1、第一章 重组 DNA 技术 1.寄主的限制和修饰现象 ： 细菌能将外来的 DNA 片段某些专一 位点上切断，从而保证其不为 外来噬菌体所感染，而其自身的染色体 DNA 由于 被一种特殊的酶所修饰而得 以 保护，这种现象叫做 主的限制和修饰现象 2.1 限制性核酸内切酶 类酶特点： 识别位点严格专一，并在识别位点内将 DNA 链切断 2.2 类限制性核酸内切酶命名： 属名一个字母（ 大写） +种名两个字母（小写） +株名等 +发现顺序（罗马字母） 2.3 限制性核酸内切酶的星号活性： 高浓度的酶、高浓度的甘油、低离子强度、极端 pH 值等，会使一些限制性核酸内 切酶的切割序列发生低特异性，这种性
2、质称为限制性核酸内切酶的星号活性 （限制性内切酶在含 50%甘油 的缓冲液中，于 -20 稳定保存 ） 2.4 部分酶切： 部分酶切是指，只对片段上一部分酶切位点产生切割。这种一般是在建库，或者需要酶切基因组后，获得一定大小范围内的片段而使用的酶切方法。这种酶切不要求获得某一大小的片段，而是要获得例如 200-500bp 的片段，在电泳上没有条带，而是 smear。所以部分酶切需要严格控制酶的用量和时间，要尝试稀释后的酶液，切一定时间段内，哪一个条件可以获得目标范围的片段。部分酶切的条件需要更 多的摸索，而且重复性要求也会更高。 2.5 同尾酶： 识别位点不同但切出的 DNA 片段具有相同的末
3、端序列 2.6 同裂酶： 来源不同，识别序列相同，切割位点可以相同（同序同切酶）也可以不同（同序异切酶） ，存在位点偏爱现象。 3.1 甲基化酶： 许多 类限制性核酸内切酶都相应存在着相对的甲基化酶，它们可修饰限制性核酸内切酶识别序列中某位碱基甲基化，从而使 DNA 免受相应的限制性核酸内切酶的切割。 用途：就是在必要时可以封闭某一限制性核算内切酶的切口。 命名：在对应的限制性内切酶名字前面加 M 甲基化对限制性核算内切酶的 影响： 1.修饰酶切位点 2.产生新的酶切位点 3.2 T4-DNA 连接酶： 在实验中绝大多数情况下使用的是 T4-DNA 连接酶，具有粘性末端和平末端。目前商品化的
4、T4-DNA 连接酶是由大肠杆菌基因工程菌生产 DNA 连接酶 ：借助 ATP 或 NAD+水解提供的能量催化 DNA 中相邻的 3 -OH和 5 -P 之间形成的磷酸二酯键 3.3 S1 核酸酶 ： 来源于米曲霉菌，其特征如下： 1.降解单链 DNA or RNA，降解 DNA 的速度大于降解 RNA 的速度 2.降解发生的方式为内切和外切，产生带 5 磷酸的单核苷酸或寡核苷酸 3.酶切 活性需要 pH4.0-4.5 的酸性环境，且为 Zn2+所激活 4.酶量小时仅切割带缺口或缺刻的双链 DNA 5.酶量过大时会降解双链核酸，因为双链降解活性比单链低 7.5 万倍 S1 核酸酶常用来切平突出
5、的单恋末端 3.4 DNA 聚合酶 ： 5 -3 聚合酶活性 聚合作用 3 -5 外切酶活性 校对作用 5 -3 外切酶活性 切除修复作用 （切口平移） Klenow 酶： 是大肠杆菌 DNA 聚合酶的氨基大片段，没有 5 -3 外切酶活性，基因工程中常用该酶填平 5 突出的粘性末端 3.5 末端脱氢核苷酸转移酶（ TdT） ： 不需要模版只需要带 3 羟基末端引物的 DNA 聚合酶，在二价阳离子的作用下，催化 DNA 的聚合作用，产生同源 3 末端 3.6 碱性磷酸单酯酶： 能将 DNA、 RNA链及核苷酸的 5 端磷酸基团切除。 4.1 载体 ： 指运载外源 DNA 有效进入受体细胞内的工
