1、生物化学实验考试试题细胞破碎 1 常用的细胞破碎的方法有哪些？ 机械法：研磨，高速捣碎机；物理法：反复冻溶，超声波破碎，压榨法；化学与生物化学法：自溶，溶胀法，酶解法，有机溶剂处理。 2 有机溶剂法破碎细胞原理，常用的有机溶剂有哪些 ？有机溶剂溶解细胞壁并使之失稳。比如笨、甲苯、氯仿、二甲苯及高级醇等 3 酶法破碎细胞原理：酶分解作用 4 反复冻融法破碎细胞原理：通过反复将细胞放在低温下突然冷却和室温下融化达到破壁作用 层析技术 1.什么叫层析技术？层析技术是利用混合物中各组分理化性质的差别（分子亲和力、吸附力、分子的形状和大小、分配系数等） ，使各组分以不同程度分布在两个相，其中一个是固定相
2、，另一个是流动相，从而使各组分以不同速度移动而使其分离的方法。 2、按层析过程的机理，层析法分哪几类？按操作形式不同又分哪三类？根据分离的原理不同分类，层析主要可以分为吸附层析、分配层析、凝胶过滤层析、离子交换层析、亲和层析等。按操作形式不同又分层析可以分为纸层析、薄层层析和柱层析。3.指出常用层析技术的应用范围。 凝胶层析法：脱盐；用于分离提纯；测定高分子物质的分子量；高分子溶液的浓缩 离子交换层析法：主要用于分离氨基酸、多肽及蛋白质，也可用于分离核酸、核苷酸及其它带电荷的生物分子 高效液相层析法：液-固吸附层析；液- 液分配层析；离子交换层析 4.SephadexG-100 凝胶柱层析分离
3、蛋白质原理是什么？ 大小不同的分子经过的路线长短不同而达到分离作用。5.用 Sephadex G25 脱盐时蛋白质和盐哪个先出峰？ 蛋白质 6.相对分子量为 8 万和 10 万的蛋白质能否在 SephadexG-75 柱中分开？为什么？ 不能,分子量差距太小。 7.将分子量分别为 a（90 000） 、b（45 000） 、c（110 000）的三种蛋白质混合溶液进行凝胶过滤层析，正常情况下，将它们按被洗脱下来的先后排序。 c、a 、b 8.离子交换层析与凝胶过滤哪种分辨率高？ 离子交换层析较高。 9.如果样品中只有 Ala 和 His(Ala pI=6.0,His pI=7.6)，在 pH4
4、 条件下，这两种氨基酸那一种与 CM（阳离子交换剂）结合的紧密？如果用 pH4-7 的洗脱液梯度洗脱，那种氨基酸先洗脱出来？ Ala 10. 柱层析时湿装柱的注意事项有哪些？ 用水灌注、不能有气泡。 11.说说离子交换层析中洗脱液的选择原则 阴离子交换剂选用阳离子缓冲液（如氨基乙酸、铵盐、Tris 等） ，阳离子交换剂选用阴离子缓冲液（如乙酸盐、磷酸盐等） ，以防缓冲离子参与交换过程，降低交换剂的交换容量。缓冲液 pH 值的选择要使被分离物质的电荷与平衡离子电荷的正负性相同。选用的缓冲系统对分离过程无干扰。要确定一定的离子强度。 12、离子交换层析的原理：离子交换层析法是以具有离子交换性能的物
5、质作固定相,利用它与流动相中的离子能进行可逆的交换性质来分离离子型化合物的一种方法。 13、亲和层析的原理：亲和层析是应用生物高分子与配基可逆结合的原理,将配基通过共价键牢固结合于载体上而制得的层析系统。这种可逆结合的作用主要是靠生物高分子对它的配基的空间结构的识别。 14、吸附层析的原理：组份在吸附剂表面吸附固定相是固体吸附剂, 各能力不同而进行分离的方法。 15、试述凝胶层析原理，并列出常用凝胶名称凝胶层析柱装有多孔凝胶，当含有各组分的混合液流经凝胶层析柱时，各组分在层析柱内同时进行两种不同的运动。一种是随着溶液流动而进行的垂直向下的移动，另一种是无定向的分子扩散运动。大分子物质由于分子直
