1、基础毒性作用Basic Toxicity,阎小艳 2016.9,基础毒性（basic toxicity）：外源化学物质在一定的剂量、一定的接触时间和一定的接触方式下对实验动物产生总体毒性综合效应的能力，又称一般毒性（general toxicity）。,特殊毒性（special toxicity）：致突变作用、致癌作用、致畸作用和生殖发育毒性。,特殊毒性,基础毒性,急性毒性,亚慢性毒性,慢性毒性,局部毒性：皮肤刺激，眼刺激,致癌作用,生殖毒性,致畸作用,致突变作用,化学物毒性,基础毒性的研究意义,外源性化学物质安全性评价和危险性评价的重要组成部分，并为制订卫生标准和进行卫生决策提供依据。 为毒
2、作用机制和靶器官毒性研究提供线索 。,第一节急性毒性作用 Acute Toxicity,急性毒性（acute toxicity）：,实验指机体（人或实验动物）一次接触或24小时内多次接触某一化学物质在短期内（最长14天）所引起的毒性效应，包括一般行为、外观改变、大体形态变化及死亡效应。,基本概念,一.概 述,急性中毒发病急骤，病情变化迅速，发展快。群体中毒，伤害人群多。据有关部门统计急性中毒是我国全部疾病死因的第5位。是急诊急救易发生误诊误治引发医疗纠纷的领域。因此急救医护人员及时明确诊断，急分夺秒，紧张有序的救治，才能有效的控制中毒症状，降低死亡率和致残率。,急性中毒,一.概 述,2.毒物种
3、类工业性毒物：氰化物，硫化氢农业性毒物：百草枯日常生活性毒物：洁厕灵，稀料，汞，保健品植物性毒物：毒蘑菇动物性毒物,试验目的,主要是探求化学物的毒性大小（致死剂量LD50为主要参数，进行毒性分级），以初步评估其对人类毒害的危险性。阐明受试化学物的剂量反应关系 (dose-response relationship)，为其它毒性试验选择染毒剂量打下基础。粗略估计毒作用的靶器官，为可能的毒作用机制研究提供线索。,常用参数,LD50（LC50）急性毒作用带（Z）剂量反应曲线的斜率,LD50（LC50）,LD50 引起一群个体50死亡所需的剂量，也称致死中量（median lethal dose）。表
4、示LD50的单位为mg/kg体重。LC50 引起一群个体50死亡所需的浓度，一般以mg/m3表示空气中外源性化学物质浓度，或以mg/L表示水中外源性化学物质浓度。,LD50（LC50）,是急性毒性评价中重要的参数是比较不同化学物质毒性的重要参数但由于其是一个统计值，本身具有波动性，仅是表示实验动物一半死亡，一半存活的一个剂量界点值，不能很好的反映急性中毒的特征仅用其反映急性毒性的特征是有局限性的。,急性毒作用带(acute toxic effect zone, Zac),ZacLD50/ Limac阈剂量（threshold dose） 是指外源性化学物质按一定方式或途径与机体接触，能使机体开
5、始出现某种最轻微的异常改变所需的最低剂量。一次染毒所得的阈剂量称为急性阈剂量（Limac ）。,急性毒作用带（Zac),意义：Zac值大小可反映急性阈剂量距LD50之间距离的宽窄，即表示引起实验动物的死亡剂量与最低毒作用剂量之间的宽窄。Zac值越大表明化学物质引起急性死亡的危险性越小，反之危险性越大。,A、B两种物质剂量反应曲线,对数剂量,死亡率概率单位,5,A,B,剂量反应曲线的斜率,急性毒性试验设计原则,1.实验动物的选择,2.染毒途径的选择,3.染毒剂量与分组,4.毒性症状观察,(一)实验动物的选择,原则：选择代谢功能、对毒物感受性 与人接近的动物。常用：哺乳类动物,物种：,急性毒性反应
