1、 22 含氮大环内酯类抗生素 及其 生物合成研究进展 雷帕霉素、他克莫司等一类 含氮 大环内酯类微生物代谢产物是目前临床重要的药物， 它们具有特殊的结构基团，即内酯环上含有 1 分子 非蛋白质组成氨基酸 哌可酸，通过哌可酰基与细胞内一类具有脯氨酰顺反异构酶活性的 免疫亲合蛋白 （ immunophilin）FKBPs（ FK506 bingding proteins）相互作用形成复合物，作用于细胞不同靶位，发挥 多种 不同的 生物学功能 1。 这类化合物具有广泛的生物学活性， 除抗真菌活性外，临床已用 作器官移植抗排斥药物、血管扩张支架 涂层药物 2、靶向抗肿瘤药物 3-4、 炎症 治疗药物
2、5， 同时，这类化合物还具有潜在的治疗中风 6、神经退行性疾病 7、帕金森综合症 8、老年痴呆 9等 作用 ， Harrison 等人 2009 年 7 月 在 Nature杂志 上报道 雷帕霉素可以延长哺乳类动物 老龄 小鼠寿命的研究成果 10，立即 引起 各国科学家的广泛关注和高度兴趣11，美国 Science杂志把此项研究成果评选为当年十大科学进展之一，预计 10 年左右可望应用于人体。 含有哌可酰基的含氮大环内酯类微生物代谢产物具有相似的生物合成途径， 它们都属 大环内酯类化合物，由典型的具有模块结构的 I 型聚酮合酶（ Polyketide synthase, PKS）催化合成内酯环
3、碳链骨架，由单模块的非核糖体肽合成酶（ Non-ribosomal peptide synthetase, NRPS）催化把哌可酸整合到内酯环骨架，并通过 环化 酶活性域 使 含哌可酰基的聚酮链 内酯化 从 PKS/NRPS 杂合酶上 脱 离 ，最后通过一些列氧化酶、甲基转移酶等进行侧链基团的修饰形成最后的活性产物，由于这类化合物具有相似的结构和合成机制，特别是它们的作用机制独特带来广泛的生物学活性和临床应用前景， 已经成为 目前国内外关注和研究的热点。 一、微生物产生的含氮大环内酯类化合物 1、 Rapamycin（雷帕霉素 , 西罗莫司 /sirolimus） 1975年 ，加拿大 Aye
4、rst试验室 Vezina等在筛选抗真菌抗生素中，从太平洋复活岛土壤样品中分离到一株具有抗白色念珠菌（ Candida albicans） 等酵母样真菌和 石膏样小孢子菌 (Microsporum gypseum)等丝状真菌活性的吸水链霉菌（ Streptomyces hygroscopicus 23 NRRL5491） 12， 并从其发酵液中分离得到一个新的 含氮三烯 36元环大环内酯类抗真菌化合物（图 1） ，即雷帕霉素 。 1988年 Delin和 Hargrave受 FK506独特大环内酯结构的启发 , 根据 FK506和雷帕霉素化学结构的相似性和均具有免疫抑制作用的特点，提出详细比较
5、两种化合物的生物学功能 ，重新对雷帕霉素的免疫抑制活性进行研究 。 历经 25年， 1999年 9月 FDA批准 美国家用产品公司（ AHP）的雷帕霉素 及其 口服液作为器官移植抗排斥药物投放市场 13。 2008年 Goodfellow等人采用形态学结合遗传学分析方法对雷帕霉素产生菌重新进行分类学研究， 正式 把 产生菌 Streptomyces hygroscopicus NRRL5491定名为 Streptomyces rapamycinicus新种 14。 2、 Tacrolimus（他克莫司， FK506） 1983 年美国 FDA 批准 真菌产生的 十一环肽 抗生素环孢素（ Cyc
