牛乳糖合成酶LS酶联免疫分析ELISA.DOC

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资源描述

1、 1 牛乳糖合成酶 (LS)酶联免疫 分析( ELISA) 试剂 盒使用说明书 本试剂仅供研究使用 目的:本试剂盒用于测定 人 血清,血浆及相关液体样本中 乳糖合成酶 (LS)的 含量 。 实验原理 : 本试剂盒应用双抗体夹心法测定 标本 中 牛乳糖合成酶 (LS)水平。用纯化的 牛乳糖合成酶(LS)抗体包被微孔板,制成固相抗体,往包被单抗的微孔中依次加入 乳糖合成酶 (LS),再与HRP 标记的 乳糖合成酶 (LS)抗体结合,形成抗体 -抗原 -酶标抗体复合物 ,经过彻底洗涤后 加底物 TMB 显色。 TMB 在 HRP 酶的催化下转化成蓝色,并在酸的作用下转化成最终 的黄色。颜色的深浅和样

2、品中的 乳糖合成酶 (LS)呈正相关。用酶标仪在 450nm 波长下测定吸光度( OD值), 通过标准曲线 计算样品 中 牛乳糖合成酶 (LS)浓度。 试剂盒组成 : 试剂盒组成 48 孔配置 96 孔配置 保存 说明书 1 份 1 份 封板膜 2 片( 48) 2 片( 96) 密封袋 1 个 1 个 酶标包被板 1 48 1 96 2-8保存 标准品: 2700ng/L 0.5ml 1 瓶 0.5ml 1 瓶 2-8保存 标准品稀释液 1.5ml 1 瓶 1.5ml 1 瓶 2-8保存 酶标试剂 3 ml 1 瓶 6 ml 1 瓶 2-8保存 样品稀释液 3 ml 1 瓶 6 ml 1 瓶

3、 2-8保存 显色剂 A 液 3 ml 1 瓶 6 ml 1 瓶 2-8保存 显色剂 B 液 3 ml 1 瓶 6 ml 1 瓶 2-8保存 终止液 3ml 1 瓶 6ml 1 瓶 2-8保存 浓缩洗涤液 ( 20ml 20 倍) 1 瓶 ( 20ml 30 倍) 1 瓶 2-8保存 操作步骤 1. 标准品的稀释与加样:在酶标包被板上设标准品孔 10 孔,在第一 、 第二孔中分别加标准品 100l,然后在第一 、 第二孔中加标准品稀释液 50l,混匀;然后从 第一孔 、 第二孔中各取 100l 分别加到第三孔和第四孔,再在第三 、 第四孔分别加标准品稀释液 50l,混匀;然后在第三孔和第四孔中

4、先各取 50l 弃掉,再各取 50l 分别加到第五 、 第六孔中,再在第五 、 第六孔中分别加标准品稀释液 50ul,混匀;混匀后从第五 、 第六孔中各取 50l 分别加到第七 、 第八孔中,再在第七 、 第八孔中分别加标准品稀释液 50l,混匀后从第七 、 第八孔中分别取 50l 加到第九、第十孔中,再在第九第十孔分别加标准品稀释液 50l,混匀后从第九第十孔中各取 50l 弃掉。(稀释后各孔加样量都为 50l,2 浓度 分别为 1800ng/L, 1200ng/L , 600ng/L, 300ng/L, 150ng/L)。 2. 加样:分别设空白孔 (空白对照孔不加样品及酶标试剂,其余各步

5、操作相同) 、 待测样品孔 。 在酶标包被板上待测样品孔中先加样品稀释液 40l,然后再加待测样品 10l(样品最终稀释度为 5 倍)。 加样将样品加于酶标板孔底部,尽量不触及孔壁, 轻轻 晃动 混匀 。 3. 温育:用封板膜封板后置 37 温育 30 分钟 。 4. 配液: 将 30( 48T 的 20 倍)倍浓缩洗涤液用蒸馏水 30( 48T 的 20 倍)倍稀释后备用。 5. 洗涤:小心揭掉封板膜, 弃去液体, 甩干 ,每 孔加满洗涤液,静置 30 秒后弃去,如此重复 5 次,拍干。 6. 加酶:每孔加入酶标试剂 50l,空白孔除外 。 7. 温育:操作同 3。 8. 洗涤:操作同 5。

