1、科学学位硕士学位论文 单位代码： 分类号： 学 号： 密 级： SDF-1/CXCR4 对兔多器官功能不全综合征 骨髓间充质干细胞移植的迁移作用 院（系）、所 ： 昆明医科大学 第四附属医院 研究生姓名： 学科、 专业： 麻 醉 学 学 位 类 型： 科 学 学 位 指 导 老 师： 年 月 目 录 中英文缩略词表 . 1 中文摘要 . 2 英文摘要 . 4 1 前言 . 6 1.1“ 二次打击”学说与 MODS 模型的建立 . 6 1.2 骨髓间充质干细胞的特性及临床应用 . 7 1.3 SDF-1/CXCR4 与多器官功能障碍综合症（ MODS） . 8 2 实验方法 .10 2.1 实验
2、材料 . 10 2.1.1 试验试剂与材料 . 11 2.1.2 实验仪器 . 12 2.1.3 主要试剂的配置方法 . 14 2.2 实验方法 . 15 2.2.1 实验动物及分组 . 15 2.2.2.1 失血性休克 . 17 2.2.2.2 失血性休克和复苏再灌注 . 18 2.2.2.3 内毒素血症 . 18 2.2.2.4 观察指标 . 18 2.2.2.5 MODS 动物模型诊断标准 . 18 2.2.3 骨髓间充质干细胞的分离培养 . 19 2.2.3.1 骨髓间充质干细胞的分离 . 19 2.2.3.2 骨髓间充质干细胞的培养 . 19 2.2.3.3 细胞表面分子测定 . 2
3、0 2.2.3.4 细胞的转基因标记 . 20 2.2.4 移植后观察项目及指标 . 22 2.2.4.1 常规观测指标与检测 . 22 2.2.4.2 移植后脏器病理组织学检测 . 22 2.2.4.3 移植后免疫荧光组织化学检测 . 23 2.3 统计学处理 .24 3 结果 . 25 3.1 动物模型检测 . 25 3.1.1 动物一般情况 . 25 3.1.2 动物各项指 标检测 . 25 3.1.3 MODS 的发生率及死亡率 . 27 3.2 细胞形态学、抗原表达分析及荧光标记 . 27 3.2 1 原代培养 . 27 3.2.2 传代培养 . 28 3.2.3 兔 MSC 表面抗
4、原分析 . 28 3.2.4 MSC 的 GFP 标记 . 29 3.3 组织病理切片检测 . 31 3.4 组织中 BMSC-GFP 检测 . 34 3.5 MSC 移植后的指标检测 . 35 3.6 免疫荧光化学检测 . 39 4 讨论 . 41 4.1 MODS 模型的建立 . 41 4.2 骨髓间充质干细胞的分离、培养及荧光标记 . 42 4.3 骨髓间充质干细胞 的移植对 MODS 兔的治疗评价及归巢的分析 . 43 全文小结 . 47 参考文献 . 48 综述 . 52 在读期间文章发表情况 . 61 致谢 .62 昆明 医科大学硕士研究生论文 1 中英文缩略词表 EP Expre
5、ssion plasmid 表达质粒 FC Flow Cytometry 流式细胞仪 GFP green fluorescent protein 绿色荧光蛋白 HE Hematoxylin-eosin stanining 苏木精 -伊红染色 LCM Laser confocal microscope 激光共聚焦显微镜 MSC rabbit mesenchymal stem cells 骨髓间充质干细胞 MODS multiple organ dysfunction syndrome 多器官功能不全综合征 PP Packaging plasmid 包装质粒 PBS Phosphate balan
6、ced solution 磷酸盐缓冲液 SDF-1 Stromal cell-derived factor-1 基质细胞衍生因子 -1 昆明 医科大学硕士研究生论文 2 SDF-1/CXCR4 对兔多器官功能不全综合征 骨髓间充质干细胞移植的迁移作用 中文摘要 目的 ： 将绿色荧光蛋白 (green fluorescent protein， GFP)标记的兔骨髓间充质干细胞(rabbit mesenchymal stem cells, MSC)，经耳缘静脉移植至多器官功能不全综合征(multiple organ dysfunction syndrome， MODS)模型兔，检测 细胞 移植对
7、MODS 兔受累器官组织再生修复的影响以及下调基质细胞衍生因子（ SDF-1）对干细胞迁移、归巢的作用，探讨 MSC 应用于 MODS 治疗的可能性和应用前景。 方法 ：体外获得 MSC,用 GFP 标记为 GFP-MSC,将实验兔随机分为 4 组，正常组 6只；模型组 12 只；移植组 12 只；普乐沙福组 12 只，建立二次打击 MODS 模型。造模成功后 48 小时后按照 1 106cells/kg 经耳缘静脉缓慢推注， 普乐沙福组移植细胞的同时皮下注射普乐沙福 0.24mg/kg， 分别于第 1、 3 天抽血检测四 组动物的白细胞、 谷丙转氨酶 （ ALT）、 谷 草 转氨酶 （ AS
