1、1为了方便及时沟通请加我微信，请注明稿号和作者名字退修意见：1. 全文参考我刊“实验研究”格式书写；2. 文中首次出现的英文及其缩写，需补充中文全称；3. 统一文中的单位为国际单位，将格式“mgkg -1”改为mg/kg， “mL”改为“ml” ，“M”改为“mol/L” ；4. “材料”项，主要包括仪器（型号，仪器厂家） ；试药（来源厂家、批号、规格、纯度） 、主要试剂、试剂盒（来源厂家、批号、试剂纯度） ；动物（必须提供的性别，体质量，来源，合格证号（必须是国家标注的合格证号如 SCXK） ，是否通过伦理会同意） ；5. 试验中有离心的，请在仪器中补充离心机的型号、厂家、离心半径；6. 给
2、药剂量的选择依据是否说明，补充高、中、低剂量实验组；7. 检测指标的选择依据及其考察意义，请在讨论中简要说明；8. 统计学分析必须包括统计软件名称及其版本号、检验方法、数据表达方式、检验标准 ；9. 参考文献数量不低于15条，且必须包括中文文献，文献的时效性最好是近5年的，建议有一条中国药房的文献，逐一核实文献内容及在文中的标注，相同标注下的文献不超过3条，文献格式按“3个作者.名称文献类型.杂志社，年份，卷（期）：页码.”格式书写，谢谢；10. 将所有文献的首页或者书籍的封面发邮件给我，以便我们核实，我的邮箱地址是zljchina-，邮件主题注明“参考文献（文章编号） ”11. 全文务必按要
3、求逐一认真修改，请不要用“批注” “修订”修改，请直接在文中注明，用不同的颜色区分，如果对修改意见有异议，请附说明；以下内容必填完整第一作者 通讯作者（职称不得低于第一作者）姓名 职称 最高学历（专、本、硕、博）研究方向 座机电话 *硕士研究生。初级药师。研究方向：中药活性成分药效研究。电话：13360553362。E-mail: 1870469778 #通讯作者：硕士研究生，主管药师。研究方向：中药活性成分药效研究。电话:13360553362 E-mail: 380696279 移动电话 E-mail 工作单位（包括邮编） 发票和样刊邮寄地址（包括邮编）注：第一作者为在校学生的，必须有通讯
4、作者，通常为指导老师；硕士、博士等为已经取得学位证书，后有“研究生”三字的表示在读，在读学生请留意文章发表时是否已经毕业，以确保收信地址正确。通讯作者原则上为一个，职称和学历均须在第一作者之上，且为中级职称及以上。此信息用于联系作者以保证稿件顺利出刊、及邮寄样刊和稿酬所用，请认真填写详细内容，如有更改（特别是发文章时是在校学生，文章刊出时已毕业的作者，请及时确保正确地址）或收件人非第一作者请及时联系文章负责编辑邹丽娟。电话：023-89809898E-mail:zljchina-葛根素对表柔比星心肌毒性的抑制作用及机理的研究题目建立改为“葛根素对表柔比星心肌毒性的影响及机制的研究”李 聪 1*
5、, 周 捷 2, 黄海潮 3, 巫 玮 4, 何贵锋 1#（1.广东省人民医院/广东省医学科学院 广东 广州 510080; 2.中山大学肿瘤防治中心 广东 广州 510060; 3.广东食品药品职业学院 广东 广州510520; 4.广东省食品药品职业技术学校 广东 广州 501663）摘要：目的 研究葛根素对表柔比星心肌毒性的影响及其保护心肌的作用机制研究机理。方法请按正文中的分组进行描述，补充说明具体分组和给药，作用时间 通过表柔比星（1.0M）损伤 H9c2 心肌细胞株建立心肌毒性模型，药物组分别加入终浓度为 10M、50M 、 100M 的葛根素，阳性对照组加入 10M 右丙亚胺，均
