1、1附 实验实习指导实习一、动物染色体标本的制备与观察一、实习目的：1.初步掌握动物骨髓染色体标本制备基本过程，了解操作步骤的原理。2.了解常用实验动物染色体的数目及特点。二、实习原理：凡细胞处于活跃增殖状态，或者经过各种处理后，细胞就可进入分裂的任何动物组织，均可用于染色体分析。在正常动物体内，骨髓是处于不断分裂的组织之一。给动物注射一定剂量的秋水仙碱即可使许多处于分裂的细胞停滞于中期，然后采用常规空气干燥法制备染色体，即可得到大量可分析的染色体标本。本方法简便、可靠，不需要经体外培养和无菌操作，易于推广。三、实验用品1.材料 小白鼠、无尾两栖类蛙属或蟾蜍属动物。2.器材 水平离心机、显微镜、
2、刻度离心管（ 10m1） 、注射器（1ml） 、载玻片、烧杯（400m1） 、量筒（100m1） 、试管架、镊子、剪刀、解剖刀、吸管。3.试剂(1)2%柠檬酸钠溶液：称取 2g 柠檬酸钠（柠檬酸三钠，Tri-sodium citrate,AR）溶解于 100ml 蒸馏水中。(2)1%柠檬酸钠溶液。(3)500ug/ml、100mg/m1 秋水仙素（cochicine）溶液。(4)Giemsa（姬姆萨）原液（pH6.8）Giemsa 染粉（Giemsa stain） 1g甘油（丙三醇，glycerine,AR） 31ml甲醇（methyl alcoholA,AR ） 45ml将染粉倾入研钵，加几
3、滴甘油，在研钵内研磨直至无颗粒为止，此时再将全部剩余甘油倒入，放入 6065保温箱中保温 2h 后，加入甲醇搅拌均匀，保存于棕色瓶中备用。(5)0.067mol/L 磷酸盐缓冲液（pH6.8）Na2HPO412H2O 11.81g（或 Na2HPO42H2O 5.92g）KH2PO4 4.5g溶解于蒸馏水中至 1000ml。(6)1:10Giemsa 磷酸缓冲液染液（pH6.8） 。(7)甲醇（AR） 。(8)冰醋酸（Acetic acid glacial,AR） 。(9)0.4%KCl（ potassium chloride,AR）溶液。四、实习内容1.小白鼠骨髓细胞染色体的制备方法(1)动
4、物按 4ug/g 体重的剂量经腹腔注射秋水仙素，34h 后杀死动物。(2)取出动物后肢的胫骨和股骨。剪去两端。(3)将 0.61ml2%柠檬酸钠用 1ml 注射器按上 5#针头注入骨髓腔，将骨髓细2胞先冲入小碟内，取下注射针头，反复吸打骨髓细胞，使细胞团块分散，转入10ml 离心管。(4)视骨髓量之多寡加入 0.4%KCl 溶液 810ml，随即将离心管置 370.5水浴中低渗 10min。(5)以 1000r/min 离心 8min。(6)弃上清液，沿离心管壁缓慢加入新配置的甲醇: 冰醋酸（3:1 ）固定液5ml，加固定液时注意不要冲动细胞团块。(7)加完固定液后，立即用吸管将细胞轻轻打均匀
5、，静置固定 20min。如此反复固定 23 次，每次 20min。(8)固定的细胞经离心后，吸去上层固定液，视管底的细胞多寡加入少量新配制的固定液，将细胞团块轻轻吸打成悬液。(9)在干净、湿、冷的载玻片上滴 23 滴上层细胞悬液，在酒精灯上文火烘干（在空气干燥的地方可不用） 。(10)将玻片标本平放于支架上，细胞面朝上，每片滴加 1:10Giemsa 磷酸盐缓冲液 34ml，染色 10min。(11)在自来水管下细流冲洗数秒，去掉 Giemsa 磷酸缓冲液，用小块纱布擦干玻片底面及四周，显微镜观察和分析。2.黑斑蛙或蟾蜍骨髓细胞染色体标本的制备(1)动物按 30ug/g 体重的剂量经腹腔注射秋
6、水仙素，78h 后杀死动物，取出肢股骨和胫骨，用纱布剥掉全部肌肉，剪去胫骨和股骨两部。(2)将 1ml1%柠檬酸钠溶液用 1ml 注射器通过 5#针头注入骨髓腔，细胞冲入小碟内。(3)摘掉针头，用注射器筒轻轻反复吸打，使分散成单个细胞。(4)将骨髓细胞转入离心管，视骨髓细胞量之多寡加入事先预热至260.5的 0.4%KCl 溶液 8ml，置 260.5水浴低渗 30min。(5)以后的固定、滴片、染色、观察、分析同“小白鼠骨髓细胞染色体的制备” 。五、观察1.在低倍镜下观察 Giemsa 染色之后的中期分裂相的形态。在显微镜下可观察到染色体被染为紫红色。2.在高倍镜下选择分散适度，不重叠的染色