8、T）、 尿素氮 （ BUN）、肌酐（ Cre）、 肌酸激酶同工酶 （ CK-MB）；于骨髓间充质干细胞移植 成功后 7、 14 天分别处死动物，处死前抽血检测四 组动物 上述生化指标， 取兔心、肝、脾、肺、肾 、肠 组织 保存 ，选用肝、肾组织 观察 MSC 移植后在 MODS 动物模型宿主内的存活情况 ， 并通过HE 染色观察各组兔器官损 伤与修复情况，免疫荧光 技术检测 MSC 移植 后 荧光表达判断 SDF-1 在肝、肾组织中的表达变化。 结果 ： MSC 能够正常贴壁成长并具有相应的分化能力，通过慢病毒转染 GFP 基因后不影响其正常生长及分化能力，抗原表达为 CD34-/CD45-/
9、CD73+/CD105+。模型组动物的白细胞、 ALT、 AST、 BUN、 Cre、 CK-MB 与正常组比较有显著差异，与临床病症类似。 MSC 移植后相关功能指标有所改善，具有促进受损器官恢复的作用；移植后第 14 天在动物的组织切片中发现肝、肾器官组织中有绿色荧光存在，说明MSC 已经发生归巢， 并参与了机体重建； 免疫荧光结果显示： MSC 表达 CD44、CD90，在模型组中无荧光存在、移植组荧光表达强于普乐沙福组，普乐沙福抑制SDF-1 后细胞迁移到靶器官的数量降低。 结论 ：建立了 GFP 标记的 MSC 的体外分离、培养及鉴定的技术平台 ； 成功建昆明 医科大学硕士研究生论文
10、 3 立了兔 MODS 模型，并且移植组的各项功能指标白细胞、 ALT、 AST、 BUN、 Cre、CK-MB 有所改善； MSC 能够参与 MODS 兔的受损脏器的恢复过程 ； 免疫荧光染色观察细胞在各个器官组织中的归巢情况 ，在正常组与模型组不表达，在移植组高效表达，在普乐沙福组表达较低 。提 示 MSC 移植有望为 MODS 提供新的治疗方法。 关键词 ：兔 ； 多器官功能不全综合征 ； 骨髓间充质干细胞 ； 移植 ； 细胞归巢 昆明 医科大学硕士研究生论文 4 The Migration effect of SDF-1 / CXCR4 on bone marrow mesenchym
11、al stem cells of multiple organ dysfunction syndrome in rabbits Postgraduate student: Liu Jin-feng Tutor: Prof. Ling Bin ABSTRACT 【 Objective】 Bone marrow-derived rabbit Mesenchymal stem cells (MSC) marked with green fluorescent protein (GFP) were transplanted to the rabbits which were multiple orga
12、n dysfunction syndrome (MODS) animal models through ear vein. Detect the impact of transplantation on tissue regeneration and repair affected organs of MODS rabbit, and the upregulation and downregulation of SDF-1 effect on the migration, homing of Stem cell. To investigate the possibility of MSC tr
13、eatment applied to MODS and application prospects. 【 Methods】 To obtain MSC through vitro, labeled with GFP, and called GFP- MSC. Sixty rabbits were evenly randomly divided into five groups: normal group; model group; transplantation group; SDF-1 group and plerixafor group. Followed the “two-hit” pr
14、inciple, we established the animal model of MODS. After successfully modeled for 48 hours, GFP-MSC were injected to MODS model with 1106cells/kg through ear vein, then tested the changes of leukocyte, ALT, AST, BUN, Cre, CK-MB, cTnT of rabbit in the five groups on the day 1, day 3respectively. On th