6、具，载体同外源 DNA 在体外重组成 DNA重组分子，在进入受体后形成一个复制子，即形成在细胞内能独立进行自我复制的遗传因子 4.2 载体应具备的条件： 1.具有独立复制的能力，有复制起点 2.具有合适的限制性内切酶位点 3.具有合适的选择标记基因 ，用来筛选重组体 DNA 4.能接 纳尽可能大的外源 DNA 片段，具有较高的外源 DNA 的装载能力 4.3 拷贝数 ：一种质粒在一个细胞中存在的数目 4.4 多克隆位点 ：许多限制酶的切点 5.质粒的基本特征： 自主复制性、可扩增性、不相容性、可转移性、携带标记基因 严紧型复制： 除了受本身的复制机制的控制外，还受染色体的严紧控制。 质粒的复制
7、是同宿主细胞的复制偶联同步的 在每个细胞中的质粒只有一份拷贝，或最多只有几份拷贝 松弛型复制： 只受本身的遗传结构的控制，而不受染色体复制机制的约束 宿主细胞不合成蛋白质时，松弛型质粒仍继续进行复制，每个宿主细胞 中通常具有较高的拷贝数（ 10 个以上 ） 在增殖松弛型质粒时，总是要让宿主菌经氯霉素处理抑制蛋白质的合成 不相容性： 两种质粒不能共存于同一受体细胞内 6.1 DNA 载体及类型 载体的构建：缩短长度删除重复的酶切口加装选择标记构建琥珀型密码子的突变体 载体类型：插入型取代型 6.2 DNA 包装和限制 包装蛋白在宿主细胞内合成，包装蛋白首先结合在 cos 区的附近，形成包装启动复
8、合物，因此 cos 区对包装至关重要 包装时由一个蛋白因子将 cos 区交错切开，从而保证只有一个 DNA 线状分子被包装在一个噬菌体内， 每个宿主细胞可包装多达 100 个成熟的 DNA 分子 包装对 DNA 本身的性质无关，但对其大小要求比较严格，它只能包装 DNA 分子的75%-105%， DNA 全长 48.5kb， 也就是说可以 包装 36.4kb-50.9kb 范围内的 DNA 包装好了的 DNA 便形成具有感染力的成熟的噬菌体颗粒 7.考斯质粒及其特点 含有 DNA 两端 cos 区的质粒 由于 DNA 在包装时，其包装蛋白只识别其粘性末端附近的一小段序列（ cos 区） 将这一
9、小片段 DNA 与质粒连在一起，则这个重组质粒就可装载 更大的外源 DNA 片段（ 45.9kb） ，同时它仍可像 DNA 一样在 体外 被包装成具有感染活性的噬菌体颗粒，并高效感染大肠杆菌 不能在体内被包装，更不能裂解细胞，其制备与质粒相同 进入细胞后，完全依靠质粒上的复制子进行复制 携带质粒的选择标记，便于筛选 含有多种单一酶切位点，便于克隆 8.DNA 片段的连接 定向克隆；外源 DNA 片段定向插入载体分子 粘性末端：（不同粘性末端的连接） 1. 突出末端相同（ 5 突出） ： 用 Klenow酶 补平 或 S1核酸酶切平 ， 之后 再用 T4DNA连接酶 连接 2. 突出末端 相同（
10、 3 突出 ） ： 用 T4DNA 聚合酶 切平，之后再用 T4DNA 连接酶连接 。 3. 突出末端不同：用 Klenow 酶补平 或 S1 核酸酶切平， 之后 再用 T4DNA 连接酶连接 平末端：属于分子内的连接，反应速度要比粘性末端的连接慢得多 添加同聚尾末端 方向：用 Klenow 补平或者 用同聚结尾法都是从 5 -3 ，切 5 突出用 S1 核酸酶，切 3突出用 T4DNA 聚合酶 9.提高重组率的方法： （ 1） 提高外源 DNA 片段与载体的分子比 （ 2） 载体分子在连接前先除磷 （ 3） 用 TdT 加装人工粘性末端 10.1 转化子： 将质粒为载体构建的重组 DNA 导