6、losporin A）作为免疫抑制剂用于器官移植抗排斥反应，成功应用于抑制骨髓移植受体的抗排斥和自身免疫性疾病的治疗，为器官移植治疗带来革命性的突破，免疫抑制剂的研究进入一个新的 发展 时代。日本藤泽公司（ Fujisawa）建立混合淋巴细胞、 T 淋巴细胞生长、白 细胞介素II 合成 等模型，开展从微生物代谢产物中筛选具有免疫抑制活性的新型化合物， 1987 年从大阪筑波土壤中分离得到一株筑波链霉菌（ Streptomyces tsukubaensis No. 9993） 15，其代谢产物能够抑制 IL-2 的合成 16，经过发酵、分离、纯化获得另一个含哌可酰基 23元环大环内酯类化合物 T
7、acrolimus（ 他克莫司 ， FK506）（图 2）。 图 1 雷帕霉素结构式 图 2 FK506 结构式 生物学活性研究 发现 FK506 具有 很 强的免疫抑制特性，其活性是环孢素的 10-100ONO H 3 CH 3 CH OO OOH 3 CO HO C H 3O O HH 3 C OOC H 3C H 3C H 3O C H 3ONOH 3 CH OOOH 3 CO HO C H 3O C H 3O C H 3C H 3C H 3OO HC H 3C H 211 02 13 11 12 6271 31 51 71 92 02 22 42 52 72 83 289 24 倍，预
8、防各种器官移植所出现的排斥反应的效果优于环孢素。 1989 年，美国匹兹堡大学Starzl 器官移植中心将 FK506 首次在临床试用， 1993 年在日本上市，商品名普乐可复（ Prograf）。 1995 年经 FDA 获准后在多个国家正式使用， 1999 年获准在中国上市。目前，普乐可复已广泛应用于肝脏、胰腺、肾脏、心脏、肺等实体器官移植 的抗排斥作用 。 3、 Ascomycin（子囊霉素， FK520, 免疫霉素 /immunomycin） 继 FK506 之后， 1988 年藤泽公司又报道从另一株链霉菌 Streptomyces hygroscopicus subsp. yakus
9、himaensis No 72381 代谢产物中获得两个新的与 FK506 结构类似的 23 元环含哌可酰基大环内酯类 化合物 FR900520 和 FR900523（图 3、 4） 17。 它们与 FK506 结构仅在内酯环 C-21 位上侧链不同 ，分别是乙基、甲基，而 FK506 该位置是烯丙基。 体外混合淋巴细胞反应实验显示两个化合物均有 免疫 抑制作用， IC50 分别为 0.55 nM 和1.6nM，略 高 于 FK506 的 0.23 nM。 低于 3200nM 对淋巴瘤 EL-4 体外没有细胞毒作用。 图 3 FR900520 结构式 图 4 FR900523 结构式 两个化合
10、物对细菌和酵母样真菌均没有抗菌活性，对丝状真菌 烟曲霉 （ Aspergillus fumigatus IFO 5840）显示较强抗菌活 性， MIC 分别为 0.03 g/ml and 0.3 g/ml。FR900520 能够明显延长皮肤移植物存活时间，并显 现 量效关系。 1992 年 Morisaki等人证实 FR900520 与 Arai等人 1962 年报道的从吸水链霉菌 子囊霉素变种 （ Streptomyces hygroscopicus var. ascomyceticus ATCC14891）中发现的抗真菌抗生素 子囊霉素（ Ascomycin） 同质 18。 4、 Meri
11、damycin（ 美立霉素 ） 由于环孢素、 FK506 和雷帕霉素等微生物来源的免疫抑制剂的 临床 成功 应用 ，引起21 21 25 各国科学家广泛关注，试图从微生物代谢产物中发现 选择性 更强、 毒 性更 低的新 型 免疫调节剂。特别是 把 FK506 和雷帕霉素 共同的结合靶标 FKBP12 作为研究基础开展广泛的化合 物筛选， 1994 年和 1995 年， 瑞士山道士公司 Fehr19和 美国默克公司 Salituro20等人先后 报道 从 两 株链霉菌（ Streptomyces sp. A 91-261 402 和 Streptomyces hygroscopicus F-00