6、作用 24h，采用 CCK-8 检测细胞存活率，Hoechst33258 染色观察细胞的凋亡形态，流式细胞术检测细胞凋亡率，Western blot 检测凋亡相关信号蛋白 Bax、Bcl-2 和cl caspase-3 的表达量，采用比色法超氧化物歧化酶（ SOD）活性以及丙二醛（MDA）的生成量评价细胞的氧化损伤程度。结果 建议按“与什么组比较，什么组的什么指标有什么变化，差异是否有统计学意义（P） ”格式逐一对方法中提到的指标进行描述50M，100M的葛根素均可显著提高心肌细胞的存活率及降低凋亡率(P99.0%，批号：031M1302V） 、表柔比星、Hoechst33258、购自美国 S
7、igma Aldrich 公司；右丙亚胺购自江苏奥赛康药业有限公司；CCK-8 试剂盒购自日本 Dojindo Lab 公司；高糖 DMEM 培养基以及特级胎牛血清( FBS) 购自 GIBCO 公司；MDA、SOD 检测试剂盒和 AnnexinV-FITC/PI 细胞凋亡检测试剂盒购自碧云天生物技术研究所；Bax、Bcl-2、-actin cleaved caspase-3、二抗补充完整的抗体名称均购自 Cell Signa-ing 核实单位 Technology Inc (CST)。1.2 H9c2 心肌细胞的培养 用含 10% FBS 的高糖 DMEM 培养液在 37 、5% CO2、9
8、5% 饱和湿度条件下培养细胞。细胞生长满皿约 80% 时进行传代，弃去旧培养液，用 PBS 冲洗两次后加入 0.25%胰酶消化 2 到 3 min，再加含血清培养液终止消化，用滴管轻轻吹打至细胞从皿底完全脱落，按实验需求接种于培养板或培养瓶内待用。1.3 细胞存活率的检测 将 H9c2 心肌细胞接种于 96 孔板中，在细胞生长状态良好时，按实验需要进行不同的处理：模型组加入 1.0m Epi（用配套溶剂配制） ， 三个处理组在加入 1.0m 给药剂量的选择依据 Epi 后分别加入终浓度为 10M、 50M、100M 的 Pue 给药剂量的选择依据 而阳性对照组加入终浓度 10M 的 Dex，空
9、白对照组不作任何处理，各组作用 24h 后，每孔加入 10 l CCK-8， 37 孵育 2 h，用酶标仪测定各孔的 450nm 波长的吸光度( OD) 。每组设 5 个复孔，所得 OD 值按下列公式计算细胞存活率: 细胞存活率/% = 处理组 OD /对照组 OD100% 。1.4 细胞凋亡形态的观察 将 H9c2 心肌细胞接种于 6 孔板中，按方法 2.1 分组处理后，弃去培养液后以 PBS 洗涤 2 次，加入 4%多聚甲醛固定 10 min，PBS 洗涤 2 次后，加入 5 mgL 1 的 Hoechst33258 试剂，室温轻摇 30 min，经 PBS 洗涤后用荧光显微镜在 346n
10、m 激发波长下观察染色情况，并随机选取视野在进行拍摄。1.5 细胞凋亡率的检测 将 H9c2 心肌细胞接种于 6 孔板中，按方法 2.1 分组处理后，弃去培养液后以 PBS 洗涤 2 次，每孔加入 0. 25%胰蛋白酶（不含 EDTA）于 37 消化 2 至 3 min 后，每孔加入含血清的培养液终止消化。细胞悬浮液以 1 000 rmin 1 补充离心半径离心 10 min，弃去上清，收集细胞后按照试剂盒提供的步骤进行AnnexinV-FITC/PI 染色，流式细胞仪检测 H9c2 凋亡率。凋亡率=右上象限细胞比例+右下象限细胞比例谁是早期凋亡，谁是晚期凋亡？。1.6 凋亡相关蛋白表达量的检
11、测 将 H9c2 心肌细胞接种于 6 孔板中，按方法 2.1 分组处理后，用预冷的 PBS 洗 2 次，加入细胞裂解液，4 静置 30 min，12 000 rmin 1 补充离心半径离心 15min，去除细胞碎片等杂质，取上清液，采用 BCA 法进行蛋白定量。总蛋白经 12%SDS-PAGE 补充中文分离后，转移到 PVDF 膜上。用 5% BSA室温下封闭 90min，加入稀释好的一抗 Bax（15000） 、Bcl-2（11000） 、cl cl 是什么意思 caspase-3（11000） ，4 孵育过夜。TBST 洗膜 3 次后，加 15000 稀释的二抗，室温孵育 1 h 后，再次
