1、沉默谷胱甘肽S转移酶mu5对人支气管上皮细胞炎症氧化的调节作用研究【摘要】 目的 建立肿瘤坏死因子 （TNF-）诱导支气管上皮（16HBE）细胞炎症模型，探讨谷胱甘肽 S 转移酶 mu5（GSTM5）在炎症诱导的氧化应激损伤中的作用。方法 以 TNF-（10 ng/mL）刺激 16HBE 细胞，利用 GSTM5 真核表达载体、RNAi 干扰技术过表达或沉默GSTM5，比色法检测细胞内丙二醛（MDA）及总抗氧化能力（T-AOC） ；MTT 法检测细胞存活率；ELISA 法检测白介素-1b、白介素-6、白介素-10、INF-y 浓度，结果 沉默 GSTM5 基因可促进 TNF- 诱导的细胞内 MD
2、A 的增高（ P0.05） 。GSTM5质粒组 MDA 水平较 TNF- 组和阴性对照组显著下调（1.530.15）nmol/mg pro 比（1.97 0.26）nmol/mg pro 和（2.080.07）nmol/mg pro，P0.05） 。GSTM5 质粒组 T-AOC 较空白对照组、TNF- 组和阴性对照组显著上调（3.780.42）U/mg pro 比（1.930.29）U/mg、 （1.300.14）U/mg pro 和（1.280.21） U/mg pro，P0.05） 。GSTM5 质粒组细胞存活率较 TNF- 组和阴性对照组显著升高（69.15%9.23%比 56.31%
3、4.33%和56.10%5.22%，P0.05） ，较空白对照组仍有明显降低（69.15%9.23%比99.20%3.79%，P0.05） 。siGSTM5 组细胞存活率较空白对照组、TNF- 组和阴性对照组降低（39.91% 3.43%比 99.20%3.79%、56.31%4.33%和 56.10%5.22%，P0.05） 。结果见图 2。4. 细胞上清炎症因子测定TNF- 组细胞炎症因子较空白对照组显著升高，与阴性对照组差异无统计学意义。GSTM5 质粒组细胞炎症因子较 TNF- 组和阴性对照组显著降低，较空白对照组仍有明显降低。siGSTM5 组细胞存活率较空白对照组、TNF- 组和阴
4、性对照组降低（39.91% 3.43%比 99.20%3.79%、56.31%4.33%和 56.10%5.22%，P0.05） 。结果见图 3。讨 论ARDS 的主要病理生理事件包括中性粒细胞激活，ROS 爆发，肺动脉高压，渗出性肺水肿及其他相关器官功能障碍 8。病人的生存受免疫-炎症信号通路的调节，而炎症过程中转录因子调节及 ROS 来源有着重要地位，例如 NF-kb、NADPH 氧化酶 9。多项研究结果表明 TNF- 是介导 ARDS 的早期细胞因子之一，亦 是细胞因子网络级联反应的启动因子 10。本实验室前期研究发现：TNF- 刺激 A549 细胞可在基因水平上调 NF-B p65 的
5、表达，并增加NF-B 蛋白的核转位，沉默 NF-B p65 基因下调 TNF- 诱导的肺泡上皮细胞的炎症反应11。这说明使用 TNF- 刺激 16HBE 可激活 NF-B，而 NF-B 是多种炎症、氧化因子的转录因子，是炎症反应的核心，建立肺泡上皮细胞急性炎症模型成功。前炎症因子可使 NADPH 氧化酶活化，ROS 过度产生，进而引起 ARDS、哮喘、囊性纤维化、COPD 的发生 9。NOX1 是 NADPH 氧化酶家族的主要成员，TNF- 刺激 16hbe 细胞后 NOX1 转录及表达明显上调 12。本研究小组前期对炎症诱发的氧化应激调控的研究发现，GSTM5 与NOX1 启动子间存在着相互