6、径大，不能进入凝胶微孔，只能分布于凝胶颗粒的间歇中以较快速度流过凝胶柱。较小的分子能进入凝胶微孔，不断进出一个个颗粒的微孔内外，因此流动速度较慢，从而使混合溶液中各组分按照相对分子量由大到小顺序先后流出层析柱得到分离。 常用凝胶：葡聚糖凝胶、琼脂糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶。 16、说明纸层析和离子交换层析分离氨基酸混合物的方法是根据氨基酸的什么性质? 纸层析是分配层析，利用分配系数不同，即氨基酸在两相中的溶解能力不同。离子交换层析利用氨基酸是两性物质，在一定 pH 下不同氨基酸带电性质和带电量不同，因此交换能力不同。 17、简述薄层层析法分离糖类的原理? 薄层层析的实质就是吸附层析，也就是在铺有吸
7、附剂的薄层上，经过反复地被吸附剂吸附以及被扩展剂扩展的过程。而吸附剂对不同的物质的吸附力不同，从而使糖在薄层上的涌动速度不同达到分离的目的纸层析分离氨基酸 1为什么苯丙氨酸的 Rf 值大于赖氨酸 因为水与滤纸的吸附性很强，故扩散的慢，邮寄溶剂与滤纸吸附性差，故扩散的快。苯丙氨酸是非极性氨基酸，其易随着有机溶剂一起扩散，而赖氨酸正好相反。故最后苯丙氨酸走的更远些，因而使苯丙氨酸 Rf 较大些。 2为什么脯氨酸和茚三酮加热后是黄色斑点 脯氨酸等伯胺氨基酸与茚三酮反应可生成黄色化合物。 4纸层析和柱层析的一般操作步骤 纸层析：点样、层析、标记前沿、烘干、显色、得到层析图谱、标记色斑 柱层析：装柱、平
8、衡、上样、洗脱、收集、检测、测定 5.何谓 Rf 值？影响 Rf 值的因素？Rf 是原点到层析中心的距离与原点到溶剂前沿的距离之比。Rf 的大小与物质的结构，性质，溶剂系统，层析滤纸的质量和层析温度有关，对同一种物质来讲 Rf 是一个常量。电泳原理 1、电泳的原理：电泳是指带电颗粒在电场的作用下发生迁移的过程。许多重要的生物分子，如氨基酸、多肽、蛋白质、核苷酸、核酸等都具有可电离基团，它们在某个特定的 pH 值下可以带正电或负电，在电场的作用下，这些带电分子会向着与其所带电荷极性相反的电极方向移动。电泳技术就是利用在电场的作用下，由于待分离样品中各种分子带电性质以及分子本身大小、形状等性质的差
9、异，使带电分子产生不同的迁移速度，从而对样品进行分离、鉴定或提纯的技术。 2.常见的凝胶电泳有哪几种？说明其主要用途，并比较其主要优缺点。 A醋酸纤维素薄膜电泳。用于血清蛋白，血红蛋白，球蛋白，脂蛋白，糖蛋白，甲胎蛋白，类固醇及同工酶等的分离分析中。优点是操作简单、快速、廉价缺点是它的分辨力不够高。 （比聚丙酰胺凝胶电泳低） B凝胶电泳。用于分子生物学、遗传学和生物化学，如大的 DNA 或者 RNA 分子的分离，酶谱法等。优点是操作简便快速，可以分辨用其它方法（如密度梯度离心法）所无法分离的 DNA 片段。 C等电聚焦电泳。应用蛋白质和两性分子的分离等。两性优点是分辨率高，区带清晰、窄，加样部