12、洗膜，然后加入 ECL 化学发光液，X 光片暗室曝光、显影及定影。采用凝胶成像系统自带软件分析胶片中蛋白条带组的灰度面积，所得数值除以内参照（-actin）材料中补充其来源的灰度面积计算各检测蛋白的相对表达量。1.7 细胞氧化损伤的检测 将H9c2心肌细胞接种于6孔板中，按方法2.1分组处理后，去除培养液，PBS洗涤2次，每孔加入 0. 05 mmol/mL的EDTA 和1mL0. 1 mol/L的PBS，再加入50L 1%的 Triton-X100，将培养板置振荡器振荡 1min，加入25%的H 3PO4 100L，12000 rpm补充离心半径于4离心1 h，取上清液，按说明书测定MDA
13、和SOD 的含量。1.8 统计学方法 采用 SPSS 18. 0 软件进行统计分析，实验数据均以x s 表示，组间统计学意义比较采用单因素方差分析( one-way ANOVA) ，组间均数比较采用 LSD-t检验分析。2.结果建议按“与什么组比较，什么组的什么指标有什么变化，差异是否有统计学意义（P） ，表明了什么 ”格式整理结果的文字叙述2.1 CCK-8 检测葛根素对细胞存活率的影响 CCK-8 的检测结果如图 1 所示，除 10M浓度组， 50M 和 100M Pue 浓度组以及 10M Dex 组的细胞存活率显著高于模型组。对 50M，100M Pue 和 10M Dex 三组进行分
14、析比较，结果显示 100M Pue 组和10M Dex 组的细胞存活率均显著高于 50M Pue 组，且两者之间并无显著差异。实验结果表明，随着 Pue 的浓度增加，心肌细胞的存活率逐渐提高，其中 100M Pue 的心肌保护作用与 10 Dex 相近。0%10%20%30%40%50%60%70%80%90%100%110%Contrl Epi 1M Epi 1.0M +Pue 10M Epi 1.0M +Pue 50M Epi 1.0M +Pue 100M Epi 1.0M +Dex 10M细胞存活率%分组名称请全文统一图 1 各组细胞存活率的检测结果（x s，n=5）注：与模型组（Epi
15、 1.0M）比较，* p0.05Fig 1 Vitality of cells in different groups（xs，n5）Note：vs. model group （Epi 1.0M） ， * P0.052.2 荧光染色观察葛根素对心肌细胞的抗凋亡作用 Hoechst33258 荧光染色结果如图 2显示，模型组和 10M Pue 组均出现较多亮蓝色的凋亡小体（如下图箭头所示） ，表明Epi 的毒性作用可致使心肌细胞凋亡，而 10M Pue 未能起到保护作用；当 Pue 浓度为50M，100M 时，可见大部分细胞核的形态完整，荧光较暗，着色均匀，与 Dex 组的染色状况接近。结果表明，
16、50M，100M 的 Pue 可抑制 Epi 所致的心肌细胞凋亡。* *A B CD E F图 2 Hoechst33258 荧光染色观察细胞核的形态学变化（200）A 正常组；B 模型组（Epi 1.0 M） ；C 10M 葛根素处理组； D 50M 葛根素处理组E 100M 葛根素处理组; F 阳性对照组（Epi 1.0M +Dex 10M）Figure 2.Morphological changes of Figure 2.Morphological changes of H9c2 cell nucleus observed by Hoechst33258 staining (200).