6、与人近似 易于饲养、操作方便 繁殖力较强 价格较低，易于获得,主要原则,1. 物种和品系,1.全年、多发情性动物2.性周期：4-5天3.一次排卵10-20个4.妊娠期为1921天；5.每胎产仔数为815,Balb/c小鼠,起源于小家鼠Mus musculus。和NIH与NCR比较，遗传背景为近交系，由亲兄弟姐妹遗传繁殖，因而它们之间的个体差异就小，遗传基因更纯，整体素质更好。 从1920年它们在纽约诞生至今，BALB/c小鼠在全球研究机构繁衍了超过200代，广泛用于免疫学、生理学的动物实验。,大鼠,Wistar大鼠性周期稳定，早熟多产，平均每窝产仔10只左右， 生长发育快，10周龄时雄鼠体重可
7、达280300g，雌鼠达170-260g。性情温顺对传染病的抵抗力较强。自发性肿瘤发生率低。目前各地饲养的Wisstar大鼠的遗传状况差异较大。,SD大鼠: 生长快，繁育性能好，生长发育较Wistar为快。10周龄时雄鼠体重可达300400g,雌鼠达180270g。性情比Wisar大鼠稍为凶猛。对疾病的抵抗力较强，尤其对呼吸道疾病的抵抗力很强。该品系对性激素敏感，对呼吸道疾病有较强的抵抗力。广泛用于药理、毒理、药效及GLP实验。,基本特性1921年立特(Little) 用艾比拉特洛坡(Abby Lathrop) 的小鼠株，雌鼠57号与雄鼠52号交配而得C57BL。1937年从C57BL分离出C
8、57BL /6和C57BL/10两个亚系。类别:近交系小鼠 毛色 :黑色成熟期： 8-10周 交配比例:1:2 发情周期：4-5天 妊娠期: 19-21天 平均每窝产仔数（第一胎): 6只 哺乳期: 21天,C57BL/6小鼠,乳腺肿瘤自然发生率低， 12有眼部缺陷；用可的松可诱发腭裂，其发生率达20。对放射物质耐受力中等；对结核杆菌敏感。是肿瘤学、生理学、免疫学、遗传学研究中常用的品系。,无胸腺裸鼠（Nude Mouse，简称裸鼠），主要特征表现为无毛（Hairless）、裸体（Naked）和无胸腺（Athymus）。先天性胸腺缺陷的突变小鼠，是由于第连锁群（Linkage group）内裸
9、体位点的等位基因发生纯合而形成的突变小鼠新品种。因此缺乏免疫反应，是免疫缺陷动物。由于nu基因有独特的遗传特性。裸鼠（纯合子nu/nu突变鼠）主要表现为无毛（但可看到一种细毛组织学证明有被毛滤泡）以及缺乏正常胸腺。杂合子小鼠（nn/+）各方面表现都正常。在肿瘤学、免疫学、药品与生物制品的安全性评价及有效药品的筛选等实验方面，它有着特殊的价值。,裸鼠,组织移植（人类肿瘤移植）研究,由于裸鼠的免疫缺陷，在一定情况下，不排斥来自异种动物的组织移植。因此可作移植人类恶性肿瘤的接受体。 人体肿瘤移植于免疫缺陷动物，能保持其生物学特性，用于研究人体肿瘤对药物的敏感性有很大帮助。移植于裸鼠的人类恶性肿瘤具有
10、以下特征：1被移植肿瘤仍保持原有组织学构造或各种机能。2将人癌组织的组织培养物移种于裸鼠时，能重现已在组织培养中消失的原有的癌结构。3几乎未发现被移植肿瘤的转移。,常用的突变品系,常用的突变品系,豚鼠guinea pig,豚鼠,又名海猪、天竺鼠、荷兰猪。草食性动物；喜群居；性情温顺；胆小怕惊；寿命一般为4-5年，最长可达7年。1生长发育： 豚鼠2月龄达到400g左右； 5月龄达到体成熟; 2体温调节差： 3红细胞少： 豚鼠红细胞、血红蛋白和红细胞压积比其他啮齿类实验动物低。,4不能合成维生素C 体内缺乏左旋葡萄糖内酯氧化酶。5有速发型和迟发型超敏反应：6呼吸系统和消化系统抗病能力较差：7. 豚