10、位自由，重现性好，可测定蛋白或多肽的等电点。缺点是需无盐溶液，不适用于在等电点不溶解或发生变性的蛋白。 3.从分离原理和实际应用两方面简单说明 SDS-PAGE 和 PAGE 技术方法有何主要区别？非变性凝胶电泳，也称为天然凝胶电泳，与变性凝胶电泳最大的区别就在于蛋白在电泳过程中和电泳后都不会变性。最主要的有以下几点： A. 凝胶的配置中非变性凝胶不能加入 SDS，而变性凝胶的有 SDS。 B. 电泳载样缓冲液中非变性凝胶的不仅没有 SDS，也没有巯基乙醇。 C.在非变性凝胶中蛋白质的分离取决于它所带的电荷以及分子大小，不像 SDS-PAGE电泳中蛋白质分离只与其分子量有关。 D.非变性凝胶电
11、泳中，酸性蛋白和碱性蛋白的分离是完全不同的，不像 SDS-PAGE 中所有蛋白都朝正极泳动。非变性凝胶电泳中碱性蛋白通常是在微酸性环境下进行，蛋白带正电荷，需要将阴极和阳极倒置才可以电泳。 因为是非变性凝胶电泳，所有的电泳时候电流不能太大，以免电泳时产生的热量太多导致蛋白变性，而且步骤都要在 0-4 度的条件下进行，这样才可以保持蛋白质的活性，也可以降低蛋白质的水解作用。这点跟变性电泳也不一样。 所以与 SDS-PAGE 电泳相比，非变性凝胶大大降低了蛋白质变性发生的机率。 4、试分析影响电泳的主要因素有哪些？ （1）带电颗粒的大小和形状：颗粒越大，电泳速度越慢，反之越快； （2）颗粒的电荷数
12、：电荷越少，电泳速度越慢，反之越快； （3）电场强度：电场强度越小，电泳速度越慢，反之越快； （4）溶液的 pH 值：影响被分离物质的解离度，离等电点越近，电泳速度越慢，反之越快； （5）溶液的粘度：粘度越大，电泳速度越慢，反之越快； （6）离子强度：离子强度越大，电泳速度越慢，反之越快；（7）电渗现象：电场中，液体相对于固体支持物的相对移动； （8）支持物筛孔大小，孔径越小，电泳速度越慢，反之越快。5.聚丙烯酰胺凝胶电泳分离血清蛋白时，使用的电泳缓冲液 PH8.3，那么样品应点在哪端？为什么？ 在负极。因为电泳缓冲液 PH8.3 时，血清蛋白的几种蛋白电离后都带上负电荷，所有只有点样在负极端
13、，外加电压后，才能向正极移动，彼此才能分开。 （PH 值大于等电点时带负电荷 ,小于等电点时带正电） 6.简述不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳中的三个不连续及三种物理效应。 三个不连续：（1）凝胶由上下两层凝胶组成，两层凝胶的孔径不同； （2）缓冲液离子组成及各层凝胶的 pH 不同； （3）在电场中形成不连续的电位梯度。 三种物理效应：（1）电荷效应：酶蛋白按其所带电荷的种类及数量，在电场作用下向一定的电极以一定的速度泳动。 （2）分子筛效应：分子量、形状不同的分子在经过凝胶孔径过程中，受到的阻力不同，因此移动速率不等。 （3）浓缩效应：使待分离样品中的各组分在浓缩胶中被压缩成层，使原来很稀的样品得到
14、高度的浓缩。 7、为什么 SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳可以用来测定未知蛋白质的相对分子质量？在聚丙烯酰胺凝胶系统中，加入一定量的十二烷基硫酸钠（SDS ） ，形成蛋白质SDS复合物，这种复合物由于结合了大量的 SDS，使蛋白质丧失了原有的电荷状态，形成了仅保持原有分子大小为特征的负离子团块，从而降低或消除了各种蛋白质分子之间的天然的电荷差异，此时，蛋白质分子的电泳迁移率主要取决于它的分子量大小，而其它因素对电泳迁移率的影响几乎可以忽略不计。当蛋白质的分子量在 15000200000之间时，电泳迁移率与分子量的对数值呈直线关系，符合下列方程： 10Mr = b?mR + K 8、连续聚丙烯酰胺凝胶电
