1、 海 南 大 学 毕 业 论 文（设计） 题 目： 东寨港红树林吸血蠓的物种多样性 学 号： 20120303310016 姓 名： 罗玉凤 年 级： 植物保护一班 学 院： 环境与植物保护学院 系 别： 植物保护 专 业： 植物保护 指导教师： 李加慧 完成日期： 2016 年 5 月 17 日 东寨港红树林吸血蠓的物种多样性 I 摘 要 红树林是生长在热带、亚热带海岸潮间带或河流入海口的木本植物群落，是适应陆地与海洋过渡带的一种特殊森林类型。由于其独特的海陆过渡特性，红树林具有极大的社会、经济、生态价值 。 红树林作为重要的海岸湿地类型是国际上湿地生态保护和生物多样性保护的重要对象。 吸血
2、蠓是一类微小型昆虫， 隶属双翅 目 , 蠓科 。有吸血习性的蠓侵袭人畜，传播疾病，作为病原体的宿主，是一类重要的医学昆虫。 采用传统的形态学分类特征对吸血蠓进行鉴定极易混淆 ,更难进行地理分布与遗传多样性分析 ,近年来迅速发展的分子鉴技术为解决吸血蠓遗传及鉴定等问题提供了有效的手段。本论文综合利用网捕、人诱和灯诱的方法对海南东寨港红树林的吸血蠓类进行系统采集，基于形态共成功鉴定出 6 种库蠓，包括棒须库蠓 Culicoides clavipalpis、 环基库蠓 Culicoides circumbasalis、 霍飞库蠓Culicoides huffi、 尖喙 库蠓 Culicoides o
3、xystoma、 帛琉库蠓 Culicoides peliliouensis 和Culicoides ornatus 种团 ；系统研究了 6 种库蠓翅的色斑 类型 、翅脉和翅室的异同，并根据翅的特征编写了检索表； 此外，成功测定了 6 种库蠓 的 DNA 条形码 基因COI 的基因序列 。 该研究为吸血蠓类昆虫的分子鉴定奠定了基础 ，科 为蠓类昆虫的防治提供理论依据 。 关键词 ： 吸血蠓；形态鉴定；分子鉴定； DNA 条形码；红树林 东寨港红树林吸血蠓的物种多样性 II Abstract Mangrove is growth in tropical and subtropical coast
4、 intertidal zone or river mouth of woody plant community, is to adapt to the land and ocean transition zone is a kind of special forest types. Because of its unique sea-land transition characteristics of mangrove is of great social, economic and ecological value. Mangrove as an important coastal wet
5、land types are international wetland conservation and biodiversity protection of important objects. Vampire midge is a kind of small insects, diptera, midge. Midge affect human and animal blood sucking habits, disease transmission, as the host of pathogens, is a kind of important medical insects. Us
6、ing traditional morphological classification feature of vampire midge confusing verification, harder to geographical distribution and genetic diversity analysis, in recent years the rapid development of molecular learning techniques to solve the vampire midge genetic provides an effective way and th
7、e problem of identification. Comprehensive utilization of the trap, this paper induced and trap method to the port of Hainan Dongzhaigang mangrove vampire midge systematically collected, based on morphology were successfully identified six midge, including Culicoides clavipalpis, Culicoides circumba