12、4081） 代谢产物中 发现 一个新的 29 元环含哌可酰基大环内酯类化合物，命名为Meridamycin（美立霉素） （图 5）， 内酯环含有 1 分子哌可酰基和相连的环半酮缩醇结构（图 5 蓝色部分），这部分结构可能是 FKBP12 结合的关键基团，与雷帕霉素完全相同，而与 FK506 仅相 差一个 氧 甲基。 Meridamycin 能够竞争性抑制 FK506 与 FKBP12 结合，IC50 为 1.0 ng/mL，但其本身没有免疫抑制活性，能够拮抗 FK506 和雷帕霉素的免疫抑制活性 ，因此可能作为 K506 和雷帕霉素过量服用的解毒剂，另外还发现其可作为皮质激素的增效剂用于治疗皮
13、肤炎症和增生。作为非糖皮质激素治疗特应性皮炎， FK506 和FK520 的 半合成衍生物吡美莫司（ Pimecrolimus） （图 6） 已获准上市，被誉为外用糖皮质激素后皮肤科治疗最重要的突破之一。 图 5 Meridamycin 结构式 图 6 Pimecrolimus 结构式 研究发现 Meridamycin 及其衍生物在治疗神经退行性疾病，如老年性痴呆（ Alzheimers）、帕金森综合症（ Parkinsons disease）、创伤 性 和缺血 性 神经损伤 ，促进神经再生和神经保护等方面具有潜在的应用前景，引起了广泛的关注。美国惠氏公司已就此申请了专利保护 21。 5、 A
14、ntascomicins 瑞士山道士公司上世纪八十年代研发成功 十一环肽抗生素 环孢素用于器官移植抗排斥治 疗 之后 ，他们 又 利用 子囊霉素 、 FK506 和雷帕霉素这类化合物通过与免疫亲合蛋 26 白（ immunophilin） 结合 发挥免疫抑制 活性的 作用 机制 ，广泛筛选能够与此类蛋白结合的微生物代谢产物， 继 1994 年报道发现 Meridamycin 后， 1996 年 又 报道从 12000 株放线菌中发现一株 从 采自 中国 的 土壤样品中分离得到的 小单孢菌 （ Micromonospora sp. A92-306401） 22，其发酵液中分离得到 5 个与 FK
15、506 结构类似新的 23 元环 含哌可酰基大环内酯类化合物 Antascomicins（图 7） 。 图 7 Antascomicins 结构式 Antascomicins 具有很强的 FKBP12 结合能力，除了 内酯环上 哌可酰基被脯酰基取代的 Antascomicin D 外，其余 4 个化合物与 FKBP12 结合能力 与 FK506 和雷帕霉素相当，Antascomicin D 结合力 低 5-10 倍，混合淋巴细胞反应实验显示 Antascomicins 没有抑制T 淋巴细胞增殖活性 ，在 FK506 相同剂量 条件下 无 抑制白细胞介素 II 合成 的活性 ，也没有类似雷帕霉素
16、抑制细胞生长因子诱导的增殖活性。同 meridamycin 一样，Antascomicins 能够拮抗 FK506 和雷帕霉素的活性， 特别是对雷帕霉素，等摩尔浓度 的Antascomicin B 或者 C 即可抵消雷帕霉素体外活性。 6、 Nocardiopsins 2010 年澳大利亚昆士兰大学 Capon等人 23从 55 米深处海洋沉积物中分离得到一株拟诺卡氏菌（ Nocardiopsis sp. CMB-M0232），该菌种在 不含海水的培养基中产生两个 22元环含哌可酰基大环内酯类化合物 nocardiopsin A 和 B（图 8）。一般认为， 含氮大环内酯类 化合物通过哌可酰基