11、鼠对麻醉药物也很敏感，故麻醉死亡率较高，患病豚鼠对麻醉药更为敏感。,在生物医学研究中的应用,（一）免疫学研究1提取补体: 免疫学实验所用的补体多数用豚鼠血清制备，豚鼠血清中补体含量最丰富。2过敏反应: 豚鼠是进行过敏性休克和变态反应研究的理想动物模型，特别是迟发型超敏反应性与人相似，最适合进行这方面的研究。 实验动物对致敏原的敏感程度，从高到低依次为：豚鼠兔犬小鼠猫。3皮肤刺激试验: 豚鼠皮肤对毒物刺激反应灵敏，其反应近似人类，常用作局部皮肤毒物作用的试验，如研究化妆品和外用药品对局部皮肤的刺激反应。,（二）药物研究1平喘药研究: 组织胺能诱发豚鼠支气管痉挛性哮喘模型。2镇咳药研究: 吸入氨气
12、、二氧化硫、柠檬酸能引起豚鼠咳嗽.3局部麻醉药研究: 豚鼠常用于对局部麻醉药的药效评价。,（三）传染病学研究 豚鼠对结核杆菌、白喉杆菌、鼠疫杆菌、钩端螺旋体、霍乱弧菌、布氏杆菌和沙门氏菌等病原体十分敏感，尤其对结核杆菌高度敏感，感染后的病变与人的病变类似。 研究支原体感染后的病理及细胞免疫变化常用幼龄豚鼠。,家兔,豚鼠,家兔,实验动物的选择,物种：尽量选择对化合物毒性反应与人近似的动物易于饲养管理，试验操作方便；易于获得且价格较低的动物； 品系纯化，繁殖力较强；为了有利于预测化合物对人的危害，要求选择两种以上的实验动物，最好一种为啮齿类，一种为非啮齿类，分别求出其急性毒性参数。,3R原则：,减
13、少(reduction)：在满足实验要求又不损失应得信息的前提下，尽可能减少实验动物的数量。优化(refinement)：在动物实验时，尽可能改良实验操作技术，减轻动物可能遭受的痛苦。替代(replacement)：体外细胞和组织培养替代整体动物实验。,2、级别：为保证实验结果的可靠，一般选择清洁级（级）或以上的动物,35,实验动物的选择,普通级（CV）：不携带主要人畜共患病原和烈性传染病； 清洁级（CL）：除无上述病原，不携带对动物危害大和对研究干扰大的病原； 无特定病原体动物（SPF）：除无上两个病原，不携带主要潜在感染或条件治病和对科学研究干扰大的病原； 无菌动物（GF）：无可检出的一切
14、生命体。,年龄：刚成年，未曾交配和受孕的动物体重：大鼠180240g、 小鼠1825g、 家兔22.5kg、 豚鼠200250g注意：同一次试验同一批实验动物体重变异范围不应超过平均体重的20%,3.年龄与体重,4.性别:,雌雄各半 特殊的试验研究可仅作单一性别的毒性试验雌雄各半，即每个剂量组两性动物数相等。有性别差异时应单独求出雌性和雄性的LD50；如是为致畸试验作用准备，也可仅作雌性动物的LD50测试。,实验动物的选择,动物数量与随机分组：数量：大鼠、小鼠等小动物数量为每组10只，狗等大动物应每组6只。随机分组，提高每组动物间的均衡性。,实验动物的选择,禁食经口染毒的试验，要求：大鼠、小鼠
15、隔夜禁食；大动物在染毒前不喂食，染毒后应继续禁食34小时。,模拟人类在生活和生产环境中实际接触途径和方式。,(二) 染毒途径的选择,原则：,染毒途径,经消化道染毒,经呼吸道染毒,经皮肤染毒,注射途径,灌胃法（常用）喂饲法 吞咽胶囊法,1.经消化道染毒,灌胃法方法 将液态受试化合物或固态、气态化合物溶于某种溶剂中，配制成一定浓度，装入注射器等定量容器，经过导管注入胃内。注意 a 灌胃容量不宜过大或过小 ， b 一般在动物空腹时进行。优点：剂量准确缺点：工作量大,小鼠 0.1/10g大鼠 1ml/100g家兔 5ml/kg狗 肌肉注射腹腔注射皮下注射消化道皮内注射经皮,预试验剂量的设计：有相关资料
16、可供参考者无相关资料可供参考者,57,染毒剂量与分组,58,预试验剂量的设计,有相关资料参考,无相关资料参考,查阅文献资料，找出与受试化学物质结构与理化性质近似的化学物质的毒性资料以文献资料中相同的动物种系和相同接触途径所得的LD50值作为受试化学物质的预期毒性中值。设定以此预期值作为待测化学物质的中间剂量，并在该剂量的上下各设12个剂量组作为预试验剂量。 如果没有相同染毒途径或没有相同种属动物的毒性资料，也可参考其他染毒途径或相近种属动物的毒性资料。,59,预试验剂量的设计,有相关资料参考,无相关资料参考,预试验以1mg/kg为最低剂量组，以4倍为剂量组距，其他剂量组为4mg/kg、16mg