7、体的分裂相，在油镜下（90或 100）进行观察六、作业1.记录所观察小白鼠、黑斑蛙或蟾蜍骨髓细胞染色体的数目和形态。2.绘制染色体图。3.为什么制备小白鼠染色体标本时秋水仙素只注射 4ug/g 体重，而蛙类需注射 30ug/g 体重？4.收集小白鼠骨髓细胞用 2%柠檬酸钠溶液，而收集蛙类骨髓细胞用 1%柠檬酸钠溶液，为什么？实习二、小鼠减数分裂标本的制备与观察一、实习目的3本实习是掌握精巢染色体标本制作方法，观察细胞减数分裂过程中不同时期的染色体，了解性细胞形成过程中的染色体状态。二、实习原理减数分裂，是性细胞形成过程中的特殊分裂方式。哺乳动物在性成熟后，精巢内的性细胞总是在分批分期相继不断地
8、成熟，因此，对哺乳动物的精巢进行一定的技术处理，随时都可获得减数分裂过程中各期染色体的标本。三、器材和试剂1.器材 显微镜、离心机、解剖器材、注射器、10ml 刻度离心管、试管架、吸管、培养皿、载玻片。2.试剂 2%柠檬酸钠溶液、0.4%KCl 溶液、冰醋酸、甲醇、秋水仙素（100ug/ml） 。3.实习材料 性成熟的雄性小白鼠四、实习步骤1.秋水仙素处理：取睾丸前 34h 先给小鼠经腹腔注入秋水仙素(按 4ug/g 体重)。2.取细精小管：用损伤脊髓法处死小鼠，放在解剖板上，固定四肢，剖开腹腔取睾丸放入盛有 2%柠檬酸钠溶液的小培养皿中。用小剪刀剪开包在睾丸最外层的腹膜和白膜，用尖头小镊子从
9、睾丸中挑出细线状的细精小管。更换的柠檬酸钠溶液将细精小管冲洗一次，再加 56ml 的柠檬酸钠溶液，一起吸入离心管中。3.制细胞悬液：待细精小管沉入离心管后，用吸管头将细精小管研碎（所选用的吸管要管头平齐） 。经反复研磨和吹打，可使处于减数分裂过程中的各期细胞脱落在溶液中。然后吸掉肉眼所见的膜状物，制成细胞悬液（同时有部分精子存在） 。4.收获细胞 经 1000r/min 离心 10min，去上清液。所得沉淀物，除少部分精子外，即是处于减数分裂过程中的各期细胞。5.低渗处理、固定、制片染色均与骨髓染色体制片实习相同（见实习一） 。五、观察1.寻找和观察处于第一分裂时期的分裂相，表现出 20 对同
10、源染色体相互配对的现象。20 对同源染色体中有 19 对染色体呈环状连接，只有 XY 染色体表现出特殊的一个末端和二个末端相接。而且 Y 染色体又出现一定程度的深染现象。2.寻找和观察第二次减数分裂过程中的中期染色体，观察处在染色单体尚未分离前的 20 个姊妹染色单体形态。六、作业绘制你在显微镜下看到的染色体在减数分裂过程中各个不同时期的图像，并用文字说明其主要特征。实习三 多基因性状的遗传分析一、实习目的 通过多基因性状的遗传分析，学会运用遗传的基本定律分析某些简单的遗传现象。4二、实习原理一对基因在杂合状态时，保持相对独立性。子一代在形成配子时，等位基因彼此分离到不同的配子中去。子二代基因
11、型分离比是 1:2:1，表型分离比是3:1。不同对的基因在形成配子时自由组合，但同一染色体上的基因常连锁在一起。三、实习方法通过对所给习题的分析，确定杂交后代的基因型和表型，以及杂交后代的比例。四、作业1.在家狗中，基因型 AB为黑色，aaB 赤褐色，A bb 红色，aabb 柠檬色。一只黑狗与柠檬色狗支配生一柠檬色小狗。如果这个黑狗与另一只基因型相同的狗交配，预期子代的比例如何？2.在兔子中，c 座位有三个复等位基因 C、c ch 和 c，各类基因型及其表型是：CC、Cc ch、Cc 深色cchcch、c chc 灰色cc 白色一只深色兔子与一只白色兔子杂交，产生 3 只灰色和 4 只深色的
12、兔子。问亲本的基因型如何？若 Cc 与 cchc 交配，预期其子代如何？3.豚鼠的黑色基因（C）对白化基因（c）是显性，毛皮粗糙基因（ R）对毛皮光滑基因（r ）是显性。在 5 种不同的交配中产生出各种不同比例的后代（如下表） ，试分折并写出各亲本的基因型，并用 2检验后代的比数。交 配 类 型 黑色粗糙 黑色光滑 白化粗糙 白化光滑黑色光滑白化光滑 0 18 0 14黑色光滑白化粗糙 25 0 0 0黑色粗糙白化光滑 10 8 6 9黑色粗糙白化粗糙 15 7 16 3白化粗糙白化粗糙 0 0 32 124.在火鸡的一个品系中，出现一种遗传性的白化症。养禽工件者把 5 只有关的公鸡进行测交，
