1、摘要偶氮甲酰胺因具有漂白性和改良性常作为一种面粉改良剂，但其在烘焙过程中会产生一种致癌的次级产物氨基脲，因此，在一些国家偶氮甲酰胺的使用是被禁止的。美国食品及药物管理局和我国规定面粉中偶氮甲酰胺的的最大使用量为 45 mg/kg。为保证食品安全，急需一种快速有效的检测方法，目前常用方法有高效液相色谱检测法，此法虽也是一种行之有效的方法，但样品前处理较麻烦。本实验采用表面增强拉曼散射(SERS)光谱检测面粉中的偶氮甲酰胺，以AuAg 纳米粒子作为增强基底，利用基底对于检测对象的吸附作用，使得原本很弱的拉曼信号增强，检测过程快速、简便，在水中及面粉中的检测限分别为 0.1 M、10 M。关键词：偶
2、氮甲酰胺、面粉、SERS、AuAg 纳米粒子、定量检测AbstractAzodicarbonamide often serves as a kind of flour improver for its bleaching and amend. Butduring the roasting process,it can release a carcinogenic secondary productsemicarbazide. Therefore, the use of azodicarbonamide is prohibited in some countries. In the United
3、 States, food and drug administration (fda) and our countrymake the rules of azodicarbonamide maximum usage in flour of 45 mg/kg. In order to ensure the safety of food, a quick and effective detection method is urgently needed.High performance liquid chromatography (HPLC) is a commonly used methodat
4、 present.Although this method is also a kind of effective one, but sample pretreatment has more trouble during the experiment. In this experiment,surface enhanced Raman scattering (SERS) spectroscopy detection is used to detect azodicarbonamide in flour, Au Ag nanoparticles as strengthen the base.,I
5、t can enhance originally very weak Raman signalby using the adsorption effect of basement for object detection.Detection process is quick andsimple.The detectedlimitation in the water and in flourare 0.1M and10 M.Keywords:Azodicarbonamide, flour, SERS, AuAg nanoparticles, quantitative detection1. 引言
6、1.1 偶氮甲酰胺的应用及现状偶氮甲酰胺在日常生活中主要作为添加剂使用，主要应用在以下两个方面：一是在制作发泡塑料的过程中作为发泡剂使用，在受热的条件下，偶氮甲酰胺会分解产生 N2、CO、CO 2 和 NH3，这些气体在材料中被困住无法自由逸出，形成气泡，制成发泡塑料。二是作为食品添加剂添加在面粉中作为面粉增白剂和改进剂，以此来提高烘焙产品的质量。它能够使面粉更白更具有韧性，促进成熟缩短制作时间。在对于面粉的熟化上，小麦粉中的半胱氨酸会被偶氮甲酰胺氧化，增加面粉的筋度，使气体能够更多地保留在面团内，提高烘焙产品的韧性和弹性，使面团更易操作及调理。然而，去年爆出的赛百味“鞋底面包”事件让公众对于
7、这个食品添加剂谈之色变。事实上，偶氮甲酰胺使用时是在湿面团中作为氧化剂 2，其本身属于碱性物质，过量使用可能会对人的肝脏和肠胃造成损伤，同时偶氮甲酰胺在高温下分解产生气体发泡，这个反应的主要产物为联二脲 3，联二脲在烘培过程中能够保持稳定，而这个反应的次级产物有氨基脲 4和氨基甲酸乙酯 5。氨基脲（SEM）属于硝基呋喃类药物中的代谢物，存在致畸、致突变、致癌的可能。虽然目前，有关 SEM 的毒性数据还不充分，但经临床医学实验研究发现它的确会引起消化道不良反应，如厌食、恶心、呕吐、腹泻等症状，严重的可导致有机体的基因突变。英国健康安全局发现在工厂环境下，生产偶氮甲酰胺可以导致呼吸系统的过敏，有可