11、入受体细胞的过程称为转化。 转化后的受体菌，称转化子 10.2 重组子： 含有重组 DNA分子的转化细胞 10.3 转化率 ： 产生菌落的总数 /DNA 的加入量 。 定义 ： 每 微克 载体 DNA 在 最佳转化条件下进入受体细胞的分子数 11.感受态细胞： 受体细胞处于摄入外源 DNA 的状态 12.1 转化 ：将质粒为载体构建的重组 DNA 导入受体细胞的过程 12.2 转染： 将噬菌体（病毒） DNA导入受体细胞的过程 12.3 转导： 以噬菌体颗粒为媒介转移 DNA的过程 13.1 抗菌性筛选法 （ ex 环丝氨酸筛选） 最常见的载体携带的标志是抗药性标志 ，如抗氨苄青霉素（ Amp
12、r） 、抗四环素（ Tetr）、抗卡那霉素（ kanr）等 当培养基中含有抗生素是，只有携带相应抗药性基因载体的细胞才能生存繁殖 如果外源目的序列是插入在载体的抗药性基因中间使这抗药性基因失活，这个抗药性标志就会消失 13.2 显色模型筛选法（蓝白斑实验） 物体分子上携带某种显色酶基因，其表达产物能使细胞产生颜色反应，从而易于辨认和挑选 可以区分转化子和非转化子，也可区分重组子和非重组子 14 目的基因获取方法： 基因组文库、 cDNA 文库、人工合成、 PCR扩增提取等 15.1 基因组文库： 从生物组织细胞提取出全部 DNA，将 DNA 降解成预期大小的片段，然后将这些片段与适当的载体连接
13、，转入受体细菌或细胞，这样每一个细胞接受了含有一个基因组DNA 片段与载体连接的重组 DNA 分子，而且可以繁殖扩增，许多细胞一起组成一个含有基因组各 DNA 片段克隆的集合体，就称为基因组 DNA 文库 15.2 cDNA 文库： 提取出组织细胞的全部 mRNA，在体外反转录成 cDNA，与适当的载体连接后 转化受体菌，则每个细菌含有一段 cDNA，并能繁殖扩增，这样包含着细胞全部 mRNA 信息的 cDNA 克隆集合称为该组织细胞的 cDNA 文库。 cDNA 文库具有组织细胞特 异性 15.3 cDNA 合成 （第二链的合成）： （ 1）自身引导法：由于尚不完全清楚的原因，单链 cDNA
14、 的 3 端 会自发形成发卡结构。此法所得的 cDNA 在其 5 端有几对碱基的缺失 （ 2）置换合成法： 该方法利用第一链在反转录酶作用下产生的 cDNA:mRNA 杂交链不用碱变性 ,而是在 dNTP 存在下 ,利用 RNA 酶 H 在杂交链的 mRNA 链上造成切口和缺口。从而产生一系列 RNA 引物 ,使之成为合成第二链的引物 ,在大肠杆菌 DNA 聚合酶的作用下合成第二链。此法所得的 cDNA 在其 5 端也有几对碱基缺失。 （ 3）引导合成法：首先制备 一端带有 Poly（ dG）的片段 和带有 Poly（ dT）的载体片段，并用片段来代替 Oligo（ dT）进行 cDNA 第一