17、/kg、64mg/kg和256mg/kg体重。若预试验表明待测化学物质的致死剂量范围较窄，组距可缩小。当经预试验表明待测化学物质毒性很大或很小时，最低剂量组可以下调或上调，再依以上原则进行再次预试验。,对于毒性很小的化学物质，如食品、日用化学品进行毒性鉴定时，可直接作最大耐受量试验（limit test）。可依据各类化学物质的急性毒性分级标准，以最大耐受量作为试验剂量，如经口途径为5g/kg体重, 经皮为2g/kg体重，经呼吸道为5mg/L。,60,染毒剂量与分组,LD50 的计算方法,霍恩法改进寇氏法序贯法Bliss法,霍恩（Horn)法,原理：利用剂量对数与死亡率（反应率）的转换数（即几率
18、单位）呈直线关系而设计的方法，又称平均移动法或剂量递增法,设 计 原 则 4个剂量组； 每组动物数相等； 每组4只或5只； 设计剂量时可根据化学物致死剂量范围的宽窄应用两个剂量系列，其组距分别为2.15倍和3.16倍。 根据每组动物数、组距和每组动物死亡数，即可从Horn氏表中查得LD50及其95可信限。,霍恩（Horn)法,举例：对某有机磷农药作经口急性毒性试验。将Wistar大鼠随机分为四组，每组4只。各组的给药剂量分别为：464mg/kg,1000mg/kg,2150mg/kg,4640mg/kg，试验观察结束后各组的死亡数为：3只、1只、1只、4只。查表求LD50值及其可信限。,霍恩（
19、Horn)法,优点：简便，使用动物数少缺点：求得的95%可信限范围大，不够精确。 使用动物数少； 可直接从Horn氏表查出LD50及其95可信限，不需计算，甚为简便。 LD50的95可信区间范围较大，方法精确度尚不够。,改进寇氏法,原理：利用剂量对数与死亡率呈S形曲线而设计的方法，又称Karber法或平均致死量法 方法：要求每个染毒剂量组动物数相等，各剂量组组距呈等比级数，死亡率呈正态分布，最低剂量组死亡率20%，最高剂量组死亡率80%。,改进寇氏法,计算公式为：,m=XKi(-0.5),m=i,注：mlgLD50i相邻两剂量组对数剂量差即组距XK最大剂量组对数剂量各剂量组死亡率总和mlgLD
20、50的标准差p死亡率q存活率即q=1p,改进寇氏法,举例：小鼠经口给予某种化学毒物染毒，剂量和死亡动物数结果见表,改进寇氏法,按式计算得：lgLD50=1.4961-0.08(2.3-0.5) =1.3521 m =0.08(0.16/10+0.25/10+0.21/10+0.09/10)1/2 =0.0213lgLD50及其95%可信限为1.35211.960.02131.3521 0.0417所以lgLD50及其95%可信限为22.50mg/kg(20.4424.76mg/kg),序贯法,原理：利用序贯设计原理，先以一个剂量进行试验，如动物死亡，则以下一个小剂量试探，若仍死亡则以更小剂量试
21、探；如动物存活，则以较大剂量试探，依次类推，最终求出LD50。优点：很节省动物，一般12到14只动物即可完成试验缺点：只适用于动物快速发生中毒反应及死亡的化学毒物，凡引起迟发死亡的化学物不适用。,序贯法,计算公式：LD50=(1/n)xf s=nx2f-(xf)2/n2(n-1)1/2式中：n-使用动物总数x-每个剂量组的剂量f-每个剂量组使用动物数,序贯法,举例：小鼠经口给予某化学毒物染毒，以10mg/kg剂量试探，预计使用4个剂量组，剂量组组距为对数值0.2（即1.58倍），设计使用12只小鼠。结果见表：,序贯法,序贯法,LD50=(1/12) 113.25=9.44(mg/kg)S=(1