17、和相连的环半酮缩醇结 构与靶位蛋白 FKBP相互结合形成复合物，再以复合物形式与不同细胞信号传导途径位点作用，发挥各种生物学活性。与上述各化合物不同， Nocardiopsins 分子结构中 没有 环半酮缩醇结构， 即没有完整的 FKBP 结R1 R 2 R 3 n a nt as com i ci n A =H = H = H 2 a nt as com i ci n B =O H = H = H 2 a nt as com i ci n C =O H = C H 3 = H 2 a nt as com i ci n D =H = H = H 1 a nt as com i ci n E =
18、H = H =O H 2 27 合基团， 但它们 能 保留 中等强度的 FKBP12 结合能力， 体外无抗细菌、抗真菌和细胞毒活性 。 能够与 FKBPs 结合 ，但 没有免疫抑制活性的化合物很可能在神经退行性疾病治疗、神经再生和神经营养方面具有潜在 应用 价值，这方面的研究工作还在进行当中。 图 8 Nocardiopsins 结构式 二、 含氮大环内酯类化合物生物学活性及其作用机制 随着 FK506、雷帕霉素等一些列含氮大环内酯类化合物作为器官移植抗排斥药物成功开发，对它们的独特作用机制和生物合成机制的研究也 不断 取得重大突破。特别是这类化合物共同的结合靶标 FKBPs 和哺乳动物细胞信
19、号传导途径关键调控靶标 mTOR 的发现 24及其调控机制不断被揭示，也带来这类化合物 在 临床 上 新的 应用领域。 1991 年 Hall 等人分别在 Science 和 PNAS 杂志上发表报道，发现雷帕霉素在酵母细胞信号 传导 途径中的作用靶点 TOR（ target of rapamycin） 25和啤酒酵母中 FK506 的 结合 靶 标 FKBP（ FK506 binding protein） 26，开始 了 此类化合物细胞内分子作用机制的深入研究。 FKBP 是一类免疫亲合蛋白 （ immunophilins)， 具有肽酰基脯氨酰顺反异构酶活性（ peptidylprolyl
20、cis/trans isomerases, PPIases）， FKBP 广泛存在于从古菌到哺乳动物的细胞中，体外蛋白复性实验中， Xaa-Pro 键的顺反异构化是限速步骤，而 PPIase 可 极大 提高 Xaa-Pro 键顺反构型的转化率，在新生肽 链的折叠与生物大分子自我组装过程中发挥重要作用，决定了此类蛋白质的多功能性 27-28。 雷帕霉素、 FK506 等 此类化合物含有与PPIase 底物脯氨酰基 结构 相似的哌可酰基， 推测 可能与底物竞争性结合 FKPB 的 PPIase催化位点，抑制 PPIase 活性。 人体基因组中含有 20 多个免疫亲合蛋白基因，研究表明 28 它们与
21、体内 一系 列 功能 蛋白相关，如钙调磷酸酶 29-30、哺乳动物雷帕霉素靶蛋白 (mTOR) 31、钙离子通道（ ion channels） 32-33、类固醇受体复合物（ steroid receptor complexes）34、转录因子（ transcription factors） 35、 Bcl-2 条件激活上调（ Bcl-2 upon conditional activation） 36等 ，因此 FK506、雷帕霉素等 免疫亲合蛋白配基 化合物 能够干扰体内正常存在的 FKBP 复合物，或者 通过 形成三重复合物（如 FKBP12FK506calcineurin、FKBP12r
22、apamycinmTOR）， 引起免疫细胞生长、内皮细胞生长、肿瘤发生、神经营养和再生甚至动物寿命等相关的一系列的生物学活性 37。 PPIase 作用机制正在逐步被认识，可能是与磷酸化信号传导途径类似的一种还 尚未被深入了解的细胞调控机制 28。 由于雷帕霉素的研究，从啤酒酵母中发现 了 真核细胞信号传导途径中关键靶位TOR， TOR 在调控细胞的生长、营养中发挥重要作用。随后又从其它真菌、哺乳动物、苍蝇、蠕虫和植物中发现 TOR 靶位，证明 TOR 在各种真核生物细胞中高度保守。低等真核细胞一般都含有两个 TOR基因， 而 高等真核生物 细胞 一般都只 含 有一个 TOR基因，1994 年
