1、收稿日期： 接受日期：基金项目：国家自然科学基金（81071770，81201679）.Supported by Natural Science Foundation of China(81071770，81201679)作者简介：钟沁（1988-） ，女，贵州贵阳人，硕士研究生Tel: 18883147623; E-mail:yanyan_*通讯作者(Corresponding author), 冯涛，E-mail: fengtao9_表达 HBx 的肝前体细胞经肝内移植小鼠模型的构建钟沁 1,2，张超 1,2,何雪梅 1，2 ，胡代曦 12，张锡峰 12,黄佳祎 1，3 ，冯涛 1,2*1
2、.重庆医科大学分子医学与肿瘤研究中心，重庆，4000162.重庆医科大学基础医学院生物化学与分子生物研究中心，重庆，4000163.重庆医科大学基础医学院病理生理学教研室，重庆，400016 摘要 目的：构建表达乙肝病毒 X 基因（HBx）的肝前体细胞，并经小鼠门静脉注射建立肝内移植模型，为进一步研究 HBx 对肝前体细胞的作用和影响及其在原发性肝癌（HCC）发病机制中的作用奠定了基础。方法：将表达绿色荧光的重组腺病毒分别转染小鼠肝前体细胞，再经小鼠门静脉注射后取肝组织，观察绿色荧光蛋白表达情况，免疫组织化学法观察 HBx 阳性染色，Western blot 法和实时定量 PCR( Real-
3、time PCR)法分别检测 HBx 在蛋白质及 mRNA 水平的表达。结果：成功构建了表达 HBx 并靶向针对肝前体细胞的小鼠模型，免疫组化法、RT-PCR 法 及 Western blot 法均检测到 HBx 转染组目的基因及蛋白的特异性表达，与对照组相比结果具有统计学差异。结论：成功构建了表达 HBx 并靶向针对肝前体细胞的小鼠模型，其具有稳定性及较强的可操作性，这不仅对探讨原发性肝癌的发生机制奠定了基础，也为肿瘤动物模型的构建提供了新的思路。 关键词乙型肝炎病毒 X 蛋白；肝前体细胞；绿色荧光蛋白；门静脉；小鼠模型中国分类号 R-332；R575Establishment of mou
4、se models via Intrahepatic transplantation of Progenitor Cells Expressing Hepatitis B Virus X Zhong Qin1,2,Zhang Chao1,2,He Xuemei1,2，Hu Daixi 12,Zhang Xifeng1,2,Huang Jiayi1,3,Feng Tao1,21 Research Center of Molecular Medicine and Cancer， Chongqing 400016，China;2Department of Pathophysiology, Colle
5、ge of Basic Medicine, Chongqing 400016，China;3 Department Pathophy Siology College of Basic Medicine, Chongqing 400016, ChinaAbstract Objective:To eastablish Hepatic progenitor cells(HPCs) expessiong Hepatitis B virus X(HBx）and develop a mouse modles Via the portal vein injection of the cells.It can
6、 provided a platform to study the effect of HBx on HPCs and the mechanisms of Hepatocellular carcinoma(HCC). Methods:recombinant adenovirus were transfected into 14-19 cells;mice were received a injection of the cells via portal vein.The expression of HBx and GFP in liver tissues were detected by im