22、3308-12825.56)/144（121)1/2 =0.55(mg/kg)LD50的95%可信限9.441.96 0.559.44 1.07（mg/kg)因此该化合物小鼠经口LD50及其95%可信区间范围为9.44mg/kg(8.3710.51mg/kg),Bliss法,又称最大似然性法(maximum likelihood method)，被认为是最精确的LD50计算方法。我国新药临床前毒理学研究指导原则及新药（西药）毒理技术要求规范均推荐此法。Bliss法试验设计要求不是太严格，但该法计算复杂，现多利用计算机软件进行运算。,88,全面观察动物的各种反应和变化，仔细分析实验动物在染毒后出
23、现的中毒表现、剂量效应、时间分布。,观察记录的内容：中毒症状及发生过程死亡情况及时间分布体重病理检查,毒性观察,89,1.中毒症状及发生过程,详细观察和记录动物出现的中毒体征 发生时间 体征发展的经过,各个系统的特征初步确定急性毒性靶器官不同表现提供毒性机制的信息,续表6-1 啮齿类动物急性中毒表现,92,死亡情况和时间分布,实验动物的死亡数对LD50值产生明显影响分析中毒死亡时间的分布规律可以提供重要信息 ：原形，代谢,93,体重,反映动物中毒后综合性整体变化，比较客观简便的量化指标应定期多次称量动物的体重变化，一般为每周1次或2次对体重指标的变化要仔细观察和分析,94,体重变化的原因,影响
24、食欲或消化系统的功能影响食物的吸收和利用影响水的摄取,95,病理检查,死亡动物：大体病理变化，如脏器外观、大小、色泽的变化，有无充血、出血、水肿或其他改变；存活动物：观察期结束时亦应进行解剖检查，必要时做组织病理学检查。,96,观察时间和周期,染毒以后应即刻开始观察动物中毒表现和死亡情况给药当天应连续或多次观察，以后可根据情况，每天2次或多次观察直至试验周期结束,97,观察周期一般为14天LD50(LC50)计算时以观察周期内各组动物的总死亡数为依据不同化学物质引起动物死亡的时间存在个体差异速杀型化学毒物仅计算24h的死亡率,观察时间和周期,98,按照急性毒性分级标准评价毒性大小是相对粗略的分
25、级报告：LD50、急性毒性级别；中毒体征、出现体征时间、死亡前征兆、死亡时间和剂量组间分布、存活动物的体重变化和恢复情况、死亡动物的病理变化,急性毒性分级和评价,为了评价化学毒物急性毒性的强弱及其对人类的潜在危害程度，当前各国都对照相应的急性毒性分级（acute toxicity classification)标准来评价化学毒物的急性毒性。现行的各种急性毒性的分级标准均是以LD50值为基础划分的，而各国际组织以及不同的国家都制定了各自的分级标准，至今尚未统一。,100,表6-2 外源化学物急性毒性分级（WHO）,101,表6-3 我国农药的急性毒性分级（GB15670-1995）,消耗的动物量
26、大；获得的信息有限；测得的LD50仅仅是一个近似值，95%可信区间较宽；在安全性评价中仅评价动物死亡和简单的症状观察是不够的，更需要的是生理学、血液学及其它化验检查所提供的深入细致的毒性信息。,102,经典急性毒性试验的局限性,鼠药中毒,复旦投毒案，指2013年4月上海复旦大学上海医学院研究生黄洋遭他人投毒后死亡的案件。犯罪嫌疑人林森浩是受害人黄洋的室友，投毒药品为剧毒化学品N-二甲基亚硝胺。N-二甲基亚硝胺，浅黄色油状液体。易溶于水、醇、醚，遇热分解放出氮氧化物，可致中毒。用于医药及食品分析研究。摄入、吸入或经皮肤吸收可能致死，接触可引起肝、肾损害。可在实验动物中人为制造肝损伤的模型。较小剂