23、 Sabatini24和 Brown38几乎同时 报道 从哺乳动物细胞中 发现高等真核细 胞 TOR，并分别在 Cell 和 Nature 杂志上报道。 mTOR（ 哺乳动物雷帕霉素靶蛋白 ） 是 丝 /苏氨酸蛋白激酶家族中的一员，这类蛋白激酶又属于磷酯酰肌醇激酶相关激酶（ PIKK）。 K506 和雷帕霉素能够与相同的靶蛋白 FKBP12 结合发挥其免疫抑制作用，但它们的免疫抑制机制不同， FK506 与 FKBP12 结合形成的复合物作用于钙调磷酸酶（ calcineurin） 39， 而 雷帕霉素与 FKBP12 结合形成的复合物作用于 哺乳动物细胞信号传导途径的关键靶酶 mTOR（ M
24、ammalian Target of Rapamycin） 靶位 。 mTOR 靶位调控不同细胞因子受体的信号传导，阻断 T 淋巴细胞及其它细胞由 G1 期至 S 期的进程，在细胞增殖、分化、转移和存活中 扮演 重要 角色 ， 与肿瘤发生、发展、转移密切相关，对白血病、卵巢癌、乳腺癌、中枢神经和小细胞肺癌 等 有效， 成为癌症治疗中的一个新靶点 40。 美国 FDA分别于 2007 年、 2009 年批准 雷帕霉素半合成衍生物 CCI-779、 Everolimus用于晚期肾癌治疗，另一个 雷帕霉素 衍生物 AP23573 也于 2010 年 FDA 批准进行软组织和骨骼恶性肿瘤的临床研究 4
25、1，此类化合物对非小细胞肺癌 42、肉瘤等的应用已处在临床试验阶段 43。 随着含氮大环内酯类 化合物的深入研究，发现它们在神经保护和神经营养方面 具有潜在的作用，特别是 Meridamycin、 Antascomicins 等本身没有免疫抑制活性的 此 类化合 29 物，具有更大的优势，它们可能不是与 FKBP12 结合，而是与另一个 具有 PPIase 活性的靶蛋白 FKBP52 结合后发挥生物学活性 44，没有 FKBP12 结合能力的 FK506 衍生物能够刺激 SH-SY5Y 细胞神经突触延长和加快神经再生 45。 这类化合物的结合靶点及其复杂的作用机制目前仍然还有待更 多的研究 和
26、探索 。 此外， FK506 以及子囊霉素的半合成衍生物吡美莫司（ Pimecrolimus）对特应性皮炎、银屑病和秃斑等自身免疫性疾病有很好的疗效，国外已开发成替代糖皮质激素的新型治疗皮炎药物，被誉为皮肤科治疗的重大突破 5。雷帕霉素及其衍生物还有抑制血管内皮细胞生长的作用，已经有多个化合物获准用作血管扩张支架的涂层药物，抑制支架植入后的血管再狭窄。值得关注的是 2009 年 7 月 Nature 杂志发表 14 位美国科学家共同署名的论文 10，报道雷帕霉素可延长 老龄 小鼠寿命的研究结果，他们分别在 3 个不同实验室对 2000 只 20 个月龄的白鼠进行试验，结果摄入雷帕霉素的雌雄白鼠
27、的寿命分别平均增加了 14%和 9%，最高达 35%，这项成果被 Science 杂志评选为 2009 年世界十大科学进展之一。 三、含氮大环内酯类化合物的生物合成 含氮大环内酯类化合物重要的生物学功能和临床应用价值，引起分子生物学家的极大兴趣，深入开展对此类化合物的生物合成机制的研究，为通过遗传改造、组合生物合成、酶工程 等技术 获得 高效、低毒 、具有新生物学活性的 衍生物奠定坚实的基础。 1、 内酯环生物合成 剑桥大学 Leadlay 等人 46成功克隆 了 红霉素合成基 因簇并推导出红霉素内酯环（ 6-脱氧红霉酯 B）合成途径，开辟了聚酮类化合物特殊的合成机制研究。 典型的 I 型聚酮