6、作用 13，这引起了我们对 GSTM5 的关注。后续的研究发现增强 GSTM5 表达对炎症诱发的人支气管上皮细胞氧化应激损伤有保护性调节作用，其机制与下调 NOX1、NOX2 基因表达密切相关 12。以上研究说明炎症刺激- TNF-NF-kb- NADPH 氧化酶-ROS 可能 ARDS 发生发展的是重要线索，而 GSTM5 可下调 NOX1、NOX2 表达，起到减轻 ARDS作用。氧化应激时体内高活性分子如 ROS 产生过多，造成肺结构细胞氧化损伤，加重 ARDS14。MDA 是自由基作用于脂质发生过氧化反应的最终代谢产物，其浓度可反映自由基对组织细胞的损伤程度 15。T-AOC 是一个体系
7、内的各种抗氧化大分子、抗氧化小分子和酶的总的水平，其水平反映了体系总抗氧化能力。本实验室前期研究结果显示，单纯以 TNF- 刺激 16HBE细胞，MDA 浓度较空白对照组明显升高（ P0.05） ，T-AOC 能力降低（P0.05） ，且细胞存活率下降（P0.05） 。这说明 TNF- 在其诱导的细胞炎症过程中诱发了氧化应激反应和细胞的氧化损伤。GSTM5 质粒转染组的 MDA 浓度较 TNF- 组降低（ P0.05） ，T-AOC 能力显著增高（ P0.05） ，细胞存活率回升（ P0.05） 。本研究补充了 siRNA 干扰 GSTM5，这提示减弱GSTM5 表达可有效增强炎症反应诱发的氧
8、化应激，加重肺结构细胞的损伤，GSTM5 具有保护性的调控作用。引起 ARDS 的炎症介质主要包括促炎因子 IL-1、IL-6、IL-8、IL-12 、TNF- 和 干扰素 ( -IFN) ，以及抗炎因子 IL-4、IL-10、IL-13、转化生长因子- 和粒细胞噬细胞集落刺激因子，这些炎症介质构成了 ARDS 炎症反应和免疫调节的基础 16-18，在临床工作中，只有极少数的生物标记物可用于 ARDS 的诊断、预后、治疗反应的评估，部分研究发现 ARDS 患者肺泡灌洗液中 TNF-, IL-1, IL-6, IL-8 升高，其中治愈患者升高程度高于死亡患者 19。本研究通过构建 GSTM5 真
9、核表达载体、siRNA 并转染 16HBE 细胞，TNF- 刺激 16HBE 建立细胞急性肺损伤模型，选取促炎抗炎因子的典型代表 -IFN, IL-1, IL-6, IL-10，发现 TNF- 刺激使细胞炎症因子上调，与上述结果吻合，即 GSTM5 过表达可减少其促炎作用，干扰 GSTM5 表达可增加其促炎作用。综上所述，siGSTM5 沉默 GSTM5 表达后，使细胞内的总抗氧化能力减弱，代表氧化应激损伤的 MDA 水平上升，支气管上皮细胞的生存率下降，炎症因子水平升高。而当 GSTM5 质粒增强 GSTM5 表达后，肺组织结构细胞生存率回升， MDA 水平下降，总抗氧化能力明显升高，炎症因
10、子水平降低。上述研究结果从正反两个角度证明了 GSTM5 可有效下调炎症反应诱发的氧化应激，减轻肺结构细胞的损伤，起到保护性的调节作用。炎症反应是肺结构细胞破坏的重要因素，其与氧化应激互为因果，相互促进，促进 ARDS 的发生发展。GSTM5 具有抗氧化能力，对炎症诱发的支气管上皮细胞的氧化应激损伤有保护作用。此研究为 ARDS 的综合治疗提供了有益的启示。参考文献1 Ranieri V M, Rubenfeld G D, Thompson B T, et al. Acute respiratory distress syndrome: the Berlin DefinitionJ. JAMA
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