贺氏菌 O 抗原的变异规律的研究通过对不同福氏志贺氏菌血清型亚型的全基因组分析，找到负责特定血清型亚型形成的关键基
23、因。解析不同福氏志贺氏菌血清型的分化机制，了解不同血清型之间转化的变异机制，建立针对全部福氏志贺氏菌血清型的分子分型方法，为针对福氏志贺氏菌的传染病防控和疫苗开发奠定理论基础。针对志贺氏菌“多起源”和变异程度高的特点，通过志贺氏菌及其潜在的前体侵袭性大肠杆菌（EIEC）之间的比较基因组学分析，建立志贺氏菌和 EIEC 的旁基因组（Pan-genome ）数据库和核心基因组（core-genome ）数据库，对志贺氏菌的进化起源机制进行系统分析，了解其进化和变异的规律和趋势。（2）福氏志贺氏菌优势血清型转换噬菌体和流行强度的研究通过诱导、获取目前已知和未知的各种福氏志贺菌血清型转换噬菌体，对目前
24、全基因组序列未知的噬菌体进行序列测定和生物学特征研究；研究不同血清型转换噬菌体单独或组合感染及转化福氏志贺菌的可能性和特异性，掌握多种噬菌体组合感染的时序性，了解福氏志贺菌血清型间转换通路和规律；研究各种噬菌体单独或组合感染时在宿主菌基因组上的整合位点和排列方式，为揭示福氏志贺菌血清型间转换及遗传进化的分子机制提供线索；揭示血清转换噬菌体与福氏志贺菌血清变迁的关系，阐明福氏志贺菌血清型变迁机制。 （3）志贺氏菌毒力大质粒和染色体的协同进化及调控 毒力大质粒的获得是志贺氏菌从非致病性大肠杆菌变为致病菌的第一步也是最重要的一步，随后志贺氏菌的染色体与大质粒就开始了漫长的协同进化历程，以达到其适应肠道新环境的最佳状态。本研究拟通过比较不同血清型志贺氏菌去除毒力大质粒前后、非致病性大肠杆菌导入毒力大质粒前后的蛋白表达谱和复合物谱的变化，从全局角度对志贺氏菌毒力大质粒与染色体之间的关系进行较为系统的研究，以期发现一些新的抗毒力基因和解析志贺氏菌毒力大质
