1、中国农业科学院究生院 基因工程原理复习题 1. 20 世纪 70 年代诞生基因工程的理论基础和技术基础是什么？ 答：理论基础： 在 40 年代确定了遗传信息的携带者是 DNA 而不是蛋白质，从而明确了遗传的物质基础问题； 在 50 年代揭示了 DNA 分子的双螺旋结构模型和半保留复制机理，解决了基因的自我复制和传递问题； 在 50 年代末和 60年代相继提出了中心法则和操纵子学说，成功地破译遗传密码，从而阐明了遗传信息的流向和表达问题。 技术基础： 用核酸内切限制酶和 DNA 连接酶进行 DNA 分子的体外切割与连接技术； 克隆载体构建技术； 大肠杆菌转化体系的建立； DNA 分子的核苷酸序列
2、分析技术； 核酸杂交技术； 琼脂糖凝胶电泳技术。 2. 何为 DNA 克隆？其主要的实验步骤。 答： DNA 克隆又称基因克隆，是指 将外源基因插入到克隆载体上形成重 组 DNA 分子群体，并转化到寄主细胞中进行复制，以便于分离纯化目的基因或特定的DNA 片段的实验操作 。 主要步骤： 从复杂的生物有机体基因组中，经过酶切消化或 PCR 扩增等步骤，分离出带有目的基因的 DNA 片段； 体外将带有目的基因的外源 DNA片段连接到能够自我复制的并具有选择标记的载体分子上，形成重组子 DNA 分子； 将重组子 DNA 分子转移到适当的受体细胞（寄主细胞），并与之一起增殖； 从 大量的细胞繁殖群体中
3、，筛选出获得了重组 DNA 分子的受体细胞克隆； 从这些筛选出的受体细胞克隆中，提取出已经得到扩增的目的基因，供进一步分析研究使用； 将目的基因克隆到表达载体上，导入寄主细胞，使之在新的遗传背景下实现功能表达，产生出人类所需要的物质。 3. 说明 mRNA 差别显示分离产物未知基因的基本原理并评述其优缺点。 答：原理： 几乎所有的真核基因 mRNA 分子的 3-末端都有一段 poly(A)尾巴。 因此，在 RNA 聚合酶作用下，可按 mRNA 为模板，以 oligo(dT)为引物合成出 cDNA 拷贝 ； 根据 mRNA 分子 3-端序列结构分析，在这段 poly(A)序列起点碱基之前的两个碱
4、基，除了倒二位的碱基为 A 的情况之外，只能有 12 种可能的排列组合 ； 根据上述 mRNA 分子结构特征设计的，用以反转录 mRNA 合成第一链cDNA 的下游引物，共 12 种，其通式为： 5-T11MN 或 5-T12MN。每一种此类人工合成的 3-端锚定 引物，都能够把总 mRNA 群体的 1/12 分子反转录成 mRNA-cDNA 杂种分子。因此，用 5-T11MN 引物或 5-T12MN引物，可以将整个 mRNA 群体在 cDNA 水平上，分成大致相等的位序列结构不同的 12 个分亚群体。 由于 3-端锚定引物合成的第一链 cDNA 群体中，代表某一特定细胞类型或发育阶段的 mR
5、NA 种的含量是相当低的，所以要把一种只在某一发育阶段或某种细胞类型中表达、而在另一发育阶段或某种细胞类型中不表达的目的基因分离出来，就需要进行 PCR 扩增，因此在 DDRT-PCR 反应中还需 5-端随机引物。 优点： 可以同时比较多个样品间基因表达的差异； 可以同时检测到“上游”及“下游”基因； 检测的灵敏度高，所需样品少，一些低丰度的 mRNA 亦可被检测出来； 结合使用 PCR 和序列胶电泳分析两项技术，使本法更加简单方便。 缺点： 假阳性比较高，通常可高达 50%-70%； 扩增条带的分子长度比较短小； 工作量大 。 4. 一种基 因产生多种蛋白质的原因分析。 答：主要原因： 许多
