1、1湖 南 农 业 大 学全日制普通本科生毕业论文生物传感器检测 Hg2+新方法的初探A PRELIMINARY STUDY ON MERCURY ION DETECTION BY BIOSENSOR学生姓名：学 号：年级专业及班级： 食品质量与安全 指导老师及职称： 学 院：食品科学技术学院湖南长沙提交日期： 年 月2目 录摘 要 .1关键词 .11 引言 .22 试验试剂与仪器 .52.1 试验材料与试剂 .52.2 试验仪器 .52.3 试验方法 .52.3.1Tris（三（羧甲基）氨基甲烷）-Ac 缓冲液的配制 .52.3.2 多种核酸探针（RP， MB，HP，SD-1，SD-2，DNA
2、zyme ）的预处理 .52.3.3 Hg2+对荧光强度影响 .52.3.4 MB 性能研究 .52.3.5 Mg2+浓度对荧光强度影响 .62.3.6 DNAzyme 性能研究 .63 结果与分析 .63.1 Hg2+对荧光强度影响 .63.2 MB 性能研究 .73.3 Mg2+浓度对荧光强度影响 .73.4 DNAzyme 性能研究 .83.5 DNAzyme 未能有效打开 MB 发卡结构的原因分析 .83.5.1 DNAzyme 尚未完全活化 .83.5.2 DNAzyme 活性下降 .84 总结 .9参考文献 .9致 谢 .111生物传感器检测 Hg2+新方法的初探摘 要：本文尝试设
3、计一种基于脱氧酶（DNA 酶）双步信号放大的生物传感器检测汞离子，重点论证了所设计的传感策略的可行性。试验结果表明，所设计的传感器还需要进一步完善。主要原因可能是因为 DNA 酶未能有效地打开分子信标的发卡结构。针对这个原因，本文做了一系列的因素考察，包含：更换不同公司的分子信标、Mg 2+浓度的影响、不同浓度 DNA 酶打开分子信标的效果等。给出以下建议：（1）适当缩短分子信标的互补部分（短径部分）、（2）增加识别探针的碱基数目、（3）适当增加 DNA 酶的长度，提高酶活能力、（4）提高 DNA 酶活化的温度，进一步探讨 DNA 酶活化的条件。关键词：脱氧核酶；分子信标；发卡结构；汞离子；双
4、步信号放大A Preliminary Study on Mercury Ion Detection by BiosensorAbstract: In this article, we tried to design a high sensitive biosensor for determination of mercury ion based on the double step signal amplification of deoxyribozyme. Herein, we focus on the feasibility of our sensor. The results shows
5、 that the presented design should be further improved. The key cause could be that DNAzyme cant open the hairpin structure of Molecular Beacon (MB). Therefore, we investigated the probable cause, including using MB from different companies, setting different concentrations of magnesium ions and the
6、effects of different DNAzyme. Four suggesting are supplied for improving our sensor, (1) shorten the complementary parts of molecular beacons (short diameter parts); (2) increasing the number of bases for identification probes; (3) increasing the length of DNA enzyme to improve the enzyme activity;