15、泳与不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳有什么不同？不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳包含了两种以上的缓冲液成分、pH 值和凝胶孔径，而且在电泳过程中形成的电位梯度亦不均匀。由此产生的浓缩效应、电荷效应和分子筛效应。9、聚丙烯酰胺凝胶电泳的主要优点及用途：聚丙烯酰胺凝胶是由丙烯酰胺和 N，N甲叉双丙烯酰胺聚合而成的大分子。凝胶有 格子是带有酰胺侧链的碳-碳聚合物，没有或很少带有离子的侧基，因而电渗作用比较小，不易和样品相互作用。 由于聚丙烯酰胺凝胶是一种人工合成的物质，在聚合前可调节单体的浓度比，形成不同程度交链结构，其空隙度可在一个较广的范围内变化，可以根据要分离物质分子的大小，选择合适的凝胶成分，使之既有适宜的
16、空隙度，又有比较好的机械性质。当丙烯酰胺的浓度增加时可以减少双含丙烯酰胺，以改进凝胶的机械性能。 在一定浓度范围聚丙烯酰胺对热稳定。凝胶无色透明，易观察，可用检测仪直接测定。 丙烯酰胺是比较纯的化合物，可以精制，减少污染。合成聚丙烯酰胺凝胶的原料是丙烯酰胺和甲撑双丙烯酰胺。丙烯酰胺称单体，甲撑双丙烯酰胺称交联剂，在水溶液中，单体和交联剂通过自由基引发的聚合反应形成凝胶。 10、琼脂糖凝胶电泳的优点？（1）琼脂含液体量大，可达 98-99%，近似自由电泳，但是样品的扩散度比自由电泳小，对蛋白质的吸附极微。 （2）琼脂作为支持体有均匀，区带整齐，分辨率高，重复性好等优点。 （3）电泳速度快。 （4
17、）透明而不吸收紫外线，可以直接用紫外检测仪作定量测定。 （5）区带易染色，样品易回收，有利于制止备。然而琼脂中有较多硫酸根，电渗作用大。琼脂糖是从琼脂中提取出来的，是由半乳糖和 3.6-脱水-L- 半乳糖相互结合的链状多糖。含硫酸根比琼脂少，因而分离效果明显提高。 琼脂（糖）电泳常用缓冲液的 pH 在 6-9 之间，离子强度为 0.02-0.05。离子强度过高时，会有大量电流通过凝胶，因而产生热量，使凝胶的水份量蒸发，析出盐的结晶，甚至可使凝胶断裂，电流中断。常用的缓冲液有硼酸盐缓冲液与巴比妥缓冲液。为了防止电泳时两极缓冲液槽内 pH 和离子强度的改变，可在每次电泳后合并两极槽内的缓冲液，混匀
18、后再用。 11、凝胶电泳的一般操作步骤：制胶，加入电泳缓冲液，加样，电泳，剥胶，染色，脱色。蛋白质电泳 1、简述血清蛋白的醋酸纤维薄膜的电泳原理？血清蛋白中各种蛋白质离子在电场力的作用下向着与自身电荷相反的方向涌动，而各种蛋白质等电点不同，且在 PH 为 8.6 时所带电荷不同，分子大小不等，形状各有差异，所以在同一电泳下永动速度不同从而实现分离。2、醋酸纤维薄膜电泳时点样端应靠近电极的哪一端，为什么？电泳时点样端应靠近负极，因为血清中各种蛋白质在 PH 为 8.6 的环境中均带负电，根据同性相吸，异性相斥原理，点样端在负极时蛋白质向正极泳动从而实现蛋白质分离。3、血清醋酸纤维薄膜电泳可将血清