15、链的合成，在第一链 cDNA 合成后直接采用末端转移酶（ TdT）在第一链 cDNA 的 3-端加上一段 Poly（ dC）的尾巴，同时进行酶切创造出另一端的粘端，与片段 一起形成环化体，这种环化了的杂合双链在 RNA 酶 H 、大肠杆菌 DNA 聚合酶 和 DNA 连接酶的作用下合成与载体联系在一起的双链 cDNA。此法所得的 cDNA 保留了完整的 5 端序列。 第二章 PCR 1.PCR 反应体系主要由什么构成的？作用？ PCR 反应体系： 核酸模版、引物、 DNA 聚合酶、 dNTP、 Mg2+、缓冲液 核酸模版：可以以 DNA 或 RNA 为模版对靶序列进行 PCR 扩增 引物：互补
16、于单链 DNA 片段的一小段寡核苷酸。 PCR 产物的特异性由一对上下游引物所决定 dNTP：四种浓度应相同。 dNTP 能与 Mg2+结合，使游离的 Mg2+浓度降低 TaqDNA 聚合酶：可在高温下仍具有活性。 TaqDNA 聚合酶具有 5 -3 外切酶活性，但不具有 3 -5 外切酶活性 ，因而在合成中对某些单核苷酸错配没有校正功能。 Taq 聚合酶同时具有类似于末端转移酶的功能 Mg2+：是 TaqDNA 聚合酶活性所必须的，也影响着引物的退火、模板与 PCR 产物的解链温度、产物的特异性、引物二聚体的形成等 缓冲液：有利于引物退火 2.PCR 产物的特点 ： 3 都有一个 A突出 2
17、.PCR 技术的特点： 敏感性高、特异性强、操作简便快速、可扩增 RNA 或 cDNA、对起始材料质量要求低、应用范围广 3.设计 PCR引物 时一般要注意哪几个方面： （ 3 比 5 重要） 引物长度：不宜太长或太短 引物扩增跨度： 以 200-500bp 为宜 引物碱基 G+C 含量：以 40%-60%为宜 碱基分布：最好随机分布，避免嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列 引物自身和引物之间不应存在互补序列 ：避免引物内部出现二级结构 引物 3 端的碱基：特别是最末及倒数第二个碱基，应严格要求配对，以避免因末端碱基不配对而导致 PCR 失败 引物的 5 端不严格，可以修饰 引物的特异性：引物应与核苷
18、酸序列数据库的其他序列无明显同源性 引物量应适中 ，过高引起错配和非特异性扩增；过低引起产物量降低 4.PCR 循环温度参数的含义及设定 PCR 反应的每一个温度循环周期都是由 DNA 变性、引物退火和反应延伸三个 步骤组成的。如某设定的反应参数是 94变性一分钟， 60退火（低于扩增引物在 PCR条件下真是 Tm值 5）1min， 72延伸 1.5min。 第三章 原材料的选择和处理 1.原材料预处理的目的： 防止有效成分降解失活、后续操作的要求、便于储存和运输 2.1 发酵液 预处理的目的： 改变发酵液的 物理 性质 ， 以利于固液分离 去除发酵液中部分 杂质 ，以利于后续各步操作 2.2
19、 发酵液预处理的主要方法： 凝聚和絮凝、稀释、加热、调 ph、加沉淀剂等 凝聚：在电解质作用下，发酵液中的胶体脱稳并使粒子相互聚集成 1mm 大小的凝聚 体的过程，由于双电层排斥电位的降低，胶体表面水化层破坏或变薄，而使胶体体系不稳定的现象 絮凝：在某些高分子絮凝剂 存在下，基于架桥作用，使胶粒形成粗大的絮凝团的过程，是一种以物理的集合为主的过程 3细胞破碎有哪些方法？基本原理 机械法： 高压匀浆法：利用高压使细胞悬浮液通过针型阀，由于 突然减压 和 高速撞击 使细胞破裂 高速珠磨法：进入珠磨机的细胞悬液与 极细的玻璃小珠、石英砂、氧化铝 等研磨剂一起快速搅拌或研磨，研磨剂、珠子与细胞之间的相