6、基因都有多个启动子。在真核断裂基因的转录过程中，可变启动子的使用常涉及到位于转录起点的可变首位外显子，每个 可变首位外显子都具有一个专有的启动子，可变首位外显子的不同导致翻译出的蛋白质也不同。 初级转录本的可变剪接。真核断裂基因的初级转录本，在不同类型的细胞或不同发育阶段的细胞中会发生不同形式的剪接作用，生成 具有不同序列结构特征、编码不同蛋白质异形体的成熟 mRNA 分子 。 次要原因： RNA 的编辑。 RNA 的编辑具有多种不同的效应，比如产生新的起始密码子、终止密码子或多肽链编码序列出现变化，因此改变了源自基因DNA 模板链的遗传信息，翻译出不同的蛋白质多肽。 基因重排。基因区段的转位
7、作用或随机连接会造成基因可变区固有排列顺序的改变或 DNA 重排，可使基因产生不同的蛋白质。 5. 影响酶切反应的因素及产生酶切星号活性的分析 答：影响因素： DNA 分子 的性质 : a. 酶切位点周围的碱基成分； b. 酶切位点的密度； c. DNA 分子的构型； d. DNA 分子的甲基化程度； 酶切的温度； DNA 制剂的纯度 。 产生酶切星号活性的分析： 酶用量与 DNA 样品的比值过高； 甘油浓度过高； 二价金属离子的变更； 金属离子浓度过低； 较高的 pH 值； 有机溶剂的污染。 6. DNA 转录与复制有哪些差别？ 答 ： 对引物的需求有别 ：转录不需要引物 ，而复制需要一对上
8、下游引物。 所用底物不同：转录 需要核糖核苷三磷酸： ATP、 GTP、 UTP 和 CTP，而复制需要脱氧核糖核苷三磷酸： dATP、 dGTP、 dTTP、 dCTP 模板的结合状态有异：转录 产物 RNA 要 从模板上解离出来 ，而复制产物DNA 始终 与模板结合 。 保真程度相差悬殊：转录产物错误率远高于复制产物。 涉及的范围不同：转录只 涉及 一个 基因或操纵子，而复制则涉及全部基因组。 7. 分别叙述原核基因组和真核基因组的结构特点 。 答： 原核基因组的结构特点： （ A）高效的遗传信息利用率： a. 既没有不必要的额外重复序列，也 极少存在无功能的冗余序列； b. 基因组以上的
9、核苷酸序列都是编码基因 c. 基因排列紧凑，同一个操纵子不同基因之间的间隔距离一般不超过 20bp，而且其中还存在着转录起始信号和终止信号； d. 存在着编码序列彼此重叠、编码不同蛋白质的重叠基因。 （ B）双链的编码功能； （ C）多基因聚集排列成操纵子结构形式； （ D）染色体基因组的拷贝数平均每细胞为 1.1 条，在富裕培养基中可高达 3 4 条。 真核基因组的结构特点： （ A）包装成特定的染色体结构； （ B）基因组的多倍性； （ C）具有大量的重复序列； （ D）高比例的非编码的 DNA 序列，以人为例，非编码序列占基因组总长的98%以上，而蛋白质编码基因的序列还不到基因组总长的
10、2%。包括基因与基因之间的非编码的 DNA 序列，以及基因内部的非编码的 DNA 序列。 （ E） 庞大的基因数量； （ F）基因分布密度不均一。 8. 何为柯斯质粒载体，其结构、特点是什么？ 答 : 定义：柯斯质粒载体是人工构建带有噬菌体的 cos 位点和 E.coli 质粒的复制子的新型质粒载体。它具有质粒载体的特点和噬菌体的特点。 结构： a. 具一个质 粒的复制起点（ ori） ; b.具若干来自质粒载体的选择记（ 1-2 个） ; c.具相当数量的来自质粒的核酸内切酶的单切点 ; d.具有噬菌体的 cos 位点。 特点： 具有噬菌体的特点： a.导入寄主细胞后，可以重新环化起来； b