28、合酶（ polyketide synthases， PKS）是一类具有模块 （ module） 结构的巨型复合 酶 体 ， 一般 由 多亚基 蛋白 组成，每个亚基含有不同数目的模块， 模块之间呈线性排列，每个模块含有相似的催化活性域（ domain），至少包括酮基合成酶（ ketosynthase， KS）、 酰基转移酶（ acyltransferase， AT） 和酰基载体蛋白（ acyl carrier protein， ACP） （图 9） 3 个活性域 ，共同负责聚酮链一 个 延伸 循环， 使 聚酮链延长 2 个碳 长度，同时在位形成酮基，位根据 AT 识别的底物不同，可能产生甲基、乙
29、基、氧甲基、烯丙基等侧链基团。在每个模块内部 AT 与 ACP 之间，还可能存在酮基还原酶（ Keto reductase， KR）、脱水酶（ Dehydratase， DH）和烯酰基还原酶（ Enoyl reductase， 30 ER） 等位 酮基 修饰 活性域，负责把本模块延伸形成的位酮基还原为羟基、烯键或饱和碳链。 PKS 最后一个模块一般含有 1 个硫酯酶（ Thioesterase， TE）活性域，负责把合成完成 的聚酮链内酯化 ，进而从最后一个模块的 ACP 上脱离下来，形成内酯环化的代谢产物前体。最后通过其它相关氧化酶、甲基转移酶等修饰酶对前体物进行结构修饰形成终产物。 图 9
30、 I 型 PKS结构示意图 1995 年 Leadlay 等人 47成功克隆了雷帕霉素合成基因簇，其聚酮链同样也是由典型的 I 型聚酮合酶催化合成。雷帕霉素合成 基因簇 全长 超过 107kb，含有 26 个编码基因，其中 3 个超大型开放阅读框（ ORFs），分别命名为 rapA、 rapB 和 rapC 基因，相应的编码蛋白 RapA、 RapB 和 RapC 分别达到 900kDa、 1.07mDa 和 660 kDa， 占整个合成基因簇的 3/4 以上，是典型的 I 型 PKS 编码基因，分别含 4 个、 6 个和 4 个 延伸 模块 ，第 1个亚基还同时含有 1 个起始模块 ， 三个
31、 PKS 亚基 总共 含 有 70 个催化活性域，负责催化雷帕霉素内酯环的脂肪链部分。 每个模块负责识别不同小分子酰基 -CoA 底物，通过缩合 反应 使聚酮链延伸两个碳原子 。同位素标记 的 前体物添加 实验证明 雷帕霉素 PKS 起始 模块 识别的是莽草酸衍生物 (4R,5R)-4,5-dihydroxy-cyclohex-1-enecarboxylic acid (DHCHC)48， 14 个 延伸 模块 中 有 7 个识别丙二酰 -辅酶 A 底物 （分别是第 2、 5、 8、 9、11、 12 和 14 模块） 、 7 个识别的是甲基丙二酰 -辅酶 A（ 分别是第 1、 3、 4、 6
32、、 7、 10和 13 模块 ） ， 后者使 内酯环 相应位置 形成甲基侧链。第 8、 9 和 10 模块均 同时 含有 KR和 DH 两个 活性域，因此 连续 3 个 模块延伸形成的位酮基 均 被还原为不饱和烯键，形成共轭三烯结构 49。 KS dom ain, ain, K et osyn thaseet thaseAT do m ai n, ai n, A cyl trans fer as ecyl trans fer as eAC P d om ain, ain, Acy ll c arrier p ro teinc arrier p teinTE do m ain, do ain,
33、Thi oe ster asester ase典型典型 PKS - II 结构示意图结构示意图In iti ationmodu le Elongation moduleTer mination m odu leKR do ma in, in, Ke toto reduc t aset aseDH do ma in, in, Dehy d ra t as et as eER do m ai n, ai n, E noyl re duc tas ere tas eAT ACP KS AT ACP KS AT ACP TEKRDHERInitiation module Elongation modu