8、能引发哮喘症状。世界卫生组织也认为偶氮甲酰胺与其工厂中工人的“呼吸系统疾病、过敏和哮喘”等情况有密切关联。然而目前可用的数据仅限于在这些工厂环境下生产或者直接接触的情况下。由于缺乏数据，目前无法对于其对一般大众的暴露结果有一个准确的定论 13。因此，出于安全性考虑，世界上绝大多数国家和地区都对偶氮甲酰胺的使用作出了明确规定，美国食品及药物监督管理局将偶氮甲酰胺的分类定位为“一般而言是安全的” ，并允许在食物中使用不超过 45 mg/kg 的偶氮甲酰胺 6, 11。在欧洲，从 2005 年 8 月起，凡是会与食物直接接触的塑料物品中均不允许使用偶氮甲酰胺进行发泡 10。澳大利亚也禁止在食品中使用
9、 9。美国食品及药物监督管理局和中国规定偶氮甲酰胺的最大用量为 45mg/kg（GB2760-2011 ）8。在规定的用量下，偶氮甲酰胺能在确保安全的情况下发挥其功效。由于偶氮甲酰胺具有上述危害，因此，需要找到一个快速准确高效的检测方法对其进行定量检测。1.2 表面增强拉曼散射(SERS)光谱拉曼光谱是分子振动光谱的一种。处在振动基态的分子被入射光激发到一个能量较高的虚拟态，此时分子是很不稳定的，很快就会返回基态，并将吸收的能量以光的形式释放出来，光子的能量和方向都改变了，这种现象叫做拉曼散射。但是普通的拉曼光谱散射非常弱，散射光强度仅为入射光的 10-10，拉曼信号很难检测。表面增强拉曼散射
10、(SERS)光谱，它是利用基底对于目标物质的物理吸附，使拉曼信号增强。SERS enhancement factors include two proverbial theoretical mechanisms: long-range electromagnetic (EM) enhancement and short-range chemical enhancement (CE). On account of localized surface plasmon resonance (LSPR), the electromagnetic field on the surface of meta
11、l is magnified. The enhancement near fields is primarily preferred at small gaps between nanoparticles which are known as “hot spots”.13-15 The junctions among nanoparticles in the “hot spots” can maximize the localized electric field, thus amplifying the SERS signals of analytes.16 While CE is real
12、ized by transforming the scattering cross section of the molecules absorbed on the metal surface, which depends on the chemical properties of the analytes. Consequently, the enhancement of SERS signals is mainly due to EM enhancement.17, 18SRES 的增强基底一般为贵金属纳米粒子胶液，比如 Au、Ag 、Cu 等，但Cu 易氧化，Au、Ag 纳米材料更为常用
13、。多年来，人们一直致力于对纳米粒子的各项性能进行升级，希望能够得到稳定性好、重现性好且 SERS 信号强的优质基底，于是在单金属纳米粒子基底的基础上，诞生了双金属纳米粒子基底，它主要包括核壳结构和合金纳米粒子这两类粒子的胶液基底。例如，AuSiO 2纳米粒子是利用化学惰性材料包覆在金属内核表面，避免分析的对象吸附在金属内核上对 SERS 信号干扰 33；AuPd 纳米粒子则采用“借力”的方式使SERS 信号增强56 等。本实验主要采用的是金银核壳结构球形纳米粒子作为增强基底。与单一金属纳米粒子比起来，核壳结构纳米粒子兼具了两种金属纳米粒子各自的优点以及二者共同作用的效应，比如纳米粒子结构通过控