13、发现其中 3 只带有白化基因。当这 3 只公鸡与无亲缘关系的正常母鸡交配时，得到 229 只幼禽，其中 45 只是白化的，而且全是雌的。你认为火鸡的这种白化症的遗传方式是怎样的？育种工作者为了消除白化基因，还想尽量多地保存其他个体。你看在 184 只表型正常的幼禽中，哪些个体应该淘汰，哪些个体可以放心地保存，应怎样做？实习四 遗传力的计算一、实习目的熟悉遗传力的原理和计算方法，并能应用于育种实践。二、实习原理性状的遗传力是某性状的育种值方差占表型总方差的比值，可以用百分数5或小数表示。遗传力是畜群的遗传特性，不是个体特性，因此要用群体资料来计算。不同年份、不同畜群的同一性状遗传力，由于受不同环
14、境条件的影响，计算结果会有差异；同一畜群中不同性状的遗传力也是不同的。在实际应用时，最好应用本场畜群资料来估测遗传力参数，而且应尽可能扩大样本含量，以减少取样误差，增加计算的正确性。三、方法步骤遗传力的公式是：PAVh2在此，h 2 代表性状的遗传力，V A 代表育种值方差，V P 代表表型值方差。由于育种值不能直接度量，因此，育种值方差只能用亲属的表型值资料间接估计，常用的方法有两种：1.由子代对一个亲本的回归系数估计遗传力计算公式为： h2=2bop式中，b op 表示子女对母亲或父亲的回归系数。以黑龙江生产建设兵团某部 1975 年育成母羊剪毛量及其母亲 1.5 岁剪毛量记录列入下表，试
15、用公畜内女母回归法估计剪毛量的遗传力。女母 种 公 羊22029 15214 25205 05222 61022 930871 5.52 4.60 3.95 4.68 6.63 5.78 4.43 3.10 5.10 4.90 6.00 5.892 4.32 5.20 5.69 5.12 3.76 5.36 4.68 4.20 4.93 5.50 5.88 7.353 4.66 5.45 4.99 3.30 7.06 5.80 6.25 5.10 7.30 7.85 5.00 4.204 7.39 3.94 4.55 5.75 5.70 5.80 5.70 4.00 5.07 4.72 5.8
16、4 5.105 7.45 5.33 7.43 5.10 5.04 4.00 5.61 4.00 5.60 5.50 5.24 8.006 6.54 3.15 5.14 4.07 6.30 5.30 7.18 5.40 6.65 5.20 9.62 5.927 5.13 3.95 9.09 5.44 3.91 5.36 4.34 3.70 4.96 5.30 3.22 7.308 6.26 6.00 5.89 4.44 4.60 3.40 6.75 4.70 6.51 3.60 5.72 4.949 6.85 7.36 6.53 4.45 9.54 6.30 3.61 3.70 4.49 4.8
17、0 5.15 7.0010 4.54 4.90 5.09 4.34 5.27 6.30 5.16 3.70 5.79 5.25 5.89 4.4211 6.98 3.90 5.23 4.98 4.54 5.40 5.95 4.50 6.70 4.30 7.80 7.7812 7.53 5.70 5.92 4.90 4.49 5.00 4.92 5.80 6.49 4.1013 4.67 5.57 5.68 4.60 5.88 5.00 4.70 4.70 4.59 4.2014 3.70 4.95 5.23 3.70 6.69 4.70 5.36 4.70 5.05 3.6615 4.49 4
18、.00 5.09 4.95 5.72 7.66ni 11 14 14 15 15 15O 65.64 79.48 79.18 81.21 83.17 87.21P 53.78 67.89 72.00 64.80 77.07 87.52O 2 405.4936 480.6276 476.0256 455.2133 471.3823 536.2325P 2 276.7496 335.4073 381.1926 285.9200 407.9159 544.6906OP 320.3866 389.1047 414.9366 357.5360 430.2174 510.9282(1) 整理资料 按种公羊