11、.经体外包装后转导效率大大提高 ; c.无法进入溶菌周期，也不能形成噬菌体颗粒。 具质粒载体特点： a.在寄主细胞内可 像质粒 DNA 一样复制； b.在氯霉素作用下扩增； c.具有抗生素抗性记号。 具有高容量的克隆能力：上限 45kb，下限 30kb； 能与带有同源序列的质粒 DNA 重组。 9. 简述构建 cDNA 克隆的定义、主要步骤及其优越性？ 答：定义： cDNA 克隆：从 mRNA 出发，经反转录、与载体分子重组、转化寄主细胞增殖，将目的基因克隆化的过程称为 cDNA 克隆。从理论上讲该生物的每一种 mRNA 都应有一个克隆。故亦称 cDNA 文库 步骤： 提取处于特定发育阶段的真
12、核生物体的特定器官或组织中的总 RNA， 根据 mRNA poly(A)尾特点过 Oligo(dT)柱，分离纯化出 mRNA； 利用适当引物 (一般用 Oligo(dT)和反转录酶，获得 cDNA/mRNA 杂合分子。 用碱处理降解，或用 RNaseH 酶切割 cDNA/mRNA 杂合分子中的 mRNA链获得 cDNA 第一链，再由第一链 cDNA 合成第二链 cDNA。 双链 DNA 与适当的载体重组，将重组体的群体导入大肠杆菌寄主细胞中增殖，从而构成 cDNA 文库。 优越性： a.以 mRNA 材料出发，对于 RNA 病毒特别适用； b.库容量小（相当 DNA 文库的 15）筛选工作量小
13、； c.假阳性比例小，因每一种 mRNA 就应有一个克隆； d.能用于研究分析发育过程中基因的时空表达差异。 10. 表达载体的组成： 答： 原核启动子，最好是诱导型的强启动子，使外源 基因蛋白表达量占总蛋白的 10-30%，如果表达的是毒蛋白，启动子应呈现低限的基础转录水平； 多克隆位点 (MCS)，用于插入外源基因； 抗生素抗性基因，用作选择标记； 复制起点 (ori)，决定外源基因的拷贝数 ; 转录终止子，防止启动子通读作用，提高蛋白质的稳定性； 翻译起始序列和转译增强子； 翻译终止子，防止核糖体的跳跃 (Skipping)。采用四联核苷酸 UAAU 效果更好。 11. 酵母双杂交体系的
14、原理及其用途是什么？ 答： 原理 : 如同许多真核生物的转录因子一样，酵母 -半乳糖苷酶的转录因子GAL4 也含有两个结构上可分开的、功能上相互独立的结构域，即 DNA结合域 (DNA_BD)和转录激活域 (AD)。应用 DNA 重组技术，可以把 GAL4转录因子的这两个结构域分开。如果把它们放置在同一个酵母细胞中，所产生的 GAL4 DNA-BD 和 AD 多肽，彼此之间不会直接发生相互作用，所以不具有 转录因子的功能活性，无法激活相关基因转录，。但是应用DNA 重组技术，将两个分开的 GAL4 的 DNA-BD 和 AD，甚至分别来自两个不同的转录因子的 DNA-BD和 AD重组成一个转录
15、因子 (使之在空间上彼此靠近 )则又可重新获得转录因子的功能活性，即可激活相关基因的转录。酵母双杂交体系就是根据这种原理建立的。酵母双杂交体系包括两种大肠杆菌 -酵母菌的穿梭载体（ DNA-BD 质粒载体和 AD 质粒载体）；和一种特殊的己经缺失了内源 GAL4 转录因子的酵母寄主菌株。 用途：酵母双杂交体系简称 Y2H，是在转录因子结构的基础上发展 出来的一种敏感的体内鉴定基因的方法。可用来有效地分离与己知靶蛋白相互作的另一种蛋白质编码基因，也是分离与某种特定启动子调控元件结合的特异性转录因子的有效手段。 酵母双杂交体系 还 可以用于产物未知基因的分离、也可用于新基因功能的鉴定。 12. 用