7、munohistochemistry technique and frozen section .The expression levels of HBx mRNA and HBx prteins were measured by PCR and Western blotting.Results:Compared with the controls,the expression of HBx in liver section or at mRNA and protein levels was positive. Conclusion:The established mice model all
8、ows the HBx aimed at HPCs directly,it has good stability and maneuverability, and it help to dissect the effect of HBx on HPCs.Key words HBx; Hepatic progenitor cells;green fluorescent;proteinPortal vein;Mouse model原发性肝癌（Hepatocellular carcinoma,HCC）是世界范围内重大恶性疾病之一，而乙型肝炎病毒（Hepatitis B virus，HBV）是其发病的
9、首要因素 1。由HBV编码的乙型肝炎病毒X蛋白（Hepatitis B virus X，HBx）,通过多种复杂的途径与HBV相关性肝癌的发生、发展有着密切的联系 2-3，但其具体机制还不是很清楚。肝前体细胞（hepatic progenitor cells ，HPCs),是一类存在于肝组织内具有干细胞特性的细胞，在肝损伤过程中及特定环境因素下常伴有肝前体细胞的增殖，其甚至能向肝细胞癌方向发展,近年来研究显示肝干细胞可能是肝癌发生的起始细胞，其可能与肝干细胞分化受阻有关 4-6。本课题组前期相关研究成果显示，HBx能抑制小鼠胚胎干细胞的凋亡，通过调控信号通路影响肝前体细胞的增殖、分化，并能诱导肝
10、前体细胞上皮-间质转化（Epithelialmess enhymaltran- sition,EMT） 、增强其迁移能力等 7-10,因此推测HBX可能通过对肝干细胞的调控在肝癌发生、发展中起着一定的作用，但具体机制还不清楚，关于其作用机制的研究常限于细胞水平及转基因模型中，本实验通过体外构建表达乙肝病毒X基因的肝前体细胞，再经门静脉移植到小鼠体内，利用绿色蛋白作为示踪剂，既打破了体外细胞实验的局限性，也使模型的构建更具有操作性、重复性、针对性，为进一步探讨HBx对肝前体细胞的影响及其在肝癌机制中的作用奠定了基础。1 材料与主要试剂1.1 材料 小鼠肝前体细胞株14-19由美国芝加哥分子肿瘤研
11、究中心馈赠；人胚肾上皮细胞系 293T 细胞、Ad-GFP腺病毒及Ad-HBx-GFP由本教研室冯涛教授构建并保存；无特殊病原体(specific-pathogen free,SPF)级昆明小鼠，雄性，812周龄（20g30g） ，由重庆医科大学动物中心提供。1.2 主要试剂 总 RNA 提取试剂盒、RT-PCR 试剂盒及实时荧光定量试剂盒 SYBRPremix Ex TaqTM( Tli RNaseH Plus)购自大连宝生物公司；PCR 引物由上海生工生物有限公司合成；DMEM 培养基、胎牛血清、胰蛋白酶等购自 Gbico; 小鼠抗HBV 病毒 X 抗体购自 CHEMICON Intern
12、a-tional 公司;兔抗小鼠 -actin、HRP标记的山羊抗鼠 IgG、免疫组化 SP 及 DAB 染色试剂盒等均购自北京中杉金桥公司；HRP 标记的山羊抗兔 IgG 购自 Proteintech 公司；BCA 蛋白浓度测定试剂盒购自北京鼎国昌盛技术有限公司。2 方 法2.1 细胞培养及转染 复苏293T细胞及14-19细胞，用含10%胎牛血清的DMEM培养，并置于37、5%CO2、饱和湿度孵育箱内，待贴壁后正常换液、传代。在扩增病毒前，将293T细胞以5106密度均匀铺板于100cm 2培养皿内，待细胞贴壁、变形后分别加入0.5Ad-GFP及Ad-HBx-GFP的原病毒保存液，于24h