14、制核壳层厚度或者二者构成的比例来达到调谐其等离子体共振的效果，以此来提高 SERS 增强效应55 。本工作的优点费时,昂贵的,劳动密集型的,不适合现场监控。迫切需要开发一种快速、简单的方法实验部分2.1 化学试剂及仪器硝酸银(AgNO 3)，氯金酸(HAuCl 44H2O)，L-抗坏血酸(L-AA)和柠檬酸三钠(TC)是购自 Sigma-Aldrich 公司。偶氮甲酰胺是购自国药控股化学试剂(上海，中国)。氯化钠(NaCl)是来自江苏强盛化工有限公司，糖、牛奶、酵母、面粉是从当地超市购买。所有试剂都是分析纯级试剂，使用前未经纯化。760CRT 紫外可见分光光度计(上海精密科学仪器有限公司)。A
15、uAg 纳米粒子的形貌测量使用的是 JEOL JEM-2000 FX 透射电子显微镜(TEM)。使用的拉曼设备为便携式拉曼激光分析仪，激发光源采用二极管激光器，激发波长为785nm，功率为 300mW。2.2 SERS 基底的制备2.2.1 合成 Au 纳米粒子将 0.25ml 的 0.1M HAuCl4 加入 250ml 锥形瓶中，加入 100ml 的超纯水,然后在磁力搅拌下加热到沸腾，随后迅速加入 1.5ml1%的 TC，继续加热 30 分钟，直至酒红色。2.2.2 合成 AuAg 纳米粒子取 10ml 上述 Au 纳米粒子于 25ml 烧杯中，加入 1.5ml 0.1M L-AA，室温搅
16、拌，然后逐滴滴加 3.5ml 1mM AgNO3 到上述混合物，速度大约为每 30 秒一滴，AgNO3 被 L-AA 还原，还原得到的 Ag 纳米粒子在 Au 纳米粒子的表面不断地堆积形成核壳结构。当酒红色的溶液变成橙黄色之后，溶液继续搅拌 30 分钟从而得到 AuAg 纳米粒子。2.3 SERS 测定 ADA2.3.1 ADA 纯品的测定将 0.0116 g 的 ADA 溶解在 100 ml 的超纯水中，并微热，接着依次稀释为110-4 M，110 -5 M，110 -6 M 和 110-7 M。然后取 2ml 的 AuAg 纳米颗粒溶液以 9000 转/分离心 10 分钟，然后除去上清液，
17、取 4L 浓缩的底物与 4L 所制备的 ADA 溶液混合，然后滴加到铝箔纸上室温下挥发至干。拉曼光谱是使用便携式拉曼光谱仪收集。激发用激光是 785 nm，功率为 300mW，并且每次检测的采集时间为 3 秒。2.3.2 实际样品的测定将 2g 面粉和面粉制品分别加入到 100ml 的超纯水中，分别配成溶液。随后，将 0.0116 g ADA 分别加入到上述溶液，此时，加入 ADA 的面粉和面粉制品的浓度均为 1mM。用相应的面粉和面粉制品溶液依次稀释含有 ADA 的面粉和面粉制品溶液至一定浓度范围。然后将混合物超声处理 15 分钟。待 ADA 溶解在实际样品中，将 4L 所制备的混合物与 4
18、L 浓缩的 AuAg 基底混合滴到铝箔纸上，然后按照上述过程进行 SERS 检测。2.4 密度泛函理论（DFT）计算 ADA 的振动ADA 的振动计算是基于 BeckeLeeYangParr 非局部梯度校正方法，所用基组是 6-311G，简称为 B3LYP/6-311G。首先，ADA 的分子结构在 Gaussian03软件使用 B3LYP /6-311G 优化，然后对其振动模式进行了计算。3、结果与讨论3.1 AuAg 纳米粒子的紫外-可见吸收光谱图 1 是用紫外-可见光谱分别对 Au 纳米粒子和 AuAg 核壳纳米粒子进行表征。从图中可以看出 Au 纳米粒子的 SPR 峰在 530 nm 处
19、左右，随着 AgNO3的加入，AuAg 纳米粒子分别在 470 nm 左右和 380 nm 左右处形成了两个SPR 峰，表明了 AuAg 纳米粒子已经形成。3040506070800.0.20.40.60.8Absorance (.u) Wavelngth (m) Aug3.2 AuAg 纳米粒子透射电子显微镜的表征图 2 是 AuAg 纳米粒子的透射电子显微镜图，内插图为 AuAg 纳米粒子高分辨的透射电子显微镜图。从图中可以看出，AuAg 溶胶均匀分布且 Ag壳有选择的生长在 Au 核的外围。溶胶的粒径大约为 40 nm，Ag 壳的厚度大约为 7 nm。3.3 AuAg 纳米粒子的 SER