16、于克隆真核基因的大肠杆菌表达体系的优点和条件 答：优点： 背景知识清楚，分子生物学、遗传学的基础研究，特别是表达调控知识丰富； 有完善安全的基因工程体系，包括安全的寄主菌株和载体系统； 早期转基因表达调控研究扎实，许多基因如胰岛素基因、生长素基因等，都能在大肠杆菌中高效地有效表达； 易工业化批量生产，培养方便、操作简单、成本低廉，特别是对药用蛋白发酵生产。 条件： 真核基因的编码序列必须是连续的 cDNA，因为原核细胞中不具备剪辑加工的酶； 原核的启动子，最好是诱导型的强启动子； 以融合蛋白质的形 式表达，稳定性好。 13. DNA 标签法分离产物未知基因的原理及主要步骤 答：原理： DNA
17、标签法是根据 DNA 的插入突变作用的原理，利用已知的插入序列为探针，分离产物未知基因的方法。 主要步骤： 将一段特定的已知序列的 DNA 插入到基因组中目的基因的内部或其邻近位点，便会诱发基因突变，形成突变体； 利用此插入 DNA 作 DNA 杂交的探针 ，从突变体植株的基因组 DNA 文库中筛选到突变的基因； 再利用筛选出的突变基因作探针，从野生型植株的基因组 DNA 文库中克隆出野生型的目的基因。 14. RNA 编辑（ RNA editing）： 答： 在有些基因的转录后加工过程中，会有大量的尿嘧啶核苷酸（ Us）加入到前体 mRNA（ pre-mRNA）的核苷酸序列中去，或是从 pr
18、e-mRNA 的核苷酸序列中删除下来，甚至还会发生核苷酸碱基的取代反应。这种在 RNA 转录本成熟、修饰过程中发生的核苷酸的加入、删除或取代的现象，叫做 RNA 编辑。 15. 微量碱法分离纯化质粒 DNA 的原理 及 其 主要步骤 答： 原理 及其主要步骤 ： 质粒 DNA 与染色体线性 DNA 在拓扑学上的差异 :质粒 DNA（ cccDNA）是共价闭合双链超盘旋构型的小分子 DNA，而细胞染色体 DNA 在细胞裂解分离过程中断裂成线性 DNA（ LDNA），虽然在化学本质上没有本质区别，但在高级结构拓扑学上存在差异。 差异碱变性 : 在 pH 12.0-12.5 高 pH 条件下，线性的
19、 DNA 容易变性解链，而质粒 DNA 不易变性或很少变性。 酸复性 : 在 pH4.8 条件下， cccDNA 很快复性，而线性的染色体 DNA不可逆的变性并与蛋白质、 RNA 形成沉淀物，通过离心可以把 LDNA与 cccDNA 分开。 cccDNA 在上清液中。 酒精沉淀 cccDNA: 以 2.5 倍的 95% 酒精沉淀质粒 DNA， (浓度为 66%沉淀最好 )。保存在 TE（ pH8.0）缓冲液中，放置在 -20 下保存备用。 16. 图示 ZAP 载体的组成结构及优点 及其 内删除源理 答： T3-MCS- T7 _ _ cos_ pBluescriptSK 噬菌粒 _ _ _
20、_ _ _ cos I LacZ T 组成结构： 含有具内删 除特性的 pBbluescriptSK 噬菌粒； 在 pBbluescriptSK 噬菌粒两端具有 f1 的起始子（ I）和终止子（ T）； 在 pBbluescriptSK 噬菌粒内部具有多克隆位点 MCS； 在多克隆位点的两端带有 T3 和 T7 启动子； 在该载体的两端具有 cos 末端。 优 点： 可克隆 10kb 大小的外源 DNA； 当外源 DNA 插入取向和读码结构正确，就能表达出融合蛋白质，并可用抗体筛选； 当外源 DNA 插入在多克隆位点，使 -半乳糖苷酶失活，故可用 X-gal显色的组织化学筛选重组子（白色为重组