27、量的长期暴露也可能增加肝癌风险。,复旦大学投毒案,黄洋，男，27岁，生于1985年，四川自贡人。复旦大学医学院2010级在读研究生。2013年4月16日，经抢救无效，于当天下午3点23分在上海中山医院去世。不久前曾在耳鼻咽喉科博士录取考试中取得第一名，刚刚获得直升博士生机会。来自四川小县城，父母下岗，母亲体弱多病，家里欠下了大笔钱。 曾因此欲放弃学业。,据新华社最新消息，上海警方19日向记者证实，警方初步查明，林某因生活琐事与黄某关系不和，心存不满，经事先预谋，3月31日中午，将其做实验后剩余并存放在实验室内的剧毒化合物带至寝室，注入饮水机槽。4月1日晨，黄某饮用饮水机中的水后出现中毒症状，后
28、经送医救治无效于4月16日下午去世。,2015年1月8日上午，上海市高级人民法院将于对被告人林森浩故意杀人上诉一案进行公开宣判,森浩投毒案二审维持原判：因故意杀人罪被判死刑,南京汤山特大投毒案,2002年9月14日，南京汤山发生一起特大投毒案。犯罪分子陈正平潜入“正武”面食店，将所携带的剧毒鼠药“毒鼠强”投放到该店食品原料内，造成395人因食用有毒食品而中毒，死亡42人。,14日上午开店之后，学生、工人、军人陆续发生呕吐、吐血的症状,114,2002年9月14日上午，南京市江宁区汤山镇发生严重食物中毒事件。作厂中学和东湖丽岛工地部分学生和民工因食用了油条、烧饼、麻团等食物后发生中毒，陆续有多人
29、死亡。南京汤山中毒事件是人为投毒案，经警方78小时连续奋战，犯罪嫌疑人陈正平被抓获归案。陈正平系南京浦口区桥林镇人，在汤山镇开了一家小吃店，因生意竞争，心怀恨意，用国家明令禁止的剧毒灭鼠药“毒鼠强”进行投毒犯罪。至9月30日，该案已致42人死亡，300多人中毒。经江苏省高级人民法院核准，陈正平2002年10月14日上午在南京市被执行死刑。,第三节 局部毒性作用,眼刺激试验皮肤刺激试验皮肤变态反应试验,第四节 短期、亚慢性和慢性毒性作用,一、蓄积毒性作用,基本概念,蓄积作用（accumulation） ：外来化合物一次性进入机体之后，可经代谢或原型排出体外，但当化合物与机体发生亚慢性接触，将反复
30、进入机体，而且当进入的速度或总量超过代谢转化与排出的速度或总量时，化合物或其代谢产物就有可能在机体内逐渐增加并贮留于某些部位，这种现象称为化合物的蓄积作用。,蓄积作用的分类,物质蓄积（material accumulation）实验动物多次、反复接触外来化合物一定时间后，用化学分析方法能够测得机体内或某些组织脏器内存在该化合物或其代谢产物。如机体生物材料（血、尿等）检定重金属铅、镉、锰、汞含量升高 。,蓄积作用的分类,功能蓄积（functional accumulation）有的化合物在机体内虽不能被测出，却在长期接触下出现了慢性中毒现象，此时习惯上称之为功能(机能)蓄积。,功能蓄积可能是由于
31、贮存体内的化合物或其代谢产物的数量极微，用目前的分析方法尚不能检出，（这时功能蓄积可视为一种特殊的物质蓄积），或者是由于每次机体接触化合物之后所引起的损害效应累积所致。 二者的划分是相对的，它们同时存在，互为基础，难以严格区分。,蓄积作用的研究意义,化学毒物的蓄积作用是发生慢性中毒的基础，因此研究化学毒物的蓄积性是评价化学毒物能否引起潜在慢性毒性的依据之一，也是卫生标准制定过程选择安全系数的主要依据。,理化方法,124,蓄积作用-研究方法,利用化学分析或同位素技术测定毒物进入机体后，在体内含量变化的过程 ；,将多次染毒与一次染毒所产生的效应进行比较。,生物学方法,指实验动物或人连续接触外源化学