6、 9. 显色:每孔先加入显色剂 A50l,再加入显色剂 B50l,轻轻震荡混匀, 37 避光显色15 分钟 . 10. 终止: 每孔加终止 液 50l, 终止反应 (此时蓝色立转黄色) 。 11. 测定:以空白空调零, 450nm 波长依序测量各孔的 吸光 度( OD 值) 。 测定应 在加终止液后 15 分钟以内进行 。 注意事项: 1 试剂盒从冷藏环境中取出应在室温平衡 15-30 分钟后方可使用,酶标包被板开封后如未用完,板条应装入密封袋中保存。 2 浓洗涤液 可能 会有 结晶 析出,稀释时可在水 浴中加温助溶 ,洗涤时不影响结果。 3 各步加样均应使用加样器,并经常校对其准确性,以避免

7、试验误差。一次加样时间最好控制在 5 分钟内,如标本数量多,推荐使用排枪加样。 4 请每次测定的同时做标准曲线,最好做复孔。如标本中待测物质含量过高(样本 OD 值大于标准品孔第一孔的 OD 值),请先用样品稀释液稀释一定倍数( n 倍)后再测定,计算时请最后 乘以 总稀释倍数( n 5)。 5 封板膜只 限一次性使用,以避免交叉污染。 6 底物请避光保存。 7 严格按照说明书的操作进行,试验结果判定必须以酶标仪读数为准 . 8 所有样品,洗涤液和各种废弃物都应按传染物处理。 9 本试剂不同批号组分不得混用。 10. 如与英文说明书有异,以英文说明书为准。 样本处理及要求 : 1. 血清:室温

8、血液自然凝固 10-20 分钟,离心 20 分钟左右( 2000-3000 转 /分)。仔细收集上清,保存过程中如出现沉淀,应再次离心。 2. 血浆:应根据标本的要求选择 EDTA 或柠檬酸钠作为抗凝剂,混合 10-20 分钟后,离心20 分钟左右( 2000-3000 转 /分)。仔细收集上清,保存过程中如有沉淀形成,应该再次离心。 3. 尿液:用无菌管收集,离心 20 分钟左右( 2000-3000 转 /分)。仔细收集上清,保存过程中如有沉淀形成,应再次离心。胸腹水、脑脊液参照实行。 4. 细胞培养上清:检测分泌性的成份时,用无菌管收集。离心 20 分钟左右( 2000-3000 转 /

9、分)。仔细收集上清。检测细胞内的成份时,用 PBS( PH7.2-7.4)稀释细胞悬液,细胞浓度达到 100 万 /ml 左右。通过反复冻融,以使细胞破坏并放出细胞内成份。离心 20 分钟左右( 2000-3000 转 /分 )。仔细收集上清。保存过程中如有沉淀形成,应再次离心。 3 5. 组织标本:切割标本后,称取重量。加入一定量的 PBS, PH7.4。用液氮迅速冷冻保存备用。标本融化后仍然保持 2-8的温度。加入一定量的 PBS( PH7.4),用手工或匀浆器将标本匀浆充分。离心 20 分钟左右( 2000-3000 转 /分)。仔细收集上清。分装后一份待检测,其余冷冻备用。 6. 标本

10、采集后尽早进行提取,提取按相关文献进行,提取后应尽快进行实验。若不能马上进行试验,可 将标本放于 -20 保存,但 应 避免反复冻融 . 7. 不能检测含 NaN3 的样品 , 因 NaN3 抑制辣根过氧化物酶的( HRP)活性。 试剂盒性能: 1.样品线性回归与预期浓度相关系数 R 值为 0.95 以上 。 2.批内与批见应分别小于 9%和 11% 计算 : 以标准物的浓度为横坐标, OD 值为纵坐标,在坐标纸上绘出标准曲线,根据样品的OD 值由标准曲线查出相应的浓度;再乘以稀释倍数;或用标准物的浓度与 OD 值计算出标准曲线的直线回归方程式,将样品的 OD 值代入方程式,计算出样品浓度,再乘以稀释倍数,即为样品的实际浓度。 检测范围: 100ng/L -2000ng/L 保存条件及有效期: 1.试剂盒保存: ; 2-8 。 2有效期: 6 个月

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