7、(4) the temperature of DNA enzyme activity can be increased and the condition of DNA enzyme activation should be further discussed.Key Words: DNA enzyme; Molecular beacon; Hairpin structure; Mercury ions; Double step signal amplification 21 引言汞是一种剧毒的重金属元素，是在室温条件下唯一呈现液态的金属，具有较高挥发性。毒性方面，只需要少量即可对人体造成严重
8、伤害 1-2。我国规定在饮用水中汞离子的限量为 0.001mg/L3汞污染的主要来源是燃煤行业、有色金属冶炼及水泥生产4。由于汞污染具有来源广、不易控制、只需少量即可造成毁灭性伤害的特点，所以在世界各国和各国际组织中对汞元素的污染越来越重视。传统检测汞离子的方法具有操作复杂，一次检测耗费时间长，费用较昂贵等缺点 5-7，因此，开发新的汞污染的检测技术成为了越来越多的科研工作者所关注的焦点 8-10。生物传感器具有操作简便，选择性好，检测限低的特点，如徐宁等研究的电化学DNA 传感器，可实现对 Hg2+的定量检测，检测限为 0.4 nm11， 肖芳兰等人开发的利用增强型青色荧光蛋白 (ECFP)
9、 作为报告物所建立的特异性汞离子微生物传感器，其检测限为 0.1538.4mol/L12 利用生物传感器对汞离子进行实时监测仍有许多值得我们去研究和探索的空间，对其进行研究和发展对食品检测领域具有重要意义。在此基础上，我们可以对信号进行双步放大可以提高生物传感器对汞离子的选择性，提高检测汞离子的灵敏度，降低汞离子检测限。如刘光鹏等研究基于 DNA 扩增信号放大检测环境重金属离子适体生物传感器其检测限可以达到 2.5 pM13-15虽然现有的汞离子检测方法能够满足检测的要求，但是国内专家学者对汞离子检测方式的研究却从未止步。总的来说，对汞离子检测方式的研究目的是为了实现对汞离子的痕量检测，减少检
10、测过程所花费的人力、物力、时间。如：郑爱华，王佳慧等五人研究的基于水溶性硅量子点的汞离子传感器，其检测限为 2.210-8 mol/L16;张彩红等五人研究的基于 L-半胱氨酸组装银纳米棒的 SERS 汞离子传感器，检测限为 1 nM，是一种高效快捷灵敏度高的检测方法 17。汞离子传感器的研究大致分为以下两类：一是生物传感器，其具有选择性强、检测限低等优势，是汞离子检测领域的热门之一。如：彭涛，王见一等七人研究的蛋白质杂化荧光金纳米簇汞离子传感器，在最佳条件下只需 3 min 完成检测，其检测限为 0.4 g/L18；魏胤，杨金玲等三人研究的基于纳米石墨和单链脱氧核糖核酸混合物的荧光传感器检测
11、汞离子，其检测限为 0.5 nM19，等。第二类是化学传感器，如：郭志勇、贾芸芳研究的石墨烯场效应晶体管型汞离子适体传感器 20；余柱，田再文等五人研究的一种基于汞离子促进硫缩醛去保护的高选择性比色荧光双识别的汞离子化学传感器等 21。国外的专家学者在这方面的研究方向与国内大致相同，如： Moutcinet 等人 研究出了一种用 EDTA-CPE 修饰电极对水样中痕量汞的电化学测定方法，该测定方法具有高灵敏度。高选择性，可以实3现对汞的痕量检测 22; Armin Fashi 等四人研究的采用微体积紫外- 可见光分光光度法检测水中及鱼中汞含量，检测限分别为 0.7 g/L， 12 g/kg23