19、蛋白依次分为哪几条带？哪带电泳最快？影响电泳速度有哪些？有血清蛋白、a1-球蛋白、a2-球蛋白、b- 球蛋白、r- 球蛋白；其中血清蛋白点用最快。影响因素蛋白质所带电荷数，分子大小与形状以及缓冲液浓度。4、醋酸纤维薄膜电泳分离人血清实验方法中，电压正常范围是多大？电压过大会造成什么样的结果？ 电泳电压的大小，时间的长短与缓冲液的离子强度都有一定的关系。一般电流约0.40.6mA/cm，电压 110160V，通电时间 4060min。电压高，电流大，电泳速度加快，时间缩短，但薄膜上蒸发严重，因此不能无限增大电流。5、PAGE 是现代生物科学研究中主要用来分离分析蛋白质、酶等生物大分子的核心技术之
20、一，该技术分辨率较高的主要因素有哪几种？简要说明。 A.聚丙烯酰胺凝胶是一种透明而不溶于水的韧性凝胶，其在电泳中除了具有电泳的分离外，还具有分子筛的作用，故而提高了分辨率 B聚合物分子中含有许多酰胺基，所以凝胶具有良好的亲水性，能在水中溶胀但不溶解。 蛋白质含量测定 1 紫外吸收法与 Folin-酚比色法测定蛋白质含量相比，有何缺点及优点？ 紫外吸收法优点：简单快速，灵敏度高。缺点：核酸干扰 2 若样品中含有核酸类杂质，应如何校正？ 校正:计算待测蛋白质溶液的 OD280/OD260 比值后，查(紫外分光光度法测定蛋白质含量校正数据表）校正因子“F”值，根据经验公式-蛋白质浓度(mg/ml)=
21、F1/dOD280D 计算该溶液的蛋白质浓度；D-溶液的稀释倍数， d 比色杯的厚度（cm） 3 试说明考马斯亮蓝 G250 法的优缺点。 考马斯亮蓝 G250 当该染料与蛋白质结合后为青色 ，在波长 595nm 有最大吸收；其吸收值与蛋白质含量成正比。灵敏度高，是常用的微量蛋白质快速测定法。缺点：、大量的去污剂如 TritonX-100，SDS 等严重干扰测定。B、蛋白质与改染料2min 反应达平衡，其结合物在室温下 1h 内稳定。时间太长，结果偏低。 4 简述 4 种测定蛋白质含量的方法及其原理。 (1)考马斯亮蓝 G-250 染色法： 考马斯亮蓝 G-250 结合蛋白质后，形成蓝色 CB
22、G-蛋白质结合物，最大光吸收在595nm。在一定的蛋白质浓度范围内（10-1000ug/ml） ，CBG-蛋白质结合物的O.D595nm 值与蛋白质含量成正比，故可用分光光度法进行蛋白质的定量测定。 （2）双缩脲法： 蛋白质含有两个以上的肽键（-CO-NH-）因此，有双缩脲反应，在碱性溶液中蛋白质与 Cu2+形成紫色络合物，其颜色深浅与蛋白质含量成正比，而与蛋白质的相对分子质量及 aa 成分无关，故可以用来测定蛋白质含量； （3）Folin- 酚试剂法（ Lowry 法）： 是双缩脲法的发展，第一步涉及到碱性溶液中铜蛋白质复合物的形成，然后这个复合物还原磷钼酸磷钨酸试剂，产生深蓝色（钼蓝和钨蓝
23、混合物）比双缩脲法灵敏，但费时； （4）紫外吸收法： 蛋白质中一些氨基酸残基中的苯环含有共轭双键，所以蛋白质具有吸收紫外光的性质，最大吸收峰在 280nm 处，在一定范围内，蛋白质溶液的光吸收值与蛋白质含量成正比，可用作定量测定，简单、灵敏、快速、不耗样品，低浓度的盐类不干扰。 （5）微量凯式定氮法： 根据蛋白质的平均含氮量为 16%，因此，测得 1g 蛋白氮，相当于 6.25g 蛋白质。5 蛋白质的分离常用的方法有哪些？1、前处理：选择适当的破碎细胞的方法破碎细胞，组织细胞破碎后，选择适当的介质（一般用缓冲液）把所要的蛋白质提取出来。2、粗分离：当蛋白质混合物提取液获得后，选用一套适当的方法