20、互剪切、碰撞，使细胞破碎，释放出内含物 超声波破碎法：由于超声波的 空穴作用 （ 在超声波作用下，气泡 形成、长大和破碎，在气泡破碎期间，大量声能转化成机械能，引起局部的剪切使细胞破碎 ）引起的冲击力和剪切力使细胞破碎 组织捣碎法：使用高速组织捣碎机，是一种激烈的破碎器。这种绞切力对动植物组织有效 研磨法：可以利用研钵和研杵进行研磨 非机械法： 化学法 ：化学渗透法取决于化学试剂的类型以及细胞壁膜的结构与组成 有机溶剂：用脂溶性的溶剂（如丙酮、氯仿、甲苯等）处理细胞时，可把细胞壁、细胞膜的结构部分溶解，使细胞结构破坏，而将胞内物质释放出来 表面活性剂：表面活性剂是两性化合物，分子中有一个亲 水
21、基团和一个疏水基团，在适当的 ph 值和离子强度下，它们凝聚在一起形成微胶束，疏水基团聚集在胶束内部将溶解的脂蛋白包在中心，而亲水集团则向外层，这样使膜或壁的通透性改变或使之溶解，表面活性剂方法特别适合于膜结合蛋白酶的溶解 物理法 ：主要通过各种物理因素使组织细胞破碎的方法 渗透法：将细胞放在高渗透压的介质中，达平衡后，转入到低渗透压的缓冲液或纯水中，由于渗透压的突然变化，水迅速进入细胞内，引起细胞快速膨胀而破碎，使细胞内容物释放到溶液中 反复冻融法 ：将细胞放在低温下突然冷冻而在室温下缓慢融化，反复多次达到 破壁作用。由于冷冻，一方面使细胞膜的疏水键结构破裂，从而增加细胞的亲水性能，另一方面
22、胞内水形成的冰晶粒，使细胞内外溶液浓度发生变化，引起细胞膨胀而破裂 酶溶法 ：利用酶反应，分解破坏细胞壁上的特殊键，从而达到破壁的目的 4.蛋白质和酶水溶液提取影响因素： 离子强度：低离子强度溶液除了增加许多生化物质的溶解度外，还对一些物质生理活性有稳定作用，所以稀盐溶液常用于大多数生化物质的提取（盐溶和盐析现象） PH 值：一般选择的 ph 值应在偏离被提取的蛋白质等电点的稳定区内。通常碱性蛋白质选择偏酸的一侧，酸性蛋白质选在偏 碱的一侧，以增大蛋白质的溶解度。尽量避免过酸，过碱，一般控制在 Ph6-8 范围 温度： 蛋白质和酶一般都不耐热，提取时通常要求低温操作 搅拌：搅拌能促使溶质与提取
23、液的接触，并能增加溶解度，一般采用温和的搅拌方法，太快易产生泡沫是某些蛋白质和酶变性失活 5.1 包含体 ：很多利用大肠杆菌为宿主细胞的外源基因表达产物不仅不能分泌到细胞外，反而在细胞内聚集成没有生物活性的直径约为 0.1-1 微米的固体颗粒 包含体（过度表达产生的） 。包含体主要由蛋白质构成，其中大部分是基因表达产物 5.2 包含体提取的一般操作步骤和方法： 收集细胞裂解细胞回收包含体洗涤包含体溶解包含体蛋白质复性蛋白质纯化 收集包含体： 破碎含包含体的宿主细胞，通常使用机械破碎法，如高压均浆法、超声波破碎法、超声波结合溶菌酶破碎法等。 离心收集包含体 。 洗涤包含体：为了出去包含体上粘附的
24、杂质，如膜蛋白、核酸、脂质等。 洗涤剂通常 是含去污剂 TritonX-100、脱氧胆酸盐、低浓度的变性剂尿素、盐酸胍等的缓冲液 溶解包含体： 一般采用强的变性剂：常用盐酸胍浓度 5-6mol/L、尿素 6-8mol/L。 加入还原剂，打开错配的二硫键：二硫苏糖 醇、 2-巯基乙醇、半胱氨酸等。 加入金属螯合剂如 EDTA 等，防止已处于还原状态的巯基与金属离子发生反应。 蛋白质复性：通过 稀释法 把变性溶解的蛋白质直接加入到复性液中，通过 透析或凝胶过滤 法完全去掉变性剂和还原剂。 第四章 萃取技术 1.1 分配定律 ： 在一定温度，一定压力的条件下，溶质分配在两个互不相溶的溶剂中，达到平衡