21、子）； 克隆的外源 DNA 可在体内随 pBbluescriptSK 噬菌粒删除下来，省去了常规的亚克隆； 利用 T3 或 T7 噬菌体的 RNA 聚合酶，可方便地制备外源插入的 DNA 的任何一条链的 mRNA； 可定向克隆。 内删除原理：当含有外源 DNA 插入的重组 ZAP 载体，感染大肠杆菌 F+菌株，在用辅助噬菌体 M13（或 1）超感染。于是，在细胞内由此辅助噬菌体基因反式作用蛋白质，便会识别位于 ZAP 载体上的 1 起始子和终止子，并最终导致含有外源 DNA 插入的 pBbluescriptSK 噬菌粒在体内从 ZAP 载体上删除下来 ，最终被辅助噬菌体 M13 的蛋白质包装成
22、单链 DNA 噬菌体颗粒，并被挤出寄主细胞。 17. M13 克隆体系中 -半乳糖苷酶 Xgal 的显色原理 及其优越性 答：原理： M13 克隆体系包括 M13 克隆载体和 M13 特殊的寄主菌株两部分组成。 -半乳糖苷 (LacZ)当它为四聚体时具有活性，可把无色的 X-gal 切割成半乳糖和深蓝色靛蓝，因此 Xgal 可作为 -半乳糖苷酶活性的一种指示剂。依据基因内互补作用的原理，利用基因工程的方法，即将编码同样的蛋白质多肽链序列，但各自具突变的序列，当这种载体转入到特殊的寄主菌株中便组成具有 功能活性的多肽的生化过程。根据这一原理，在 M13 克隆载体种上 LacZ Hind片段具有
23、-半乳糖苷酶第 2-92 位氨基酸，大肠杆菌 F 因子上带有缺失了第 11-42 位氨基酸的缺陷性 LacZ(简称 M15 基因 )。当 M13 载体感染了这种 M13 特殊的寄主菌株如 JM101 后，便会产生具有功能活性的 -半乳糖苷酶，于是在含有指示剂 Xgal 和诱导物 IPTG 的培养基中，就会出现蓝色的噬菌斑。但当外源基因插入到 M13 克隆载体时，无法形成四聚体的具活性的 LacZ，就不能切割 Xgal，故白色噬菌斑为重组子。 18. 生命体遗传信息的 三个层次是 什么？ 答： 由基因组 DNA 中编码蛋白质的基因构成。已知在人类基因组中，此基因所占的比例还不到全部 DNA 序列
24、的 2%，然而它对于生命活动的重要性已经是众所周知的事实。 第二个层次仅含有非编码的 RNA（ non-coding RNA,ncRNA）基因，主要包括 rRNA 基因、 tRNA 基因、 snoRNA 基因以及 miRNA 基因和 siRNA 基因等。这类 RNA基因存在于基因组 DNA 广袤的非编码蛋白质的序列中，如同蛋白质编码基因一样， RNA 基因在生命过程中的作用也是不可或缺的。 第三个层次为表观遗传信息层（ epigenetic layer of information）。它是贮藏于环绕在 DNA 分子的周围、并同 DNA 相互结合的蛋白质及其他化合物当中。尽管目前我们对于表观遗传
25、信息层的功能效应尚不十分清楚，但有大量的报告提示它对于生命体的作用，可能比 RNA 基因信息层还要重要。一般认为表观遗传信息层可能在生长、发育、衰老（ aging）及癌变的过程中起到关键的作用。 19. 朊 蛋白研 究 进展。 答：朊病毒是由（ PrP）蛋白构成，它发现于生物体，甚至是健康的人和动物体上。然而， PrP 从感染方面的发现它拥有不同的结构和抗蛋白酶特性 ，这些酶在机体中通常都会被破坏。正常形态的蛋白质被称为 PrPC,而传染的形式被称为 PrPSc 这种疾病最早发现在羊身上。 关于其繁殖致病机理，目前主要形成了以下五大类假说： 逆中心法则假说 ： 蛋白质假说表明， 蛋白质结构也可