19、分组，将母女记录配对列成上表的形式(2) 计算公羊内平方和乘积和 由表中数据计算得到：N=84，O=475.89，P=423.06 ，O 2=2824.9749，P 2=2231.86810， ，OP=2423.10955904.268inO017.249inP.iP所以有：8703.21.24980.31222 iipw nPPS5610.2 5.iii OOP(3) 计算估计遗传力 剪毛量的遗传力为： 54.027.803.25612)()(2 pwopwSPbh2.由半同胞相关估计遗传力 同父异母或同母异父的兄弟姐妹为半同胞。用半同胞资料估计遗传力的公式为：h 2=4rHS在此，r HS
20、 是半同胞相关系数，根据生物统计原理，求半同胞相关系数的公式为： WSHMnr)1(式中，MS S 是公畜间均方，即公畜间平方和除以公畜间自由度；MS W 是公畜内均方，即公畜内平方和除以公畜内自由度，n 为女儿数。举例：4 头种公牛的 23 头女儿的乳脂率记录列入下表。用半同胞相关估计该性状的遗传力。公牛 半同胞女儿乳脂率记录（%） ni x x 2 iS1 3.8 3.5 3.6 3.4 3.5 5 17.8 63.46 3.56S2 3.3 3.4 3.7 3.2 3.5 3.4 6 20.5 70.19 3.42S3 3.6 3.7 3.5 3.6 3.4 3.8 3.5 7 25.1
21、 90.11 3.59S4 3.9 3.4 3.6 3.8 3.5 5 18.2 66.42 3.64总和 23 81.6 290.18(1)整理资料 以种公牛分组，将半同胞女儿记录列成上表的形式。(2)计算平方和、自由度及 n0，均方。156487.29.86590.28 236.815.1.2.0.222 iiSxnx75209.6.2891.022 iWnxS 71.354120 iisndfS=S-1=4-1=3 dfw=23-4=1905216.3687.0SdfM 027416.195.0WdfSM(3)求半同胞相关系数和遗传力 将上面计算的数据代入半同胞组内相关系数公式得： 13
22、65.0274.)170.5(0216. 6)1(0 WSHnr遗传力 h2=40.1365=0.5460四、作业1.某羊群育成母羊剪毛量资料经初步统计得二级数据如下，请用公羊内女母回归法估计剪毛量的遗传力。公羊组 n O P O 2 P 2 OP22029 11 9.7 -0.3 20.85 11.73 0.8361022 30 8.3 -1.7 21.39 22.57 6.7493087 30 8.1 19.6 43.85 122.20 9.2915214 14 9.5 2.0 35.37 6.56 2.0525205 14 9.1 2.1 33.89 11.29 9.0405222 23
23、 20.0 -0.3 55.86 46.29 10.13 122 64.7 21.40 211.21 220.64 38.08O 代表女儿的剪毛量，P 代表母亲的剪毛量，为了计算方便，每个实测值都减去 5 后进行统计，第二位小数四舍五入。2.利用上表中的女儿剪毛量资料采用半同胞相关法估计遗传力。实习五 遗传相关系数的计算8一、实习目的熟悉遗传相关系数的计算方法，并能应用于育种实践。二、实习原理遗传相关是两个性状育种值之间的相关。遗传相关系数的计算较复杂，要求资料的样本大，否则会出现很大的误差。因此，在实际育种中计算时，要尽量抽取大样本，才能保证估计值的可靠性。估计遗传相关系数的常用方法有两种：
24、一是亲子相关法，二是半同胞资料遗传相关估计法。本实习用后一种方法来估测性状的遗传相关系数。三、方法步骤对于大家畜而言，大量的全同胞资料较难得到，为扩大样本含量一般采用半同胞资料估计遗传相关。由于同父半同胞个体很多，与遗传力估计时一样，需要计算公畜内组内两性状方差组分和协方差组分来估计性状的遗传方差及它们间的遗传协方差。其计算公式为： )( ()()()( yWySxWxSxyxyA MMPr 式中，MP s(xy)是 x 和 y 性状的公畜间均积，等于 x 和 y 性状的公畜间乘积和（SP s(xy)）除以公畜间自由度（df s） ；MP w(xy)是 x 和 y 性状的公畜内均积，等于 x