12、 。Mojtaba 等五人研究的研究了一种基于中-四基 (2-羟基萘基) 卟啉 (MTHNP) 的新型荧光体细胞凋亡膜 (MTHNP)，用于高度敏感和选择性地监测 Hg2+离子，这种检测方法对汞离子具有高度选择性，其检测限可以达到 5.010-9 mol/L，且响应时间少于三分钟 24。本文提出了一种基于脱氧核酶双步信号放大的生物传感器用于对汞离子的高灵敏检测的构想：由于设计的脱氧核酶 SD-1 与脱氧核酶 SD-2 的 DNA 链不具备互补配对片段，在没有其它辅助因子的存在情况下，SD-1 与 SD-2 之间不能互补配对，也就 不能实现酶活的作用。因此本文设计了一条识别探针(Recongni
13、tion Probe, RP), 当汞离子存在的条件下，RP 中的 “T”会使 SD-1，SD-2 中的“T ”形成 T-Hg-T 结构，进而形成一个 RP/Hg/SD-1/SD-2 杂交互补配对结合物，实现拉近 SD-1 与 SD-2 两种 DNA酶距离的目的。通过 Mg2+的催化作用，以此来实现打开分子信标（Molecular Beacon, MB）发卡结构的目标。 MB 发卡结构的两个末端，既 FMB（荧光基团）与 QMB（荧光淬灭部分基团）距离较小，使得荧光分子发出的荧光被猝灭分子吸收并以热的形式散发，荧光几乎完全被猝灭，荧光本底极低。在本试验中，由于 MB 具有与RP/Hg2+/SD
14、-1/SD-2 复合物相互配对的结构，所以 MB 的发卡结构会被打开，同时释放出 FMB，以及 QMB，使得 FMB 与 QMB 之间的距离加大，产生了荧光。与此同时，发夹探针（Hairpin Probe）HP 与 SD-2 和 QMB 之间具有互补配对结构，可以形成杂交互补配对结合物（HP/SD-2/QMB ）。这种结合物与 MB 具有互补配对片段，能继续与发卡结构的 MB 结合，使得 MB 中荧光基团被释放出来，荧光信号会得到进一步的加强。因此，在本试验中，MB 能够在两个过程中释放出荧光基团，达到信号双步放大的目的。试验原理如图 1 所示，DNA 链序列如表 1 所示。针对提出的设想，本
15、文从 MB 分子信标的性能、Mg 2+， 浓度对打开 MB 的影响、不同浓度 DNA 酶打开的效率等多个方面对实现设计高灵敏检测汞离子新方法进行初步的探究。4图 1 生物传感策略原理图Figure 1 Principle of sensor strategy表 1 8 种 DNA 链的序列表Table1 Sequences of RP，SD-1 ，SD-2，HP，MB，RPC，SNB，DNAzymeName Sequences(5-3)RP TAG CTT CAG TTC TCT CGT CAG ATRPC（RP 对照组） AAA CCT AAC ATC CAA CAC AAG AASD-1
16、ATC TGT CGA GTG GTT ACA CCC ATG T TCG TCASD-2 TCT TGC AGC GAT TAA C AAC TGA TGC TAMB （FAM ）-TGA CGT ACC T CCC CCC TGA CGA TrAG GCA AGA TCA TA AGT AGG TAC GTC A -(DABCYL)HP AAC TGA TGC TA TGA CGT ACC TAC TTA TGA TCT TGC TAG CAT CAG TT GTT ACA CCC ATG T TCG TCASNB TGA CGT ACC TAC TTA TGA TCT TGC CTA T
17、CG TCA GGG GGG AGGDNAzyme TCT TGC AGC GAT TAA CGT TAC ACC CAT GTT CGT CA52 材料与方法2.1 试验材料与试剂分子信标 MB；发卡 DNA HP；脱氧核酶 SD-1；脱氧核酶 SD-2；探针 DNA RP（五种 DNA 链生产公司为生工生物工程（上海）公司）；MB（大连宝生物公司）；SNB （MB 的互补配对链）；DNAzyme （DNA 酶）；乙酸（分析纯）；硝酸汞(分析纯，国药试剂化学试剂有限公司)；乙酸镁（分析纯，科密欧化学试剂有限公司（天津）；乙酸钠（分析纯，国药集团化学试剂有限公司）；三（羧甲基）氨基甲烷（分析纯