8、salis, Culicoides huffi, Culicoides oxystoma, Culicoides peliliouensis and Culicoides ornatus group;System studied the 6 types of library midge wing spots, vein and wing rooms, as well as the similarities and differences of and according to the characteristics of the wings to write the retrieval tab
9、le; In addition, the successful determination of 6 kinds of library of midge DNA barcode COI gene sequences of genes. The study of blood-sucking insects like midge, laid the foundation of molecular identification of midge insect provide theoretical basis for the prevention and control. Key words: va
10、mpire midge； morphological identification； molecular identification；DNA barcodes； mangrove forest 东寨港红树林吸血蠓的物种多样性 III 目 录 1 前言 . 1 2 吸血蠓的介绍 . 2 2.1 吸血蠓的形态特征 . 2 2.2 吸血蠓的生活习 性 . 2 2.3 吸血蠓的危害 . 3 2.4 吸血蠓的防治 . 3 3 材料与方法 . 4 3.1 仪器与设备 . 4 3.2 实验材料 . 4 3.3 标本采集 . 4 3.4 标本的制作 . 4 3.5 标本的鉴定 . 5 3.6 基因组 DNA
11、 提取 . 5 3.7DNA 条形码基因的 PCR 扩增 . 6 3.7.1PCR 反应条件 . 6 3.7.2 PCR 产物检测及测序 . 7 4 结果与分析 . 7 4.1 东寨港红树林吸血蠓类昆虫的的物种多样性 . 7 4.2 东寨港吸血蠓类的分类检索表 . 8 4.3 吸血蠓的 DNA 条形码 . 11 4.3.1PCR 扩增及电泳产物检测 . 11 4.3.2 红树林蠓科昆虫的 COI 基因的 DNA 条形码序列 . 12 4.3.3 序列比对结果 . 14 5 结论与 讨论 . 15 5.1 结论 . 15 5.2 讨论 . 15 致谢 . 17 参考文献 . 18 东寨港红树林吸
12、血蠓的物种多样性 1 1 前言 我国现知吸血蠓类共有 3 属 413 种， 分布于全国各省区 。 其中细蠓属 有 3 个亚属 ； 刺蠓亚属为热带滨海地区的蠓类 ， 全世界共有 8 种 ， 其中 7 种分布于巴布亚新几内亚 、 澳大利亚 、 印度和坦桑尼亚 。 1 种分布于我国海南三亚 （亚 龙 湾）全蠓亚属和细蠓亚属虽说我国南北皆有 ， 但全蠓亚属 30 种多数分布于我国古北界省区内 ， 甚至在海拔 3500m 以上的阿尔金山上也有高山荒漠的特有种群 1。 细蠓亚属我国已知 有病 9 种 ， 多见于南方 ， 其中 5 种是海岛和滨海地区的蠓种 。 湖北武当山仍然是这两个亚属的交汇区 ,这里既有
13、广 布川 、 鄂等地区的郧县细蠓 、又有长尾细 蠓 和原蠓亚属的白浪细蠓 。 从数量而 言， 西北地区细蠓不仅蠓种多而且密度也高 2。库蠓属广布于世界各地，也是蠓科中最大的吸血蠓属 ,。我国是拥有库蠓最多的国家。其中有典型的古北界蠓种如雪翅库蠓和兴安库蠓只见于东北三省和西藏高原，虽是古北区广布蠓种但也见于东洋界内，如在我国既是东北林区优势蠓种，同时也出现于广西和四川；而异域库蠓虽是广布于两界的蠓种，但在我国，尚只见于东部季风区。尖喙库蠓除新疆、甘肃、青海尚无记录外，北自黑龙江，南抵台湾、海南，西抵西藏察隅，聂拉木皆有。原野库蠓遍 布我国各省区，是我国分布最广的蠓种。我国蠓科昆虫的分布特点是鄂豫