25、时溶质在两相中的活度之比为一常数，如果是稀溶液，活度可以用浓度代替 1.2 分配系数 ： 分配定律中的常数被称为分配系数 K=萃取相浓度 /萃余项浓度。 K 越大，则在萃取相中溶质的溶解度越大 1.3 分离因素 ： 表示目的产物与杂质的分离效果，可用分离因素表示。 值定义为产物与杂质分配系数之比。分离因素体现了不同溶质分配系数的差异，是实现萃取分离的基础，决定了两种溶质是否能分离 2.溶剂萃取的影响因素： pH 值： 水相 ph 值影响弱电解质分配系数 溶质在不同 ph 下有着不同的解离状态，在水中或有机溶剂中便有不同溶解度 离子状态的物质易溶于水，非解离的分子状态易溶于有机溶剂 酸性物质处于
26、低 ph 值，碱性物质处于高 ph 值 时为分子状态，转溶于有机溶剂 温度： 温度印象溶质分配系数和萃取速度 萃取操作一 般在常温或较低温度下进行 离子强度： 无机盐的存在可降低溶质在水相中的溶解度，有利于溶质向有机相中分配 无机盐的加入还能减少有机溶剂在水相中的溶解度 无机盐用量要适量，用量过多也有可能促使杂质一起转入溶剂相 3.1 双水相体系： 将两种不同水溶性聚合物的水溶液混合时，当聚合物浓度达到一定值时，体系会自然地分成互不相溶的两相，两相中均含有水分，构成双水相体系 3.2 双水相体系形成的原理 由于高聚物之间的不相溶性：高聚物分子空间的阻碍作用，使其无法相互渗透，不能形成均一相，从
27、而产生相互分离的倾向。当两者浓 度达到一定时即可分成两相 某些聚合物溶液和一些无机盐溶液相混时，在一定浓度下，由于盐析作用，也会形成两相 3.3 相分离速度影响： 相分离速度直接取决于相密度差，两相密度差越大，相分离速度越快 靠近临界点的相间密度差较小，因此相的分离速度较慢 远离临界点的聚合物浓度高，聚合物富相的粘度会增加也会导致低的分离速度 在中间组成时，分离速度最佳 4.1 超临界流体 ：液体和压力超过超临界温度和临界压力，介于气体和液体之间的液体。 4.2 超临界流体的特性： 低粘度，高密度，扩散系数大等特性 4.3 超临界流体萃取 ： 等温法：依靠压力变化的萃取分离方法 在一定温度下，
28、使超临界流体和溶质减压，经膨胀后分离，溶质由分离器下部取出，气体经压缩机返回萃取器循环使用 等压法：依靠温度变化的萃取分离法 经加热、升温使气体和溶质分离，从分离器下部取出萃取物，气体经冷却、压缩后返回萃取器循环使用 吸附法：用吸附剂进行的萃取分离法 在分离器中，经萃取出的溶质被吸附剂吸附，气体经压缩后返回萃取器循环使用 第五章 沉淀法 1.1 盐析原理 ： 向蛋白质溶液中加入高浓度的中性盐，以破坏蛋白质的胶体性质，使蛋白质的溶解度降低而从溶液中析出的 现象称为盐析。溶液中的盐离子与蛋白质分子争夺水分子，减弱了蛋白质的水合程度（失去水化膜），暴露出疏水区域，使蛋白质的溶解度降低。盐离子所带电荷