26、以不依赖核算进行复制，这一假设完全颠覆了中心法则中遵循的核酸是复制信息的中心。 PrPSc 为自己编码，即 PrPSc 指导 PrPSc 的合成，蛋白质本身作为遗传物质；与中心法则相比，蛋白质可以逆翻译为 mRNA，然后逆转录 DNA。 结晶假说 ： 该假说认为 PrP 蛋白在有 PrPSc 分子的情况下形成结晶时，晶格中的 PrPc 分子有螺旋构象转变成 PrPSc的折叠构象 .由此可见 PrP蛋白的构象转变并无核酸活动的参与。 构型诱变假说 ： PrPSc 可诱导正常的 PrPc 转变成 PrPSc，这一转变完全是翻译后过程，为蛋白质的二级结构发生变异。正常的 PrPc 主要由 4 个螺旋
27、环组成，其氨基端有15 个氨基酸是 PrPSc 的结合区域；当有 PrPSc 与之接触后， PrPc 就会发生构象改变，螺旋减少， 折叠增多 ，继而转变成 PrPSc。改变前后在蛋白质特异性方面存在较大差异。 诱导假说 ： 宿主细胞中含有 PrPSc 合成的遗传信息，但受到高度调节，难以激活。 PrPSc的侵染其作用正是在于激活为其编码的细胞基因，从而保证 PrPSc 大量增殖的顺利进行。 核酸参与假说 ： 美国学者 Deleault 等认为正常的 Prions 蛋白向其致病形式的有效转换需要寄主 RNA 分子的参与，虽然 Prions 蛋白和 RNA 分子处于不同的细胞位置，但是有理由相 信
28、 RNA 分子起着胞内分子传导的作用 。 20. 如 何理 解 “一种基因一种酶”假说的这种理论 ？ 答： 一种基因一种酶假说认为一种基因仅仅参与一种酶的生成，并决定该酶的特异性和影响表型。 G.W.Beadle 和 E.L.Tatum 在 1941 年发表了链孢霉中生化反应遗传控制的研究； Beadle 在 1945 年提出了一种基因一种酶的假说。以后发现，不仅链孢霉，而且细菌和酵母菌等各种生物由于生化突变都会引起特定酶的缺损，从而导致了特定的代谢反应阻滞，这进一步证明了这个假说的正确性。 有些酶是由不同的多肽链特异地聚合起来才会呈现有活性，也有一种基因所决定的同样多肽链是两种或两种以上不同
29、酶的组成成分。 有的基因能决定具有两种或两种以上作用的酶，也有几个基因所决定的多肽链通过聚合才能发挥作用。 随着酶学、蛋白质化学的进展、遗传学方法的进步，进一步弄 清楚了基因与酶的关系是建立在基因与多肽链严密对应的关系基础上的， 表示这种对应关系的学说就是一种基因一种多肽链假说。 21. 中心法则的核心 思想 是什么？及其 补充与发展 。 答： 核心思想： 指遗传信息从 DNA 传递给 RNA，再从 RNA 传递给蛋白质，即完成遗传信息的转录和翻译的过程。也可以从 DNA 传递给 DNA，即完成DNA 的复制过程。这是所有有细胞结构的生物所遵循的法则。 补充与发展：指在某些病毒中， RNA 可
30、以 自我复制（如烟草花叶病毒等） ， RNA还可以自身为模板反 转录成 DNA（某些致癌病毒）。 22. 基因 的 表达 量与哪些因素有 关 ， 真核生物中单拷贝的蛋白质编码基因如 何满足 生命体的 需求。 答：相关因素： 基因自身的结构： 比如 启动子的 强弱、调控元件的多少和类型等 ； mRNA 的稳定性； 转录终止子信号强弱； 有机体所处的特定发育阶段或外界环境因素的刺激。 策略：真核生物中，每个单拷贝 的蛋白质编码基因 能转录出大约个 104mRNA,而每个 mRNA 又能翻译出 105个相应蛋白质。总的来说，一个基因能表达出 109 个蛋白质，故能 满足生命体的需求。 这也是 真核生物 基因组中 虽然只有 2%的基因是编码基因，但仍能满足生命需求的原因。