32、物4w（28天）内所产生的毒效应。目的：初步评价受试物的安全性，为亚慢性和慢性毒性试验选择剂量、观察指标、毒性终点等提供依据。,125,二、短期毒性作用,亚慢性毒性（subchronic toxicity）：指人或实验动物连续接触较长时间、较大剂量的外源性化学物质所出现的中毒效应。 慢性毒性（chronic toxicity）：指人或实验动物长期（甚至终生）反复接触低剂量的外源性化学物质所出现的毒性效应。,126,三、亚慢性和慢性毒性作用,亚慢性毒性试验的目的： (1)研究受试物亚慢性毒性剂量-反应关系，确定LOAEL有害作用最低剂量和（或）NOAEL最大无作用剂量，为提出该化学物质安全限量标
33、准提供依据，同时也为慢性毒性试验和致癌试验的剂量设计提供依据。 (2)了解受试物亚慢性毒性的性质、特点和靶器官，并为慢性毒性试验观察指标的选择提供依据。,127,（一）试验目的,慢性毒性试验的目的： （1）确定慢性毒性的参数：LOAEL和（或）NOAEL。 （2）阐明外源性化学物质毒作用的性质、靶器官和中毒机制。 （3）为制定该化学物质的人类接触的安全限量标准及进行危险度评定提供毒理学依据。,128,（一）试验目的,129,（二）试验设计,亚慢性毒性试验设计慢性毒性试验设计亚慢性、慢性毒性评价,1实验动物2染毒途径和染毒期限3剂量选择和分组 4. 观察指标的选择,130,亚慢性毒性试验设计,种
34、属：对外源性化学物质的代谢过程、生理反应和生化特性基本上与人接近，而且在急性毒性试验中证明是对受试物敏感的物种和品系。一般要求选择两个动物种属：即啮齿类如大鼠、家兔和非啮齿类如狗、猴等，以全面了解外源性化学物质的毒性特征。,131,1.实验动物,性别：雌雄各半，但在一些特殊研究中也可以使用一种性别的动物，如研究性腺毒性或生殖毒性。年龄和体重：同组动物体重相差不超过平均体重的10%，组间平均体重不超过平均体重的5%。小鼠15g左右，大鼠100g左右（啮齿类动物不超过6周），狗812月龄。,132,1.实验动物,动物数量：各实验组及对照组动物数应相等或相近，小动物20只/组，大动物6只/组。如试验
35、要求在试验中期处死部分动物进行病理学检查，则每组动物数要相应增加。,133,1.实验动物,染毒途径：应尽量采用人群实际接触的途径和方式，并与预期进行慢性毒性试验的接触途径相一致。一般以经口、经呼吸道和经皮染毒三种途径为多。染毒时间：呼吸道染毒：2-6h/d，工业毒物可以缩短至1h或延长，环境污染物可延长至8h。经皮染毒： 6h/d ，每周应对染毒部位脱毛一次。染毒期限：对于不同寿命的实验动物，染毒期限的长短也不同。一般对大、小鼠而言，染毒期限不超过3个月。,134,2.染毒途径和期限,设3个剂量组和1个阴性对照组；剂量效应要求： 高剂量组：引起较为明显的中毒症状或是某项观察指标发生明显的改变，
36、但不引起动物死亡，即使有死亡，也应小于动物数的10%； 中剂量组：应为观察到较轻微中毒症状，相当于有害作用的最低剂量（LOAEL）； 低剂量组：无中毒反应或只观察到极轻微的反应，相当于亚慢性的阈剂量或最大无作用剂量（NOAEL）水平。,135,3.剂量设计和分组,剂量：最高剂量的确定: 以急性阈剂量为该受试物的最高剂量；以该受试物的1/201/5 LD50为最高剂量组。剂量组距以35倍为宜，最低不小于2倍。,136,3.剂量设计和分组,农药、食品添加剂、工业化学品和其他非药用化学物试验剂量选择的基本原则有很多相似之处，但由于各自具有专业特殊性以及管理部门的不同，均有各自不同的剂量设计规范要求。