29、部分地中和蛋白质分子上的电荷，蛋白质表面的双电层厚度降低，使蛋白质分子之间静电排斥作用减弱，也促使蛋白质沉淀。 1.2 盐析公式和各参数的意义以及影响因素： 盐析公式： lgS= -KSI S 为溶解度 为假设离子强度等于 0 时蛋白质的溶解度的对数值，它可由直线延长与纵轴交点的截距求得 。其不但与 蛋白质的性质和盐的种类 有关，而且还与 溶液的 ph 值和温度 有关，在高离子强度的溶液中 ，温度升高一般使 值下降，即蛋白质的溶解度下降。 KS为盐析常数，它等于直线的斜率 。它与溶液的 ph 和温度无关，只依赖于蛋白质的性质和盐的种类。 I 为离子强度 2.盐析方法： Ks 盐析：固定蛋白质溶
30、液的 ph 值和温度，改变盐的浓度（即离子强度）以达到沉淀的目的，常用于蛋白质的粗品分级沉淀，如酶制剂的制备等 盐析：在一定的离子强度下，改变溶液的 ph 值或温度以达到沉淀的目的。 盐析常用于蛋白质的进一步分离纯化，如蛋白质、酶在饱和硫酸铵溶液中保温结晶等 3.沉淀曲线及影响因素： 沉淀曲线：在溶解度曲线中，以曲线 的斜率对硫酸铵溶液的饱和度作图，由于这种沉淀作用的起始很迅速，以后逐渐变慢，形成了一条前沿陡峭，后沿比较平坦的蛋白质沉淀的分布曲线。 影响因素：蛋白质沉淀分布曲线的峰宽，由盐析公式中的 Ks 决定，而峰在横轴上的位置是由值和蛋白质的浓度决定的 ，所以说 其不但与 蛋白质的性质和盐
31、的种类 有关，而且还与 溶液的 ph 值和温度 有关。 4.1 常用盐的选用：硫酸铵是最普遍使用的盐析剂 无机盐的挑选原则： 较高的盐析效能 高溶解度，能配制高离子强度的盐溶液 溶解度受温度的影响小 盐溶液的密度不高 便于蛋白质沉淀和离心分 离 不易引起蛋白质的变性 价格低廉 4.2 加入方式： 加入固体盐法 饱和溶液法 ：可加入预先配制好的硫酸铵饱和溶液 透析盐析 ：将蛋白质溶液盛于透析袋，放入一定浓度的盐溶液中，由于渗透压的作用，使蛋白质溶液中盐浓度发生连续性的变化，也会产生蛋白质的沉淀作用 反抽提法 4.3 盐析后脱盐方法： 渗透法 /超滤法、凝胶过滤法 5.1 有机溶剂沉淀原理： 有机
32、溶剂的加入会使溶液的介电常数减小，导致溶剂的极性减小 水溶液有机溶剂本身的水合作用降低了自由水的浓度，压缩了亲水溶质分子表面原有水化层的厚度 有机溶剂 可能破坏蛋白质的某些键如氢键等，使其空间结构发生某种变化，致使一些原来包在内部的疏水基团暴露于表面并与有机溶剂的疏水基团结合形成疏水层，从而使蛋白质沉淀 当蛋白质的空间结构发生变形超过一定程度时，便会导致完全的变性 5.2 影响因素： 温度：多数蛋白质在有机溶剂与水的混合液中，溶解度随温度降低而下降 ph 值：一般在等电点时，溶解度最低 蛋白质浓度：样品较稀时，将增加溶剂投入量，降低了溶质收率，容易产生稀释变性，但共沉作用小，浓的样品会增强共沉
33、作用，降低分辨率，但减少了溶剂用量，提高了回收率，且样品变性 小于稀溶液 离子强度：中性盐存在会增加蛋白质在有机溶剂中的溶解度，溶液中含有适量的低的离子强度，对酶或蛋白质具有保护作用，可防止变性，但加入量太多，影响分级作用 多价阳离子的影响 6.介电常数和溶剂极性的关系： 介电常数越小，溶剂极性越小 第六章 膜分离 1.1 膜分离： 利用具有一定选择透过特性的介质在推动力作用下进行物质的分离纯化 1.2 各类膜分离技术的原理 ： 以浓度差为推动力的过程 A、 渗透 ：当把溶液和溶剂分别置于此膜的两侧时，纯溶剂将自然穿过半透膜而自发地向溶液（或从低浓度向高浓度）一侧流动 B、 透析：借 助膜的扩