13、、48h、72小时观察，待细胞感染率达90%以上收取病毒液，离心300g 5分钟，重悬并反复冻融3次（-20037） ，台式离心机离心（最大速率） 、收集上清分装置于-80保存备用。反复扩增多次后将获得的病毒液先进行细胞感染预实验，将14-19细胞以310 3个/孔接种于96孔板内，倍比稀释病毒液并同量滴加于96孔板，分别于24h、48h、72h观察细胞感染率。待细胞融合率达70%左右计数细胞，并按细胞感染预实验确定的病毒液浓度分别感染14-19细胞，感染48小时后，离心300g 5分钟，以510 5/200l浓度重悬细胞，备用于动物实验。2.2 动物模型构建及分组 实验动物分三组，分别门静脉
14、注射转染 Ad-GFP 的 14-19 细胞（14-19/Ad-GFP 组） 、转染 Ad-HBx-GFP 的 14-19 细胞（14-19/HBx 组）及生理盐水（生理盐水组） ，每只注射量均为 5105/200l。小鼠术前禁食 12h，称重、麻醉，待小鼠昏迷无肌张力后消毒、备皮，剑突下做长约 2cm 的纵行切口，依次切开小鼠皮肤、肌肉、腹膜，显露肝脏后，用浸润生理盐水的棉签向右向头侧翻起小鼠肝脏并显露肝门区，小心分离门静脉的分支，充分暴露并确认门静脉后血管夹夹闭门静脉远端，于近端以细针头缓慢注射，完毕后棉签止血取下血管夹，待确定无出血后依次关闭腹腔、缝合，术后生理盐水、葡萄糖补液，第 7
15、天取小鼠新鲜肝组织，部分立即做冰冻切片，部分石蜡包埋，剩余保存于80备用。2.3 观察绿色荧光蛋白表达情况 取 3 组模型的新鲜肝脏组织，大小为0.5cm0.5cm0.5cm，用 OTC 胶包埋后放于样品托盘上并置于恒温冰冻切片机内，温度为11，30min 后连续切片 8m，载玻片附贴肝组织切片，晾干后立即荧光显微镜下观察。2.4 免疫组化法检测小鼠肝组织 HBx阳性反应 固定小鼠肝组织、石蜡包埋、切片、脱蜡后按说明书操作进行 SP 免疫组化、DAB 显色、封片后保存，按分组每组又以 PBS 代替一抗添加对照组，于显微镜下观察每张切片阳性染色情况。2.5 检测小鼠肝组织内 HBx蛋白和 mRN
16、A水平表达情况 (1)采用实时荧光定量PCR 检测各组 HBx mRNA 表达：取适量大小肝脏组织，液氮研磨后冰上匀浆器匀浆，按 RNA 提取说明书提取 RNA。测浓度后反转录制备 cDNA 进行荧光定量 PCR，采用10l 反应体系如下：SYBR Premix ExTaqTM 5l，上、下游引物各0.4l（10mol/L）,模板 1l，无菌双蒸水补齐 10l 。反应条件依次为：95、94、65、72分别反应 5min、15s、30s、30s，40 个循环，95保温1min 后制作溶解曲线，检测引物的特异性，采用 2-Ct 法分析基因相对表达，实验重复三次。 （2）蛋白质印迹分析各组肝组织 H
17、Bx 蛋白：取黄豆大小肝组织，液氮研磨后冰上匀浆器匀浆，加入预先混合的蛋白裂解液和 PMSF（100:1） ，1380g 离心 5min 收取上清，用 BCA 法测定蛋白浓度，加 SDS 上样缓冲液 ，100煮沸 5min，根据待测目的蛋白分子量配制 SDS-PAGE 胶，每组各取 60g蛋白上样量，电泳分离后，电转至硝酸纤维素膜上，经封闭液室温封闭 2 小时，一抗 4冰箱摇床孵育过夜，PBS 洗 8min3 次，加入对应的二抗室温孵育 2 小时，PBS 洗 15min3 次，ECL 法显影检测。基因 上引物（5-3) 下引物（5-3）GAPDH ACCCAGAAGACTGTGGATGG AC
18、CCAGAAGACTGTGGATGGHBx CCCAACTCCTCGTTCACGGTGGTCTCGAGACCACCGTGAACGAGGAGTTGGG2.6 统计学方法 所得数据采用 SPSS17.0 统计软件进行统计处理，采用配对 t检验进行组间的比较，P0.05 为差异具有统计学意义。3 结 果3.1 转染细胞的构建 分别成功构建了表达 Ad-HBx-GFP 及 Ad-GFP 的 14-19 细胞（图 1） 。Ad-HBx-GFP Ad-GFP 图 1 荧光显微镜观察重组腺病毒 Ad-HBX-GFP及 Ad-GFP对 14-19细胞的感染效率Fig 1 Infection efficienc