14、交界地带是东洋界和古北界蠓类种群的交汇带；吸血蠓类中，细蠓多见于西北荒漠地区，蠛蠓是南方湿润地区的优势种群。库蠓种类繁杂，南北方各有不同优势种群。总之北方蠓类群落构成的种群较简单，而优势种突出；南方蠓类群落构成的种群复杂，优势种不很突出 3。 东寨港红树林吸血蠓的物种多样性 2 2 吸血蠓的介绍 2.1 吸血蠓的形态特征 蠓类是全变态双翅目昆虫，各发育阶段均有其显著的形态特征，除具有双翅目昆虫的基本形态外，这些特征在不同亚科和不同属间均有不同。 成虫头部近球形。 复眼 发达，呈肾形。雄蠓两眼相邻接，雌蠓两眼距离较远。触角 丝状，分 15 节。在触角基部之后有 单眼 1 对。口器为刺吸式。中胸发
15、达，前、后胸较小，胸部背面呈圆形隆起。有翅一对，静止或叮刺时，相叠平置于腹部背面。翅短宽，翅上常有斑和微毛，其大小、颜色、位置等为分类依据。体长多数为 1-5mm，少数更微小者短约 0.7mm，或较大型者长约 7mm，体表有毛，呈黑色、褐色或棕色，或黑白相间。足细长。腹部 10 节，雌蠓有尾须 1 对 ;雄蠓的第 9、 10 腹节转化为 外生殖器 。卵的形状多数为一端稍细一端钝圆的梭形，长约0.34mm，卵壳表面光滑或有纹、突。幼虫细长形，蠕虫状。除细蠓外，头部有角化的头壳，内有具齿的咽和发达的大颚。胸部 3 节，腹部 9 节 4。 2.2 吸血蠓的生活习性 雌蠓吸血，而雄蠓只吸食植物汁液为营
16、养。 蠓科种类繁多，嗜食性广泛，各亚科间食性有别，在不同的种类有一定的倾向性，有的种类嗜 吸人血，有的种类嗜吸禽类或畜类血。绝大多数种类的吸血活动是在白天、黎明或黄昏进行。但常见的勒蠓属、库蠓属和拉蠓属，刺吸哺乳类的血液为主，有少数刺吸鸟类血液。蠓吸血一般没有严格的选择性，但有的种类也有倾向性，如陈旧库蠓等主要吸牛、马、猪的血，孝库蠓主要吸家禽的血 ;台湾拉蠓主要吸人的血 ;也有的蠓种刺吸禽血等。这些吸血雌蠓须吸足血后，卵巢方能充分发育。勒蠓、拉蠓在白天吸血 ;库蠓通常在晨、昏吸血。交配时，雄蠓成群飞舞，雌蠓加入婚舞求偶结对后，离群完成交配。 幼虫期生长发育的场所称为滋生地，雌虫选择滋生地一般
17、以有机物 质丰富的荫凉、潮湿的处所。成蠓平时多栖息于以草坪、树林、竹林、杂草、洞穴等避风和避光处，当温度、光线适宜，无风晴天，在草坪、田野、树林、溪边常有成群的蠓群舞。库蠓属成虫往往在日出前和日落后活动最频繁，而勒蠓属和拉蠓属则在天亮后活动较频繁。在阴天和无风天蠓活动更为频繁。 东寨港红树林吸血蠓的物种多样性 3 2.3 吸血蠓的危害 蠓科昆虫有的可播授花粉或猎食其他昆虫，有的可刺吸人、畜血液，作为传播疾病的媒介种群，因而蠓类与医、农、牧、林和园林绿化都有着密切的关系 5。通常把蠓科昆虫中吸食人、畜血液的类群称为吸血蠓类，是重要的医学昆虫。它们不仅可以 通过刺叮骚扰直接危害人、畜等动物健康；而
18、且还能作为传播媒介，播散多种病原生物，对人、畜等动物产生间接危害。据报道，目前已从蠓体内分离或检测出寄生虫近 20 种，病毒 30 多种，有的病原体已被证明可以在人群中流行和传播，给人类的健康带来严重危害 6。吸血蠓活动的季节，由于其大量孳生，反复不断地对温血动物如人、家畜、野生动物等进行骚扰和吸血，被叮刺部位常出现红点或红斑，可引起局部皮肤出现红、肿、痛、痒等过敏性皮炎症状，严重者还可出现丘疹性荨麻疹。有些蠓种唾液中含有腺苷三磷酸双酸酶可作为变应原引起超敏反应的发生 7。当大量虫体侵袭时，还可出现过敏性休克。吸血蠓刺叮骚扰活动不仅可引起畜，禽的烦躁不安、食欲不振、机体消瘦、抵抗力降低等症状，
19、而且影响人的正常工作和睡眠。因叮咬部位剧烈痛痒，抓挠使皮肤破损，还可引起继发性细菌性感染。吸血蠓类可携带多种病原生物，通过机械性传播和生物性传播的方式，在人和动物之间传播 8。有些病原生物甚至可经吸血蠓类引发疾病的暴发与流行，对健康产生严重危害。 2.4 吸血蠓的防治 吸血蠓的种类多，成虫以野栖为主，其幼虫孳生生境多样，防治较为困难。过去我国媒介昆虫的防治主要是应用化学杀虫剂以达到防治 的目的，在预防和控制疾病流行方面发挥了重要的作用。化学杀虫剂长期大量使用会存在媒介昆虫产生抗药性和环境污染等严重问题。目前，防治的重点已由过去单一的化学防治，转变为以生态学研究为基础，因地、因时制宜地采取有效的
20、综合措施，以减少其产生的危害 9。其防治措施主要表现在以下几个方面 : （ 1）加强个人防护 例如可配戴驱避头网，常用的有避蚊胺头网和驱蚊灵头网或83-1 型防蠓帽，加强对头颈部的个人防护 ;也可穿着用复方缓释驱避剂处理的工作服，或用驱避纸巾、防蚊 ( 蠓 ) 叮酊剂、丁香酚缓释驱避剂及止痒 ( 痛 ) 清凉油 ( 改进配方 )涂擦暴露皮肤，其效果反映良好 10。 东寨港红树林吸血蠓的物种多样性 4 （ 2）加强住所周围环境治理 环境治理是指对周围环境的处理、改造及改善人们居住条件和习惯，以达到减少或防止吸血蠓的孳生和产生的危害。根据吸血蠓类生活习性，我们可采取适宜措施和方法以减少吸血蠓的栖息