34、散使各种溶质得以分离的过程，与渗透的区别：膜不同。 以压力差为推动力的过程 A、 反渗透：在溶液的液面上施加一个大于渗透压的压力 P 时，溶剂将于原来的渗透方向相反，开始从溶液向溶剂一侧流动，这就是反渗透 B、 超滤：通过膜的筛分作用将溶液中大于膜孔的大分子溶质截留，使这些溶质与溶剂小分子组成分离的膜过程 C、 纳滤：纳滤膜的孔径为纳米级，介于反渗透膜和超滤膜之间，能截留透过超滤膜的那部分小分子量的有机物，透过被反渗透膜所截留的无机盐 D、 微孔过滤：利用膜的筛分性质，以压差为传递推动力进行分离的膜过程 以电场力为推动力的过程 A、 电渗析：在透析的基础上加上直流电，极大加快离子的透析速度。膜
35、分离过程中，离子在电势的驱动下，通过选择性渗透膜，从一种溶液向另一种溶液迁移 2.1 分离膜的形态结构 一是分不分层及各层的厚度，二是每一层内孔的形态及多少。可分为对称膜（均质膜）和不对称膜（主要由起膜分离作用的表面活性层和起支撑强化作用的惰性层构成） 2.2 孔道结构： 包括孔径、孔径分布和孔隙度 孔径分布是指膜中一定大小的孔的体积占整个孔体积的百分数，孔隙度是指整个膜中孔所占的体积百分数，孔径分布窄的膜比孔径分布宽的膜要好 3.1 截留率： 表征膜 对溶质的截留能力，如果膜能完全截留溶质， R=1,弱国溶质可自由透过，则 R=0 3.2 截留分子量： 指能被膜截留住的最小溶质分子质量 4.
36、1 膜污染： 由于在膜表面上形成了附着层或膜孔堵塞等外部因素，导致膜性能变化，它不仅使膜的透水率降低，而且使其截留分子变小 4.2 膜劣化： 膜自身发生了不可逆转的变化等内部因素导致膜性能变化 5.1 浓差极化： 在膜分离操作中，所有溶质均被透过液传送到膜表面上，不能完全透过膜的溶质受到膜的截留作用，在膜表面附近浓度升高，这种在膜表面附近浓度高于主体浓度的现象称为浓度极化或浓差极化 5.2 减小浓差极化的方法 ： 采用切向流过滤法使被处理溶液平行于滤膜表面流动，与滤过方向垂直（相切），溶液在压力的作用下滤过，可有效地破坏浓差极化的形成条件 采用湍流，可加快料液流速，大大减少浓差极化对透水率的影
37、响 降低料液粘度等 第七章 层析技术 1.凝胶层析的原理 ： 利用有一定孔径范围的多孔凝胶作为固定相，对混合物中各组分按分子大小进行分离的层析技术 2.1 Kd 参数及大小的意义： 分配系数 Kd 是衡量溶质被排阻程度的一个特征性常数： Kd=（ Ve-Vo） /Vi Ve：洗脱体积 Vo：外水体积 Vi： 内水体积 Kd=0 表示全排阻， Kd=1 表示全通过，一般来说 0 Kd 1 2.2 床体积、内水体积、外水体积、洗脱体积 床体积 Vt：凝胶装柱后，从柱的底板到凝胶沉积表面的体积 外水体积 Vo：层析柱内凝胶颗粒之间的空隙 内水体积 Vi：凝胶为三维网状结构，颗粒内部仍有空间，液体可进入颗粒内部，这部分间隙的总和称为内水体积，不包含固体支持物体积 Vg 洗脱体积 Ve：指被分离物质通过凝胶柱所需洗脱液的体积 3.1 组别分离： 如果实验目的是将样品中大分子物质和小分子物质分开，由于他们在分配系数上有显著差异，这种分离又称组别 分离 3.2 分级分离： 如果实验目的是将样品中一些分子量比较近似的物质进行分离，这种分离又叫分级分离 4.Sephadex G 类凝胶及代号的意义 葡聚糖凝胶的商品名为 Sephadex，它是由葡聚糖加入交联剂环氧丙烷通过醚键相互交联聚合而成的，其网孔大小可通过调节交联剂和葡萄糖的比例以及反应条件来控制。不同规格型