24、，将所要的蛋白质与其他杂蛋白质分离开来。一般这一步的分级用盐析、等电点沉淀和有机溶剂分级分离等方法。这种方法的特点是简便、处理量大，既能除去大量杂质，又能浓缩蛋白质溶液。 3、细分离：也就是样品的进一步提纯，一般使用层析法，包括凝胶过滤层析，离子交换层析，吸附层析以及亲和层析等。必要时还可以选择电泳法。 6 蛋白质显色黄色反应的原理是什么?反应结果为什么深浅不一？含有苯环的氨基酸如酪氨酸和色氨酸，能被硝酸硝化成黄色的物质，而且不同蛋白质中所含的苯环数量不同，造成与试剂反应的程度不同，因此呈现颜色深浅不一 。双缩脲法测蛋白质含量 1.双缩脲法定量测生物材料中蛋白质是否适合所有样品，如植物块茎等
25、不是。在生物实验中，双缩脲是用来测蛋白质的，现在是出现紫红色。选材时要注意蛋白质含量要高，材料颜色为白色或接近白色。故并非适用所有样品。 2.比值法双缩脲法定量测定蛋白质含量的优缺点？ 优点：快速，蛋白质特异性影响小。 缺点：准确度差，蛋白质样品被破坏，干扰因素不易排除。 沉淀技术 1 蛋白质沉淀的常用方法有哪些 盐析沉淀法、等电点沉淀法、有机溶剂沉淀法 2 什么是盐析，盐析的原理，列举盐析时常用的盐 一般是指溶液中加入无机盐类而使某种物质溶解度降低而析出的过程。 原理：蛋白质在水中的溶解度受到溶液中盐浓度的影响。一般在低盐浓度的情况下，蛋白质的溶解度随盐浓度的升高而增加，这种现象称为盐溶。而
26、在盐浓度升高到一定浓度后，蛋白质的溶解度又随盐浓度的升高而降低，使蛋白质沉淀析出，这种现象称为盐析。在某一浓度的盐溶液中，不同蛋白质的溶解度各不相同，由此可达到彼此分离的目的。 主要有硫酸铵、硫酸镁、硫酸钠、氯化钠、磷酸钠 3 简述等电点沉淀及原理 通过调节溶液的 pH 值至某种溶质的等电点(pI)时，使其溶解度降低，沉淀析出，而与其他组分分离的方法称为等电点沉淀法。 原理：在等电点时，蛋白质分子以两性离子形式存在，其分子净电荷为零，此时蛋白质分子颗粒在溶液中因没有相同电荷的相互排斥，分子相互之间的作用力减弱，溶解度最小，最易形成沉淀物。等电点时的许多物理性质如黏度、膨胀性、渗透压等都变小，从
27、而有利于悬浮液的过滤。 4 什么是有机溶剂沉淀，列举常用的有机溶剂 利用要分离物质与其他杂质在有机溶剂中的溶解度不同，通过添加一定量的某种有机溶剂，使某种溶质沉淀析出，从而与其他组分分离的方法称为有机溶剂沉淀法。 常用的有机溶剂有乙醇、丙酮、异丙醇、甲醇等。 5 鸡蛋清可以用作铅汞中毒的解毒剂是为什么? 由于重金属离子能与蛋白质中带负电基团如COOH 等作用，生成难溶重金属的蛋白质盐，减少机体对重金属的吸收。6 影响蛋白质沉淀的因素是什么？沉淀和变性有什么联系？水溶液中的蛋白质分子由于表面形成水化层和双电层从而形成稳定的亲水胶体颗粒，在一定的理化因素影响下蛋白质颗粒因失去电荷和脱水而沉淀。这些