17、 A: Control; B. Model group (Epi 1.0M); C. 10M Pue treated group; D. 50M Pue treated group; E. 100M Pue treated group; F. Positive control group(Dex 10M)2.3 流式细胞术检测葛根素对心肌细胞凋亡率的干预 流式细胞术检测 H9C2 细胞凋亡情况如图 3，4 所示，细胞凋亡率为右上区与右下区细胞所占比例之和。模型组的细胞凋亡率为 43.2%, 显著高于空白照组 7.4% (P 0.05); 50M Pue，100M Pue 以及 10M Dex
18、三组的细胞凋亡率依次为 38.5%，32.7% ，31.3%，均显著低于模型组(P 0.05)，而 10 Pue 组与模型组没有显著差异。此外，100M Pue 组和 10M Dex 组凋亡率也显著低于 50M 组，但两者之间并无显著差异。结果表明，随着 Pue 浓度增加，心肌细胞的凋亡率逐渐降低，当其浓度为 100M 时与 10M Dex 效果相近。 A B CD E F横纵坐标看不清楚，请更换清晰图片图 3 流式细胞术检测各组细胞的凋亡率A 正常组；B 模型组（Epi 1.0 M） ；C 10M 葛根素处理组； D 50M 葛根素处理组E 100M 葛根素处理组; F 阳性对照组（Epi
19、1.0M +Dex 10M）Figure 3. Apoptotic rate of H9c2 cell determined via flow cytometryA: Control; B. Model group (Epi 1.0M); C. 10M Pue treated group; D. 50M Pue treated group; E. 100M Pue treated group; F. Positive control group(Dex 10M)0.0%10.0%20.0%30.0%40.0%50.0%Contrl Epi 1M Epi 1M +Pue 10MEpi 1M +P
20、ue 50MEpi 1M +Pue 100MEpi 1M +Dex 10M细胞凋亡率%图 4 各组细胞的凋亡率 与模型组（Epi 1.0M）进行比较，*p0.05Figure 4. Comparing the apoptotic rate of treated groups with model group(Epi 1.0M)，*p0.052.4 Western blot 检测 Bax、Bcl-2 、cl Caspase 3 蛋白的表达水平 通过对比分析显影后条带的灰度，结果显示 50M Pue，100M Pue 两组 Bcl-2 的表达量均显著高于模型组，而 Bax、cl caspase-3
21、 的表达量以及 Bax/Bcl-2 比值则显著低于模型组。 50M Pue，100M Pue 与 10M Dex 三组进行比较，发现 10M Dex 组 Bcl-2 的表达量最高，且 Bax、cl caspase-3 表达量和 Bax/Bcl-2 比值下降最为明显，如图 5,6 所示。结果表明，葛根素能够通过上调 Bcl-2 表达量和下调 Bax 表达量以及抑制 Caspase-3 裂解活化，抑制心肌细胞凋亡，但其调控上述蛋白的能力未如阳性对照药物 Dex。 BaxBcl-2cl caspase-3 -actin图 5 各组细胞 Bax、Bcl-2 和 cl caspase-3 的表达Fig.
22、5 Expression of Bax, Bcl- 2 and cl caspase- 3 in each group*0.0%20.0%40.0%60.0%80.0%100.0%120.0%Contrl Epi 1.0M Epi 1.0M +Pue 10M Epi 1.0M +Pue 50M Epi 1.0M +Pue 100M Epi 1.0M +Dex 10MA0.0%20.0%40.0%60.0%80.0%100.0%Contrl Epi 1.0M Epi 1.0M +Pue 10M Epi 1.0M +Pue 50M Epi 1.0M +Pue 100M Epi 1.0M +Dex
23、10MB0.0%10.0%20.0%30.0%40.0%50.0%60.0%Contrl Epi 1.0M Epi 1.0M +Pue 10M Epi 1.0M +Pue 50M Epi 1.0M +Pue 100M Epi 1.0M +Dex 10MC0.000.501.001.502.002.503.00Contrl Epi 1.0M Epi 1.0M +Pue 10M Epi 1.0M +Pue 50M Epi 1.0M +Pue 100M Epi 1.0M +Dex 10MD图 6 各组细胞 Bax、Bcl-2 和 cl caspase-3 的表达量与模型组（ Epi 1.0M）进行比