21、和孳生的场所，例如清除禽畜圈舍周围的杂草，暴露地面，让阳光直接照射，堵塞树洞，排除无用的积水或填平洼地水坑，必要时可喷洒杀虫剂，以达到环境治理的目的。近年来，人们对卫生害虫的环境防治也越来越重视。 （ 3）采用物理化学手段防治 物理化学手段是防治媒介昆虫的常用方法。在吸 血蠓高峰活动季节及一日消长的活动高峰时域，可采用超低容量喷雾杀虫和热雾杀虫 2 种方法进行化学杀虫，其中氯菊酯、溴氰菊酯等化学杀虫剂的使用效果较好，可有效减低成蠓密度 11。由于广谱化学合成杀虫剂易使媒介昆虫产生抗药性且污染环境，人们开始把目光转向使用更加安全、可靠的生物农药的开发和研制，以达到防治媒介昆虫的目的。 3 材料与
22、方法 3.1 仪器与设备 MOTIC SMZ-140 解剖镜； LX-200 小型离心机； VISOOOO 混匀器； TU-100 恒温器；镊子； 解剖针 3.2 实验材料 蠓；天根血液细胞组织基因 组 DNA 提取试剂盒；酒精；蛋白酶溶液；无水乙醇； ddH2O 3.3 标本采集 于 2015 年 10 月对位于演丰的海南东寨港红树林周边的蠓类利用灯诱 、 网捕和人诱 的方法进行了系统采集。 3.4 标本的制作 将保存在 70%乙醇的蠓取出，在解剖镜下割下一侧翅，在洁净的载玻片上先滴一小点胶，而后将割下的翅用解剖针针尖轻挑至该胶中使之平黏于载玻片上。东寨港红树林吸血蠓的物种多样性 5 而后将
23、已割翅的虫体移至 50%乙醇中，浸 15 分钟后移至蒸馏水（凉开水也可），在水中浸 15 分钟后再换一次水，再浸 15 分钟后移至 5%-10%的氢氧化钾（钠）溶液内腐蚀，待在解剖镜 下雌虫受精囊，雄虫尾器等清晰可见即可，通常在室温中约需 6 小时方可。 上述经氢氧化钾腐蚀透明的虫体，再经 2 次水洗、而后再依次经 50%， 70%，80%， 90%乙醇各 15 分钟脱水后，再在原黏翅的载玻片上的翅侧加一小点胶，将虫体从 90%乙醇中挑至胶中，在解剖镜下将蠓的头、胸、腹三部解剖开，而后分别使头部正面向上，触角、触须理直；胸部侧置，将足理直；腹部腹面向上，尤其尾器要放平。暂不盖盖玻片，待 1 2
24、 天后稍干，使标本位置固定后再加一滴胶然后再加盖玻片。 刚盖盖玻片的标本一定要平置，以免胶流动而使标本移 位受损。 3.5 标本的鉴定 把制作好的标本拿到显微镜下进行翅的形态观察，并根据吸血蠓翅形态的差异对标本进行分类。 3.6 基因组 DNA 提取 采集的蠓科昆虫经分类鉴定后，参照 Bellis 等 （ 2013）无损形态特征提取蠓科昆虫基因组 DNA 的方法利用试剂盒法进行，具体如下： （ 1）蘸取酒精，灼烧镊子（防止其他 DNA 的污染） （ 2）用镊子取出吸血蠓放入加 180 lBuffer ATL 的离心管中，继续加入 20l proteinase K 溶液，混匀器振荡混匀，放入 5
25、0的恒温器中保温过夜，直到组织完 全溶解。在进行下一步之前进行混匀 15S。 （ 3）加入 200 lBuffer AL。混匀器振荡混匀，放入 56的恒温器中 10min。 （ 4）加入 200 l 无水乙醇，充分振荡混匀。 （ 5）将上述所得溶液都加入到一个吸附柱中，（吸附柱放入一个 2ml 收集管中）， 8000rpm离心 1min。丢弃废液以及收集管。 （ 6）将吸附柱放入一个新的 2ml 收集管。加入 500 lBuffer AW1。 8000rpm离心 1min。丢弃废液以及收集管。 东寨港红树林吸血蠓的物种多样性 6 （ 7）将吸附柱放入一个新的 2ml 收集管。加入 500 lB
26、uffer AW2。 14000rpm离心 3min。丢弃废液以及收集管。 （ 8）把吸附柱转移到一个新的 1.5ml 或 2ml 离心管。 （ 9）洗涤 DNA 通过加入 120 lBuffer AE 在吸附柱膜的中心，室温放置一分钟， 8000rpm离心 1min。 （ 10）重复步骤 9 来提高 DNA 产量。 3.7 DNA 条形码基因的 PCR 扩增 选择动物通用的条形码基因细胞色素氧化酶 I（ COI） 的基因片段作为分子标记。引物为通用引物 1718M 和 2191M。 PCR 反应缓冲液（表 1）。反应体系为20 l。 ddH2O 的量可以上下微调，但是总体积保持在 20 L，以 确保 PCR 扩增出来的浓度较高。 表 1 PCR 反应缓冲液比例 试剂名称 用量 （ l） 10Buffer dNTP Taq ddH2O 引物 a 引物 b DNA Mg2+ 2 1 0.3 9.7 0.5 0.5 4 2 3.7.1 PCR 反应条件 在干净的离心管中依次加入如上体系，混合均匀，置于 PCR 仪进行 PCR 反应，扩增条件如下： 94下变性 30S， 50退火 30S， 72延伸 1min，共 40 个循环。反应前 94预变性 2min，反应后 72延伸 5min。