28、因素包括溶液的酸碱度、盐溶液的浓度、温度、重金属离子以及有机溶剂等。变性蛋白质不一定沉淀，沉淀的蛋白质不一定变性。沉淀时蛋白质可能仍然保持天然构像，而变性是蛋白质的高级结构被破坏失去活性。维生素 C 的测定 1.指出本实验采用的定量测定维生素 C 的方法有何优缺点？ 优点：简便易行，快速，比较准确。 缺点：易受其它还原物质干扰，滴定终点难以确定。 2. 2,6-D 的作用是什么？ A.氧化剂的作用。还原抗坏血酸。 B作为指示剂，判断滴定终点，以计算样品含量 3.滴定管的使用 洗涤、装液、计数、滴定 酶的提取纯化与活力测定 1. 从某细胞中提取的一种蛋白水解酶的粗提液 300mL 含有 150m
29、g 蛋白质，总活力为360 单位。经过一系列纯化以后得到的 4mL 酶制品(含有 0.08mg 蛋白) ，总活力为 288单位。请问回收率是多少？纯化了多少倍？比活力=酶活力单位数 /酶蛋白质量 纯化倍数 =纯化后的比活力 / 粗抽提液比活力 产率(回收率 ) =纯化后的总活力单位 / 粗抽提液总活力单位 2.简述酶分离纯化的基本过程 A抽提：破碎细胞，动植物组织一般可用组织捣碎器；或者加石英砂研磨，将材料做成丙酮粉或进行冰冻融解；对细菌，常采用加砂或加氧化铝研磨和超声波振荡方法破碎。 B浓缩：加中性盐或冷乙醇沉淀后再溶解，胶过滤浓缩以及超过滤浓缩法等。 C纯化：利用盐析法、有机溶剂沉淀法、层
30、析纯化法、等电点法吸附分离法进行纯化。D 结晶：浓缩液经过各种方法的纯化，可得到较纯的结晶产品。 4 酶的制备及提取过程中应注意哪些事项 3.常用的酶活力单位？ U（指特定条件（25，其它为最适条件）下，在 1 分钟内能转化 1 微摩尔底物的酶量）、Kat（在最适条件下，1 秒钟能使 1 摩尔底物转化的酶量） 。1 Kat=6107U， 1U=16.67n 比活力概念及意义 比活力用每毫克蛋白所含的酶活力单位数表示。 比活力=酶活力单位数/酶蛋白质量 酶的比活力比活力代表酶制剂的纯度。对于同一种酶来说，比活力愈大，表示酶的纯度愈高。 4.什么是抑制剂？什么是变性剂？区别是什么？凡是能使酶活性降
31、低而不使酶失活变性的物质成为抑制剂；凡是能引起蛋白质变性失活的物质叫变性剂。抑制剂只是抑制蛋白质的特性而变性剂则破环蛋白质的结构。淀粉酶活力的测定 1如何正确绘制和使用标准曲线? 在制备标准曲线时，标准液浓度一般可选择 5 种浓度梯度，测其吸光值，以浓度为横坐标，吸光值为纵坐标绘制曲线，需要至少有三个点标准曲线才可用，绘制好的标准曲线只能供以后相同条件下操作测定相同物质时使用。 2.淀粉酶原液和 1%的淀粉溶液置于 40水浴中保温的作用 酶反应需要适宜的温度。只有在一定的温度条件下才表现出最大活性。40C 是淀粉酶的最适温度，所以将酶液和底物先分别保温至最适温度，然后再进行酶反应，这样才能使测得的数据更准确。 3.3,5 二硝基水杨酸作用： 提供碱性环境，使酶失去活性；做氧化剂，与还原糖反应，起到显色作用。 4.淀粉酶的最适温度为 40C，最适 PH 为 5.6.5.如何操作能减小标准曲线结果误差？ A：标准液浓度的选择：在制备标准曲线时，标准液浓度选择一般应能包括待测样品的可能变异最低和最高指，一般选择 5 种浓度。浓度差距最好是成倍增加或等级增加，并应与被测液同样条件下显色测定。 B标准液的测定：在比色时，读取光密度至少读 23 次，求其平均值，以减少仪器不稳定而造成的误差。核酸