18、，国药集团化学试剂有限公司）；试验用水为超纯水。2.2 试验仪器日立 F-7000 型分子荧光分光光度计（日本，日立公司）； pH 计（FE20，梅赛勒托利多（上海）有限公司）；数显恒温水浴锅（HH-6，常州拓兴试验仪器厂）；电子天平（CP114，奥豪斯仪器（上海）有限公司）；离心机（PICO-17）；移液枪2.3 试验方法2.3.1Tris（三（羧甲基）氨基甲烷）-Ac 缓冲液的配制配制 20 mM 的 Tris-Ac 溶液，使用 pH 计将 20 mM Tris 溶液的 pH 值调至 7.4。溶液的 pH 值达到试验要求后，分别向其中加入乙酸钠、乙酸镁，使其终浓度分别为150、20mM 。
19、两种试剂充分溶解后缓冲液配制完成。2.3.2 多种核酸探针（RP， MB，HP，SD-1，SD-2，DNAzyme ）的预处理从冰箱里取出冷藏保存的 DNA 链，在 85条件下水浴 15 至 20 min；然后拿出，在室温条件下冷却 15-20 min，冷却完毕后 DNA 链活化完成。活化完毕后将 RP，SD-1，HP 稀释至 1 M，将 MB 稀释至 2 M。2.3.3 Hg2+对荧光强度影响设置两组样品进行试验。其中第一组添加五种 DNA 链（RP，SD-1，SD-2，MB，HP）及汞离子；第二组添加五种 DNA 链 (RP，SD-1，SD-2，HP ，MB ）；五条 DNA 链添加的体积
20、为：RP，MB ， SD-1， SD-2，HP 均为 30 L ，SD-2 为 60 L 。各组样品的最终体积为 600 L。各组样品室温（25）反应一小时，然后分别扫描荧光光谱（设置激发波长为 495 nm，发射波长为 518 nm，扫描时长为 3600 s）。观察两组样品荧光光谱，确定 Hg2+对荧光强度的影响。2.3.4 MB 性能研究两种不同的 MB, 分别购置于生工生物公司和大连宝生物公司。将在生工生物公司购买的 MB 配置成终浓度为 200 nM 的溶液（终体积为 600 L），使其与不同终浓度的 SNB（500 nM, 1000 nM），DNAzyme（500 nM, 1000
21、nM）进行反应，比较荧光6强度。试验条件为激发波长为 495 nm，发射波长为 518 nm，扫描波长为 510 nm - 560 nm。在相同的试验条件下，设置对照组，将在大连宝生物公司购买的 MB 配置成终浓度为 200 nM 的溶液（终体积为 600 L），使其与终浓度为 1000 nM SNB 和终浓度为 1000 nM 的 DNAzyme 进行反应，比较荧光强度。2.3.5 Mg2+浓度对荧光强度影响分别配制 Mg2+浓度为 10 nM ，30 nM，50 nM，75 nM，90 nM 的 Tris-Ac 缓冲液。往最终浓度为 200 nM 的 MB 以及最终浓度为 1000 nM
22、的 DNAzyme 的 五组样品中分别添加 Mg2+浓度为 10 nM ，30 nM，50 nM，75 nM，90 nM 的 Tris-Ac 缓冲液。设置一组对照组，不添加 Tris-Ac 缓冲液。扫描样品的荧光光谱。2.3.6 DNAzyme 性能研究设置四组样品。每组样品都添加 500 nM 的 MB。设置一组样品作为对照组，不添加 DNAzyme。其余三组样品添加 DNAzyme 的量为： 250 nM，500 nM，1000 nM，各组样品先 40 反应 2 h，然后扫描荧光光谱。（试验条件为激发波长为 495 nm，发射波长为 518 nm，扫描波长为 510 nm - 560 nm
23、）3 结果与分析3.1 Hg2+对荧光强度影响试图开发对汞离子特异性响应的生物传感的关键点在于，汞离子的加入能够拉近裂开型 DNA 酶 SD-1 与 SD-2，从而共同作用来打开分子信标。如图 2 所示，传感体系中引入汞离子与没有引入汞离子的最大荧光强度基本没有变化。这说明汞离子对荧光强度影响低。试验结果证明在传感体系中所有 DNA 链和汞离子存在的情况下，分子信标发卡结构被打开的程度还是低，荧光基团与荧光淬灭基团之间的距离没有变化，荧光处于淬灭状态。所以荧光强度没有显著增强。这个试验结果与预想的结果出入较大，说明传感器在设计上还需要进一步改善。因此，本文对分子信标，Mg 2+浓度和DNAzy
