1、1棉花基本生物技术操作手册华中农业大学作物遗传改良国家重点实验室棉花课题组二 00 三年七月武汉2目录1. MS培养基母液配制 12. 棉花胚性愈伤的诱导及植株再生 23. 棉花原生质体操作 34. 根癌农杆菌介导的遗传转化 65. DNA 的提取和检测 86. RNA 的提取和检测107. 分子标记8. 分子杂交3前 言随着本课题组科研队伍的不断壮大，科研工作的全面开展和深入，各个研究方向开始交流渗透，急需一本规范的实验操作手册为课题组各个成员提供指导.手册是由本课题组多个研究方向的成员参照标准的操作程序结合自身的经验编写而成,因此具有一定的科学性和可操作性。这本手册是在张献龙教授的大力倡导
2、和支持下完成的，课题组各个成员都积极参与了手册的编辑，在此一并致谢。金双侠编写了手册第一，二，八部分；孙玉强编写了第三部分；梁绍光编写了第四部分；朱龙付编写了第五部分；涂礼莉编写了第六部分；贺道华编写了第七部分。杨细燕负责部分文字的输入及编辑工作，涂礼莉负责全文的校对和编辑工作。这本手册的编辑是本课题组第一次有益的尝试，经验不足，难免有许多纰漏，期盼课题组在今后的不断发展中能够不断改进和丰富这本手册。4MS 培养基母液配制一、大量元素（20 倍）母液 (g/L)KNO3 38 NH3NO3 33MgSO47H2O(无水 MgSO4) 7.4(3.8)KH2PO4 3.4CaCl22H2O(无水
3、 CaCl2) 8.8(6.6)二、微量元素（100 倍）母液 (g/L)CoCl26H2O 0.0025CuSO45H2O 0.0025H3BO3 0.62KI 0.083MnSO44H2O 2.23NaMO42H2O 0.025ZnSO47H2O 0.86三、铁盐（100 倍）母液 (g/L)FeSO47H2O 2.78 Na2EDTA 3.73四、 B5 有机物 VB1(硫胺素) 10mg/l VB5（盐酸吡哆醇） 1mg/lVB6（烟酸） 1mg/l肌醇 100mg/l 甘氨酸 2mg/l 五、 生长调节剂生长素（2，4-D、IBA、IAA、NAA 等）细胞分裂素（KT、ZT 等）母液
4、配制注意事项：51. 配制大量元素时各种药品分别称量，分别充分溶解,逐一加到容量瓶中，一定要最后加入 CaCl2 否则容易产生沉淀,定容到一升。2. 配制微量元素时几种极微量药品先可以配成一级母液(浓缩 10000 倍)，再稀释成二级母液(浓缩 100 倍)，母液配制完毕后放置于室温下 10 小时以上，看是否有沉淀产生，然后才能使用。3. 配制铁盐时,两种盐用热水分别溶解,然后混合，放置于室温下 10 小时以上看是否有沉淀产生,然后才能使用。4. 各种生长激素一般可以用 1 摩尔/升的 NaOH 或 HCl 溶解后，再定容。5. 配制 B5 有机物时要用无菌水来配制，一次不要配太大体积，及时用
5、完以防污染6. 各种母液配制好后应存放在 4冰箱中,发现有沉淀后，不得使用。6棉花组织培养一、无菌苗的培养将棉籽壳去掉，用 0.1/100 的升汞灭菌十分钟，无菌水冲洗三遍，接种于无菌苗培养基中配方如下：2/1 MS 大量元素+葡萄糖 15 克/l+phytagel 2.5g/l，三至四天暗培养，一至二天光照培养。二、愈伤组织的诱导 选取无菌苗的下胚轴，用解剖刀切成 0.50.6cm 小段，接种于诱导培养基上配方如下：MS 无机盐+B 5 有机物+2,4-D 0.1mg/l+ KT0.1mg/l 葡萄糖 30g/l+phytagel 2.5g/l三、非胚性愈伤组织的增殖MS 无机盐(硝酸钾加倍