37、,137,3.剂量设计和分组,一般性指标特异性指标,138,4.观察指标,外观体征和行为活动、粪便性状、食量及体重变化等，常常能综合反映毒物对机体的毒作用，往往是敏感的综合毒效应指标。应详细记录，仔细分析，从中发现化学毒物的毒性特征。,139,一般性指标,140,一般性指标,(1)外观体征、行为活动 每日观察外观体征和行为改变，记录时间和先后次序，包括食欲、活动、被毛、分泌物、排泄物、呼吸等；留意动物被毛的光洁度与色泽、眼分泌物、呼吸、神态、行为等。 有助于分析化学毒物损害机体的部位及程度。,(2)动物体重：反映动物健康状况的最基本的灵敏指标之一,反映了受试物对实验动物的生长发育及一般状态的影
38、响。表示体重变化的指标: a.体重 b.体重增长百分率,141,一般性指标,(2)动物体重：提示有毒效应：试验组体重比对照组低10； 肯定是综合毒效应：试验组体重与对照组有显著差异，且各试验组呈剂量-反应关系。,142,一般性指标,(2)动物体重：注意：对照组和各试验组的喂饲条件一致，包括同一批动物、同样的饲养条件，而且动物所处笼盒的位置、局部光照、温度、湿度等各组间也应设法保持一致。一般每周称重一次，3个月后也可每2周称重一次。,143,一般性指标,(3)食物利用率概念：指动物每食入100g饲料所增加的体重克数。以g体重/100g饲料表示。,144,一般性指标,食物利用率()，体重或体重增长
39、缓慢：受试物不适口，影响动物食欲；,意义：食物利用率，体重或体重增长缓慢：受试物干扰了食物的吸收代谢；,(4)实验室检查 血、尿等体液的实验室检查目的是发现受试物所致器官损伤和功能紊乱，体内生化转化和排泄的重要器官肝和肾的功能是检查重点，血液是另一个重要的靶器官。,145,一般性指标,(4)实验室检查血液学检查：包括血红蛋白浓度、血球压积、红细胞计数、血小板数、白细胞计数与分类、凝血功能等指标。 血液生化检查：总蛋白浓度、白蛋白浓度、肝功能试验、糖代谢、肾功能等 。,146,一般性指标,采血量：不影响动物生理功能的最大采血量为其总血量的10，总血量约为50ml/kg体重。,(4)实验室检查尿液
40、检查：尿量、尿比重、蛋白、糖、潜血、沉淀物镜检等，可提供与毒物有关的靶器官毒性和中间代谢产物的信息。,147,一般性指标,（5）系统尸解和组织病理学检查 试验结束时系统解剖，进行详细的肉眼检查，测定脏器重量并作组织病理学检查。在试验中间死亡或处于濒死状态的动物，亦应作及时的系统尸解和病理学检查。,148,一般性指标, 脏器系数概念：又称脏/体比，指某个脏器的湿重与单位体重的比值，单位体重一般以100g体重计。如肝/体比，即（全肝湿重/体重)100%。 适用于实质性脏器。,149,一般性指标,意义： 增大：充血、水肿、肿瘤、增生 降低：坏死、萎缩,（5）系统尸解和组织病理学检查病理学检查 大体检
41、查、常规组织病理学检查、酶组织化学检查、免疫组织化学检查、细胞超微结构检查等，分别从大体、组织、细胞、亚细胞，甚至分子水平等多个方面发现化学毒物的毒效应。参照急性毒性试验的脏器改变或亚慢性中毒症状及其它生化阳性指标，可有重点地对某脏器组织进行检查。,150,一般性指标,特异性指标往往是反映外源性化学物质对机体毒作用本质的指标，这些指标的测定有助于取得中毒机理的线索。此类指标意义重大，但在中毒机理不明确的情况下往往难以选择。 一般从分析受试物的化学结构（如特殊基团）或分析受试物急性或亚急性毒性作用的特征时发现线索。,151,特异性指标,1实验动物2染毒途径和期限3剂量设计和分组4. 观察指标,152,慢性毒性试验设计,种属啮齿类首选大鼠，非啮齿类动物选狗和猴。 数量每组动物数无统一要求，以统计处理数据可靠为依据。一般大鼠4060只，狗810只，雌雄各半。若需分批处死或需观察后作用时，每组动物数还须相应增多。 年龄体重一般啮齿类选初断乳（小于6周龄）的大小鼠，小鼠1015g,大鼠5070g，狗8h/d，7d/周； 经皮染毒：46h/d，5d/周。,155,2.染毒途径与期限,