24、me 这三个可能导致试验结果不理想的因素进行了研究。图 2 Hg2+对荧光强度影响Figure 2 Effect of mercury ion on fluorescence intensity73.2 MB 性能研究使用不同的分子信标进行比较试验，确定试验中的分子信标的功能性。试验结果如图 3 所示。左侧图 DNA 链来源生工生物工程公司，右侧图 DNA 链来源为大连宝生物公司。由图 3 可以推论，生工生物工程公司所生产的分子信标能够与 SNB（MB互补配对 DNA 链）相结合，使得发卡结构被打开，释放荧光。但 DNAzyme 的加入并不能使荧光强度增强。同理，大连宝生物所生产的分子信标也能
25、够与 SNB（MB 互补配对 DNA 链）结合，使得发卡结构被打开，释放荧光。但 DNAzyme 的加入并不能使荧光强度增强。对结果进行比较分析，可以说明生工生物工程公司与大连宝生物公司生产的分子信标在性能方面没有问题。因此，试验中所使用的分子信标可以被打开并释放出荧光基团，分子信标不是造成试验结果不理想的原因。图 3 MB 与 SNB，DNAzyme 反应情况图Figure 3 The reaction of MB with SNB and DNAzyme3.3 Mg2+浓度对荧光强度影响图 4 为 Mg2+浓度对荧光强度的影响图。图 4 说明，Mg 2+浓度上升，荧光强度也随之上升。但 M
26、g2+浓度的上升并没有对荧光强度产生显著影响。荧光强度的上升幅度低，信噪比低。所以，Mg 2+浓度的高低并不是造成试验结果不理想的原因。图 4 不同浓度 Mg2+对荧光强度影响Figure 4 Effect of different concentration of magnesium ions on fluorescence intensity83.4 DNAzyme 性能研究分子信标的稳定温度为 50 ，溶解分子信标发卡结构短径中互补配对链需要大于 30 的条件。本文选择在 40 条件下让 MB 与 DNAzyme 反应 2 小时，使分子信标发卡结构原因更容易打开。试验结果如图 5 所示。
27、结果表明，四组样品的最大荧光强度差距非常小。造成这种结果的原因是在试验中 DNAzyme 未能有效打开分子信标的发卡结构，分子信标发卡结构中的荧光基团与荧光淬灭基团依旧靠近，荧光被淬灭。结合分子信标性能研究的分析试验结果，可以知道生工工程公司与大连宝生物公司生产的 DNAzyme 都没能有效打开分子信标的发卡结构，所以排除试剂因素对试验造成影响的推断。综上，可以得出以下结论：试验中 DNAzyme 性能不好，使得DNAzyme 未能有效打开分子信标发卡结构，这是造成试验结果不理想的原因所在。图 5 MB 与不同浓度的 DNAzyme 在 40 条件下反应两小时荧光光谱图Figure 5 Wit
28、h different concentrations of MB DNAzyme in 40 under the condition of reaction two hours fluorescence spectra3.5 DNAzyme 未能有效打开 MB 发卡结构的原因分析3.5.1 DNAzyme 尚未完全活化本试验使用的 DNAzyme 需要在 85条件下进行预热，预热的目的是为了活化DNAzyme。在 DNAzyme 尚未完全活化的情况下， DNA 酶打开发卡结构的分子信标的效果大打折扣，分子信标的荧光还是处于淬灭状态。所以，DNAzyme 尚未完全活化可能是导致 DNAzyme 未能打开分子信标发卡结构的原因之一。3.5.2 DNAzyme 活性下降试验过程中 DNA 酶可能因为某些因素导致其活性下降。造成 DNAzyme 活性下降的原因可能是：操作过程中温度急骤下降导致 DNAzyme 活性下降等原因。