6、，硝酸铵减半) +B 5 有机物+2,4-D 0.05mg/l+ KT0.1mg/l 葡萄糖 30g/l+phytagel 2.5g/，或者是 MS 无机盐(硝酸钾加倍，硝酸铵减半) +B5 有机物+ 葡萄糖 30g/l+phytagel 2.5g/l(针对那些增殖迅速的愈伤)。四、愈伤组织的分化愈伤组织经继代几次后，有的愈伤组织转成米粒状颗粒，将其转入分化培养基（MS + B5 有机物+ 葡萄糖 30g/L + phytagel 2.5g/l + KT0.15mg/l +IBA0.5 mg/l）中，进一步分化成胚状体。五、胚性愈伤组织的继代MS 无机盐(硝酸钾加倍,硝酸铵减半) +B 5 有
7、机物+IBA0.5mg/l+ KT0.15mg/l+Gln(谷胺酰胺 )1.0mg/l+Asn(天冬酰胺) 0.5mg/l+葡萄糖30g/l+phytagel 2.5g/l六、成苗生根培养基MS 无机盐(硝酸钾加倍,硝酸铵减半) +B 5 有机物+IBA0.5mg/l+ NAA0.5mg/l+Gln1.0mg/l+Asn0.5mg/l+葡萄糖 30g/l+phytagel 2.5g/l 七、胚性愈伤组织的悬浮培养基MS 无机盐+B 5 有机物+ Gln(谷胺酰胺)0.2mg/l+Asn(天冬酰胺)0.2mg/l+NaCl 1.0g/l +KCl 1.0g/l+葡萄糖 30g/l7棉花原生质体操
8、作一、材料的准备1. 胚性细胞悬浮系的建立：从固体培养基上取继代两周的胚性愈伤组织于 MS+谷氨酰胺 0.2 g/l+ 天门冬酰胺 0.2 g/l+葡萄糖 30 g/l 的液体培养基中 (每瓶 40 ml), 120 转振荡培养, 每 7 天继代一次, 4 周后可以用于原生质体分离。2. 无菌苗的培养：种子去壳消毒播种在 1/2MS 培养基上, 10 天后叶片充分伸展开后可分离原生质体。二、原生质体的分离1. 悬浮系原生质体的分离：用吸管吸取 1 g 左右的悬浮培养物于 1560 mm 的培养皿中，吸干培养基，加入 1.5-3 ml 酶混合液,轻轻摇匀,封口膜封口, 置于摇床上 40 转或静置
9、, 28 黑暗条件下酶解 18-22 小时。2. 叶肉原生质体的分离: 把叶片放在 1560mm 的培养皿中,并用解剖刀将叶片切成 0.1 cm 宽的细条 , 后加入 1.5 ml 酶混合液,轻轻摇匀,封口膜封口, 置于摇床上 10 转或静置, 28 黑暗条件下酶解 14-18 小时。三、原生质体的纯化1. 酶解后的原生质体混合物经 40 目的不锈钢网去掉渣子,CPW9M 洗涤, 滤液在 10ml 的离心管离心 10 分钟(800rpm), 使原生质体沉于管底。2. 沉淀物用 3 ml CPW25S 悬浮, 在其上加入 1ml 的 CPW9M 离心 2-6 分钟(700rpm), 原生质体在两
10、液面形成一条带, 其他的杂质及少量的原生质体沉于管底。3. 将原生质体轻轻地吸出, 转入另一试管, 用电融合液离心洗涤 5-6 分钟(700rpm), 去掉上清夜, 用电融合液悬浮至 2-10105/ml 备用。四、原生质体活性检测FDA 溶液(5 mg/ml)按 25 l FDA/ml 原生质体的比例加入 FDA, 5 分钟后, 在荧光显微镜下检测原生质体的活性 (暗视野下发荧光的原生质体数/明视野下原生质体总数)。五、原生质体融合 (电融合)1.将悬浮好的双亲的原生质体等体积混合。2.用吸管取大约 1.6 ml 悬浮液于环形融合小槽(FTC-4), Parafilm 封口。83.静置 5-
11、10 分钟,等大量的原生质体沉淀后, 在选择好融合参数下诱导融合, 可以在倒置显微镜下观察。4.融合后静置 10-20 分钟, 以便融合的原生质体球形化。5.吸出融合产物后, 离心 5-6 分钟, 用培养基悬浮到合适的密度进行培养。六、原生质体培养棉花的原生质体培养常采用 KM8P 或 MSB 液体培养, 待形成肉眼可见的愈伤组织后, 转移到继代培养基, 接下来的操作详见遗传转化操作部分。七、再生苗的鉴定1.形态学鉴定: 叶形, 株高等2.细胞学鉴定: 染色体, 气孔3.分子标记鉴定: RAPD, AFLP, SSR, CAPS, RFLP, Southern blotting八、相关的酶液,