24、较，*p0.05A Bax / -actin 相对表达量；B Bcl-2 / -actin 相对表达量； C cl caspase-3/ -actin 相对表达量；D Bax / -actin 的比值Figure 6. Comparing expression level of Bax,Bcl-2,cl caspase-3 in treated groups with model group(Epi 1.0M)， *p0.05A Ratio of Bax / -actin；B Ratio of Bcl-2 / -actin；C Ratio of cl caspase-3/ -actin；D R
25、atio of Bax / -actin2.5 葛根素对 SOD 活性以及 MDA 水平的影响 50M Pue，100M Pue 和 10M Dex三组 SOD 的浓度均显著高于模型组，而 MDA 的浓度则显著低于模型组。100M Pue组与 Dex 组两者比较，发现前者可更大程度降低细胞的 MDA 水平。结果表明，葛根素可通抑制自由基的氧化反应降低 Epi 的心肌毒性，且抑制脂质氧化的效果略优于右丙亚胺。表 1 各组细胞 MDA 与 SOD 的检测结果，注: 与模型组比较，*p0.05，与阳性对照组比较， （Dex 10M） ，#p0.05Table 1 Determination of M
26、DA and SOD in each group，Note: vs. model group（Epi 1.0M） ， * P0.05; vs. positive model group（Dex 10M）,#p0.05Bax/ -actinBcl-2/ -actinBax/ Bcl-2cl caspase-3/-actin* * * * * *MDA /molg 1Pro SOD /Umg 1ProControl 32.34 5.62 50.11 5.27Epi 1M 64.08 7.05 29.85 3.43Epi 1M + Pue 10M 58.75 3.37 32.42 2.69Epi 1
27、M + Pue 50M 44.51 6.62 * 35.66 3.08 *Epi 1M + Pue 100M 36.87 5.22 * # 40.56 1.95 *Epi 1M + Dex 10M 40.47 5.08 * 41.28 2.67 *3.讨论 本文实验结果表明，葛根素的浓度在 50M 至 100M 时，在体外能有效抑制表柔比星引起的心肌细胞凋亡，提高细胞的存活率。Western blot 结果显示，葛根素抑制细胞凋亡的机理是分别上调 Bcl-2 和下调 Bax 的表达，降低 Bax/Bcl-2 的比例，增加 Bcl-2 的表达量从而减少 Bax 二聚体的形成 4。Caspase-
28、3 是执行细胞凋亡的效应蛋白，当其裂解成活化片段（cl caspase-3）后，能够连续传递和放大凋亡信号，从而导致细胞发生大量而快速的凋亡反应。实验表明，在葛根素的干预下，Caspase-3 裂解活化的程度减小，导致 cl caspase-3 的数量下降，从而抑制细胞的凋亡进程 5。研究表明，Bax形成二聚体后能够增加线粒体外模通透性，导致细胞色素 C（Cytochrome C）释放，最终可诱导 Caspase-3 被裂解活化启动凋亡进程，因此可推断葛根素能够抑制线粒体介导的细胞凋亡途径 6。通过检测超氧化歧化酶（SOD）和脂质氧化反应产物丙二醛物（MDA ）的水平，可以确定葛根素能够降低过
29、氧自由基的含量，有效抑制氧化应激对细胞的损伤，从而提高细胞的存活率 7。右丙亚胺为乙二胺四乙酸（EDTA）的亲脂性衍生物，能够透过生物膜进入细胞并水解成类似 EDTA 的结构，通过络合蒽环-铁螯合物中的铁离子，干扰铁离子介导生成自由基，从而减轻过氧化反应对心肌的损害 8。检测心肌细胞存活率和凋亡率的结果显示，100M 葛根素与 10M 右丙亚胺在体外对心肌细胞的保护效果相近。Western blot 的结果反映出右丙亚胺调控凋亡相关蛋白的能力优于葛根素，能更好地干预细胞信号通道抑制凋亡。而在检测氧化应激指标方面，所得数据则显示葛根素抑制细胞膜脂质氧化的能力强于右丙亚胺，这很可能归功于葛根素 4
30、和 7 位的两个酚羟基具有良好的还原性 9。综合而言，两者保护细胞的机理相似而各有侧重，在保护细胞的环节上存在互补的作用。在临床应用方面，尽管右丙亚胺已获 FDA 批准录入 美国肿瘤化疗及放疗保护剂临床操作指南 ，可见其疗效广受肯可 10，但副作用仍不可忽视，主要包括肾毒性和骨髓毒性，当用于儿童患者身上表现更为显著 11。葛根素不仅能够抑制氧化应激对心肌的损伤，而且还具有保护血管内皮，扩张冠状动脉,改善心肌血液循环等右丙亚胺所不具备的作用 12，因此在使用蒽环类药物时，联合应用葛根素与右丙亚胺可更有效降低药物的心肌毒性 13。参考文献补充完整的卷期，如果不完整的，请补充 doi 码1Flore
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