15、e seventh and fourteenth day, heart, liver, spleen, lung, kidney tissue of the model animals were taken to make pathological sections to examine GFP-MSC survival, inhibitory of apoptosis and recovery of injured organs after transplantation. SDF-1 and CXCR4 mRNA expression levels before and after MSC
16、 transplantation in heart, liver, spleen, lung, kidney tissue were detected through QRT-PCR. 【 Results】 In vitro cultured MSC have a typical mesenchymal stem cells pattern, also have the ability to differentiate into osteoblasts and adipogenic cells. It was not changed 昆明 医科大学硕士研究生论文 5 that the diff
17、erentiation potency after lentivirus transfection. MSC was CD34-/CD45 -/CD73 + /CD105 + that conformed to the typical characteristics of MSC. Compared to control group, the physical index leukocyte, ALT, AST, BUN, Cre, CK-MB of model group were significantly different and similar to clinical case. A
18、fter transplantation, the function index that WBC, ALT, AST, BUN, Cre, CK-MB were improved obviously. Green fluorescence was found in the heart, liver, spleen, lung and kidney of recipient on day14. MSC transplantation can inhibit apoptosis of injured organs obviously. It proves that MSC homing has
19、occueeed, and to participate in the reconstruction of the body. Immunofluorescence showed that: MSC express CD44, CD90, no fluorescence present in the untreated group, the transplantation group fluorescence was stronger than plerixafor group, indicating that the number of SDF-1 cells migrating to th
20、e target organ reduced after inhibition of plerixafor. 【 Conclusion】 Established in vitro culture system and GFP-mark technology of rabbit MSC. Successfully established rabbit MODS model, after transplantation the function index of treatment animal, such as WBC、 ALT、 AST、 BUN、 Cre、 CK-MB were improv
21、ed, also GFP-MSC were found in treatment animal tissues, apoptosis of injured organs was obvious inhibited, which means MSC could promote body recovery. Cells homing were observed in various organs and tissues using immunofluorescence staining. It did not express in the normal group and model group,