12、 洗液及培养基1.enzyme mixtures (仅供参考) 100ml mannitol (9%) 9gNaH2PO4.2H2O (0.011%) 0.011gCaCl2.2H2O(0.36%) 0.36gMES(0.12%) 0.12gCellulase R-10 (3%) 3gPectinase (1.5%) 1.5gHemicellulase(0.5%) 0.5g2.CPW (mg/l) pH 5.8 CaCl2.2H2O 1480KH2PO4 27.2KNO3 101.0MgSO4.7H2O 246.0CuSO4.5H2O 0.025KI 0.16CPW9M 添加 90g Mann
13、itol； CPW25S 添加 250g Sucrose3.electrofusion medium (100ml)0.1mM CaCl2.2H2O，10% (w/v)mannitol4. KM8P organic elements 9Sugar (g/l)Sucrose 0.25Mannose 0.25Glucose 68.4Fructose 0.25Ribose 0.25Xylose 0.25Rhamnose 0.25Cellobiose 0.25Sorbitol 0.25Vitamins and organic acids (mg/l)Inositol 100Nicotinic amid
14、 1Pyrridox-HCl 1Thiamine-HCl 10D-Ca-Pantothenate 1Folic acid 0.4p-Aminobenzoic acid 0.02Biotin 0.01Cholinchloride 1Ascorbic acid 2Vitamin A 0.01Vitamin D3 0.01Vitamin B12 0.02Glycine 2 Na-pyruvate 20Citric acid 40Malate 40Fumarate 40Organic supplements (mg/l)Casein hydrolysate 25010根癌农杆菌介导棉花愈伤组织遗传转化
15、1愈伤状态的调整和活化选择再生性较好的棉花品种的胚性愈伤组织接种于增殖培养基上，挑取细颗粒(非粉末) 胚性愈伤两周继代一次，在继代过程中尽量使愈伤状态均一生长同步，减少愈伤中幼胚的发生，待增殖到足够的量后继代于预培养培养基上弱光培养(非暗培养)十天即可用于侵染。2农杆菌的活化和保存2.1 准备：农杆菌，MGL 液体培养基（含 kan 50mg/L） ，无菌三角瓶， LB（固、液）培养基（含 kan 50mg/L） ，灭菌甘油，无菌枪头，无菌 1.5ml 离心管 2.2 操作：2.2.1 活化，悬浮：超低温冰箱内取出保存菌株的甘油管在冰上融化，LB 平皿上划线，26.5暗培养 36-48hr，待
16、皿内长出清晰的单菌落，挑取单菌落在另外的 LB平皿划线，26.5暗培养 36-48hr，待皿内长出足够的菌落结束培养，把培养基表面菌落刮入三角瓶内的 MGL 培养基中，27、200rpm 摇 2hr，OD 值在0.5-1.5 之间即可用于侵染。2.2.2 菌株的保存：从培养皿内挑取单菌落接于 LB 液体培养基中 150rpm、26摇 48hr，按菌液和甘油 1：1 加入 1.5ml 离心管混匀，-70保存。注意：从超低温冰箱内取出的甘油管，应尽量减少其在冰箱外的时间，用完后尽快放回冰箱；农杆菌在 LB 平皿内保存时间不宜过长应尽量保持新鲜；用MGL 培养基悬浮农杆菌时，某些菌株若出现结块，可在瓶内放入几根灭过菌的大头针，或者结合减少悬浮时间，在其结块前进行侵染。3浸染，共培养：