20、S 效应以 Rhodamine 6G（R6G ）为探针分子，使用不同浓度的 R6G 对新制的 AuAg纳米粒子基底进行表征，如图 3A 所示。从图中可以看出， R6G 的检测限为 10-9 M。将所制基底放置一周、两周后，使用 R6G 对其表征，并与新制的溶胶进行比较，以考察其稳定性。以浓度为 10-7 M R6G 作为探针分子，从图 3B 中可知，相比新制基底，放置一周与放置两周后所得的 R6G 的拉曼信号强度与新制溶胶相比稍有减弱，体现了所制备的溶胶具有较好的稳定性和重现性。7nm图 3.以 10-7为例表征稳定性一周及两周。 a 为新制的基底， b 为放置一周后， c 为放置两周后3.4
21、 便携式拉曼仪检测水溶液中的 ADA图 4 分别为 110-4 M ADA 的 SERS 图与 ADA 固体粉末的拉曼光谱图，可以看出两个谱图之间的确存在明显差异，这种差异可能是由于分析物与基底之间的电磁（如，局域表面等离子体共振）及化学（如，电荷转移共振）的相互作用。Intensity (a.u.)500 1 000 1 500Raman Shift (cm-1)RamanIntensity (a.u.)40 60 80 1 00 1 20 1 40 1 60 1 80 2 00Raman Shift (cm-1)abIntensity (a.u.)500 1 000 1 500 2 000
22、Raman Shift (cm-1)图 4.a 为 ADA 固体粉末的正常拉曼光谱混合的 SERS 谱， b 为 ADA 在 110-41M 浓度与AuAg 纳米粒子以 AuAg 溶胶作为基底，将 110-3 M，110 -4 M，110 -5 M，110 -6 M 和110-7 M ADA 分别与所制备的 AuAg 溶胶进行混合，如图 5 所示。从图中可以看出，随着浓度的降低，ADA 的特征峰也逐渐减弱。图中所标注的分别为ADA 的特征峰，ADA 的振动计算是基于 B3LYP/6-311G。如表一所示，837 cm-1 处为 N-H 的弯曲振动， 957 cm-1 处为 C-N=N 的弯曲振
23、动和 C-N 的伸缩振动，1027 cm-1 处为 H-N-H 的弯曲振动、C=O 的伸缩振动和 C-N 的伸缩振动，1320 cm-1 处为 H-N-H 的弯曲振动、C-N 的伸缩振动和 N-C=O 的弯曲振动，1599 cm-1 处为 N=N 的伸缩振动， 1728 cm-1 处为 C=O 的伸缩振动和 C-N 的伸缩振动。图 5.ADA 纯品浓度梯度拉曼 SERS 谱图。拉曼位置(cm -1) 特征峰837 N-H957 C-N=N+C-NRamanIntensity (a.u.)400 600 800 1 000 1 200 1 400 1 600 1 800 2 000Raman S
24、hift (cm-1)15981028837 955 1320110-3 M110-4 M110-5 M110-6 M110-7 MBlank1027 H-N-H+C=O+C-N1320 H-N-H+C-N+N-C=O1599 N=N1728 C=O+C-N表 1.ADA 纯品在拉曼 SERS 谱图中的特征峰位置及对应振动如图 5 所示，1027 cm -1 处的峰具有较好的灵敏性和重现性，因此，以 1027 cm-1处的峰为特征峰，考察 10-4 M 到 10-3 M 范围的线性，以不同浓度 SERS 图中1027 cm-1 处的峰强度对浓度作曲线，如图 6 所示，可以看出，强度和浓度之间具
25、有较好的相关性，相关系数为 0.997，且每个浓度均选择 5 个点来做误差棒。因此，可以以 1027 cm-1 处的峰来进行实际样品的定量检测。图 7 为含有不同浓度 ADA 的面粉的 SERS 谱图。从图中可以看出随着浓度的降低峰强度相应减弱，相比于空白对照，110-5 M 时峰位置仍能明显看出，可知此法对于实际面粉样品的检出限为 110-5 M。In addition, starch, the main ingredient of flour, is insoluble in room temperature. When heating it to 53 C above, the physical properties of the starch turn to change obviously. Therefore, pasting of starch makes the flour denature. Based on those reasons, detection of the real samples was conducted under room temperature to avoid the side effect due to temperature.0.20.40.60.81.02024062803203460Ramn ItesiymMR2=0.97