22、 highly expressed in the transplantation group, lower expression in the plerixafor group. It prompt MSC transplantation may offers new treatment for MODS. 【 Key words】 Rabbit; MODS; MSC; transplantation; Cell homing 昆明 医科大学硕士研究生论文 6 1 前言 1.1 “二次打击”学说与 MODS 模型的建立 “ 多器官功能衰竭 ”（ multiple organ dysfuncti
23、on syndrome； MODS） 一词由美国胸腔医师学院 （ the American College of Chest Physicians） 和危重关爱医学组织（ the Society of Critical Care Medicine） 共同协商后于 1991 年提出 1， 并将 MODS定义为重症病人出现的器官功能改变 ， 导 致体内平衡在未加干预的情况下不能够维持。最近关于 MODS 的定义由 John Marshall 提出，即潜在的、可逆的生理紊乱过程，涉及两个或多个器官系统，不包括进入 ICU 以后的紊乱状态 2。目前研究发现，引起 MODS 的因素很多，因此 MODS
24、是当今创伤外科和危重医学领域中研究的热点课题，是 ICU 常见的继发于多种高危疾患的一种恶性发展的病理生理过程，目前临床死亡率高，尚无切实有效的防治手段。 由于 MODS 的发生机理复杂、模型复制困难，这在很大程度上影响了对该问题的研究进展。因此，建立标准化的、符合临床实际的 MODS 动物模型是研究 MODS发病机制和临床防治的重要基础，也是深入研究 MODS 的重要前提。复制一个符合临床实际的理想的 MODS 实验模型应强调：致伤因素与临床 MODS 常见诱因基本一致；发病在致伤 24h 以后，发病过程模拟 MODS 的临床表现；器官衰竭的诊断标准明确，与临床基本一致，表现出器官功能代偿的
25、进行性发展过程；有两个以上器官或系统的功能障碍；有一定的发病率和死亡率；重复性好。 1992 年 Deitch3提出 MODS 的“二次打击”学说认为：最早的创伤、休克等致伤因素可被视为第一次打击，在该次打击时， 虽然各种免疫细胞及其多种炎性介质也参与了早期的炎症反应，但其参与的程度是有限的，在这个阶段最为重要的是炎性细胞被激活，而处于一种“激发状态”。此后，如果病情平稳，则炎症反应逐渐消退，损伤的组织上得以修复。但如果再次出现致伤因素，则构成第二次打击。此次打击的一个非常突出的特点是炎症和应激反应具有放大效应，即使打击的强度不及第一次打击，也能造成处于激发状态的炎症细胞的更为剧烈的反应，从而
26、超量地释放细胞和体液介质。此外，直接由炎症细胞释放的介质只是全部体液介质的一部分，它们作用于靶细胞后还可以导致“二级” “三级 ”甚至更多级别的新的介质产生，从而形成瀑布样反应或称“级联反应” 。这种失控的炎症反应不断发展，直至导致组织细胞损伤和器官功能障碍。首次打击造成的直接器官损伤，并不是真昆明 医科大学硕士研究生论文 7 正意义上的 MODS，但其引起的炎症细胞活化、内皮细胞和实质细胞损伤或凋亡、肠屏障损害、体内抗炎机制削弱、坏死组织存留以及过度的应激反应，能为濒临失控的全身炎症提供持续的刺激，因此为第二次打击导致脓毒症和器官衰竭起了预激作用。基于上述理论，建立双相迟发的 MODS 动物
27、模型，更符合临床实际过程。 图 1：“二次打击”学说图解 3-9 出血创伤 是诱发 MODS 的基本因素之一。出血创伤导致宿主巨噬细胞功能抑制，削弱局部屏障和全身防御功能，提高组织和细胞对细菌或毒素再次打击的敏感性，增加了对败血症的易感性，为失控的炎症反应及继发的器官损伤起到预激作用。有学者认为，出血性休克所诱发宿主的生物效应是出血性创伤引起的细菌移位所致4-5 ， 但单因素致伤性 MODS 模型，仅模拟 MODS 某一诱因和发病环节及部分临床特征，难以复制出符合临床实际的标准化的 MODS 动物模型。感染常是 MODS 的继发因素，而内毒素是诱发 MODS 的感染因子中强有力的外源性激活触发
28、物。主要是 创伤、休克等应激状态可使大量内毒素入侵血循环而形成内毒素血症。内毒素具有损害多种组织和器官的作用，造成细胞损伤和全身代谢紊乱，形成脓毒血症的级联反应。动物实验研究也常用感染病灶或注射内毒素方法造成脓毒血症或内毒素血症，但单用此方法复制出的 MODS 模型的成功率不高，而动物对内毒素的反应常是“全或无”的结果，受影响因素多。血清内毒素血症检测阳性率也参差不齐，在10%-40%之间 6-7，而复合的致伤刺激可大大提高 MODS 的发生率。近 10 年来国内外研究者采用不同种类动物已建立了多种 MODS 模型 8-9。 1.2 骨髓间充质干细胞的特性及临床应用 MSC最早由 Friedenstein等 10发现的来源于胚胎发育早期中胚层的一类具有良好组织融合性和低免疫源性的多能干细胞，属于成体干细胞的一种，由造血干