34、le Termination module KS domain, Ketosynthase AT domain, Acyltransferase ACP domain, Acyl carrier protein TE domain, Thioesterase KR domain, Keto reductase DH domain, Dehydratase ER domain, Enoyl reductase 31 除 PKS 编码基因外， 在 rapA 和 rapC 之间有一个典型的非核糖体肽合成酶（ Non Ribosomal Peptide Synthetase， NRPS）基因 rapP
35、，序列分析是单模块 NRPS 基因。雷帕霉素 PKS 最后一个模块没有 TE 活性域，因此推测聚酮链合成后并没有马上 环化脱 离PKS，而是 PKS 与 NRPS 杂合 50， NRPS 模块的腺苷活化酶活性域（ adenylation， A）特异性识别并活化哌可酸，以硫酯键形式与肽酰基载体蛋白（ peptidyl carrier protein，PCP）活性域结合，并通过 PKS/NRPS 杂合酶，哌可酰基上 N 原子攻击 PKS 上合成的聚酮链硫酯键，把哌可酰基整合到聚酮链中。 RapP 模块含有两个 C（ condensation）活性域，第 2 个 C 活性域被认为起替代 PKS 的
36、TE 硫酯酶活性域作用，催化含哌可酰基的聚酮链内酯 化 从 PKS/NRPS 酶中水解脱 离 ，形成 前雷帕霉素（ pre-rapamycin） 51，最后经过 基因簇中 编码的 氧 化酶、甲基转移酶等修饰改造，形成雷帕霉素（图 10）。 2000 年 Wu 等人 52从产生菌 吸水链霉菌（ Streptomyces hygroscopicus ATCC 14891）克隆了大约 77kb 的 FK520 合成基因簇，基因簇结构与雷帕霉素 的 非常相似，同样含有3 个 PKS 编码基因，但是分别只含有 4、 2、 4 个延伸模块 ，第 1 个 PKS 含有 1 个起始模块，第 2 个 PKS 相
37、对雷帕霉素少 4 个模块，这与 FK520 内酯环比雷帕霉素少 8 个碳相吻合。除了 fkbD 基因编码蛋白催化 C-9 位的双加氧形成酮基，在整个基因簇（包括上下游附近区域）没有发现其它 P450 氧化酶基因，证明 FK520 的 C-13 和 C-15 位甲氧基不是 PKS 后修饰形成的，而是相应的 PKS 第 7、 8 模块 AT 活性域识别位含氧的底物。根据基因簇中基因编码序列同源性分析，相连的 5 个基因 fkbGHIJK 可能是编码合成特殊聚酮链延伸底物氧甲基丙二酰 -ACP 的基因。其中 fkbJ 编码 ACP 载体蛋 白， fkbH编码蛋白催化糖酵解途径中的 3 碳中间产物形成丙三基 -ACPj，然后依次由 fkbJK、 I 和G 基因编码蛋白催化氧化和甲基化，形成特殊 的 PKS 合成底物氧甲基丙二酰基（图 11）。基因簇中除催化 C-31 位羟基甲基化的甲基转移酶基因 fkbM 外，只发现一个甲基转移酶基因 fkbG，因为甲基化酶是一类底物特异性很强的蛋白质，因此 FkbG 更有可能催化羟基丙二酰基甲基化形成模块 7 和模块 8 共同的底物氧甲基 -丙二酰 -ACP，而不是聚酮链合成后甲基化 C-13 和 C-15 两个不同位点。 fkbGHIJK 基因远离 PKS 一侧还有多个与 第4 模块识别底物乙基 -丙二酰 -CoA 合成相关的基因。