25、和 y 性状的公畜内乘积和（SP w(xy)）除以公畜内自由度（df w） ；MS s(x)是 x性状的公畜间均方，MS w(x)是 x 性状的公畜内均方；MS s(y)是 y 性状的公畜间均方，MS w(y)是 y 性状的公畜内均方。举例：某种羊场部分母羊毛长和剪毛量的资料如下表所列，试用半同胞遗传相关估计方法，估计毛长和剪毛量的遗传相关系数。某种羊场 3 头公羊女儿的毛长和剪毛量记录及基本统计表（单位：cm、kg）公羊 女儿毛长(上行，x)和剪毛量（下行，y）记录 n x x 2 xyy y 210.0 11.0 11.0 10.0 9.5 10.0 9.5 1 8.6 8.8 7.1 8
26、.3 7.0 7.8 7.8 127.0 1252.511.0 9.5 8.5 10.0 7.5 9.5 13 1001.959.2 7.0 8.0 8.0 7.0 7.5 102.1 808.279.5 9.0 10.5 10.0 11.0 8.0 9.0 10.07.4 7.5 10.0 8.5 11.0 7.3 8.0 8.010.5 13.0 9.5 8.5 7.5 8.5 11.0 10.0 239.0 2325.02 8.8 11.0 7.8 8.7 8.5 7.9 8.4 9.0 25 2078.610.0 11.0 10.5 8.5 8.5 8.0 7.5 10.0 9.5 2
27、15.6 1883.8810.3 8.5 8.0 9.4 8.1 8.0 8.5 8.3 8.799.0 7.0 8.0 9.5 8.5 8.0 9.0 10.5 7.08.3 7.4 7.4 8.4 7.5 9.1 8.2 8.5 9.3 149.0 1323.53 9.0 9.0 8.0 8.5 10.0 10.5 8.0 9.5 17 1188.457.0 8.6 8.0 7.4 8.0 7.7 7.0 7.8 135.6 1088.86515.0 4901.0合计 55 4269.0453.3 3781.01(1)整理资料 如上表。(2)计算平方和、乘积和、自由度、均方及均积 208.
28、95.174925317222)( iixS nx6.80.4922)( ixw 9314.2068.47.26953.08.42753.0.1 176.350.4956.20.91.20.7834.38 8053.6.41.5.21.)()( 22)( 222)( ixywiixyS iywiiySnyxSPnyxnynydfs=S-1=3-1=2 dfw=n i-S=55-3=52104218.0593.216.734.0518.32.6370.15.964.208.)()()()(0()()()( wsSwyysyySwxxsxxSdfPMfdffMdff(3)计算遗传相关系数 2861
29、.095.4368.234.0 )734.02.)(37.1604.(8)( ()( ywysxwxsSxyA MSPr四、作业根据下列 3 头公牛女儿头胎产奶量和 12 月龄体重的资料，计算该两性状的遗传相关系数。3 头公牛女儿头胎产奶量和 12 月龄体重（单位：kg）A B C 公牛号女儿女儿序号 性状 产奶量 体重 产奶量 体重 产奶量 体重12345674370 3644720 3685310 3973340 3174360 3465560 4073360 3192990 3443820 3304200 3364490 3523740 2673920 3154700 3775010 3254160 3243870 3475510 324实习六 种畜系谱的编制与系谱鉴定一、实习目的家畜系谱是种畜的系统资料，它可作为选种选配的重要参考资料。系谱审查（鉴定）是种畜鉴定方法之一，通过系谱鉴定，对种畜的育种价值可作出初步判断。