19、y of 14-19 cells by Ad-HBx-GFP and Ad-GFP observed by fluorescence microscopy 荧光显微镜200Original magnification 2003.2 观察小鼠肝组织绿色荧光表达情况 荧光镜下观察新鲜肝脏组织冰冻切片如图显示，14-19/Ad-HBx-GFP 组及 14-19/Ad-GFP 组均显示了大量绿色荧光，以中央静脉周围较为强烈，且多位于细胞膜上，而对照组则无绿色荧光表达，结果表明细胞经小鼠门静脉注射后，最终能到达小鼠的肝脏内且具有较高的表达量（图 2） 。注射 Ad-HBx-GFP/14-19 注射 Ad
20、-GFP /14-19 注射生理盐水第 7 天The seventh day图 2 荧光显微镜观察注射 Ad-HBx-GFP/14-19细胞、Ad-GFP/14-19 细胞及生理盐水后肝冰冻组织的绿色荧光的表达Fig 2 expression of frozen liver tissue sctions after injection with Ad-HBx-GFP/14-19、Ad-GFP/14-19 and physiological saline observed by fluorescence microscopy 荧光显微镜200Original magnification 2003
21、.3 免疫组化法观察小鼠肝组织 HBx 阳性染色情况及其定位 石蜡切片免疫组化结果显示 14-19/Ad-HBx-GFP 组染色呈阳性，14-19/Ad-GFP 组及空白对照组染色均未见阳性表达，如图中箭头所示，阳性染色和绿色荧光表达位置一致多位于中央静脉周围，但细胞膜上及细胞质内均可见，以细胞质内较多（图 3） 。注射 Ad-HBx-GFP/14-19 注射 Ad-GFP /14-19 注射生理盐水第 7 天The seventh day图 3 免疫组化法分析肝组织 HBx阳性表达情况Fig 3 Analysis of HBx-positive in liver tissues by imm
22、unohistochemistry technique 荧光显微镜200Original magnification 2003.4 小鼠肝组织中 HBx 蛋白及 mRNA 表达情况的鉴定 以 GAPDH 为内参进行Real-time PCR ，结果显示 14-19/Ad-HBx-GFP 组的 mRNA 转录水平明显高于 14-19/Ad-GFP 组及空白对照组（P 均0.05）;免疫印迹反应结果显示 14-19/Ad-HBx组有特异性 HBx 蛋白表达，14-19/Ad-GFP 组及空白对照组则无（P 均0.05） ，以上表明 14-19 细胞经小鼠门静脉注射后，最终到达了小鼠肝脏组织，并成功
23、表达了 HBx（图 4） 。00.20.40.60.811.21.41.6HBxAd-HBx-GFP/14-19Ad-GFP/14-19生 理 盐 水相对表达量第7天图 A图 B00.010.020.030.040.050.060.070.080.090.1HBxAd-HBx-GFP/14-19Ad-GFP/14-19生 理 盐 水相对表达量第7天图 C图 5 Real-time PCR（图 A）和 western blot 法注射（图 B.C）检测 Ad-HBx-GFP/14-19、 Ad-GFP/14-19 及生理盐水后小鼠肝组织 HBx的表达Fig 5 Real-time PCR（A）
24、and western blot（B.C）analysis the expression of liver tissues after injection with Ad-HBx-GFP/14-19、 Ad-GFP/14-19 and physiological saline4 讨论HBx 与 HBV 相关性原发性肝癌（HCC）的发生有着紧密的联系，其可通过多种途径促进肝癌的发生发展 11 。越来越多的研究显示肝干细胞可能是肝癌发生的起始细胞 12。本课题组的前期研究中已构建了重组腺病毒 Ad-HBX-GFP 及 Ad-GFP，且成功分离了小鼠的肝前体细胞，其相关成果显示 HBx 能对肝前体细
25、胞起到调控作用 5-8。但过去的相关研究大多局限于体外细胞实验，其由于培养条件及表达系统的不同对结果的分析有着不同程度的影响，而转基因动物虽可以运用组织特异性使基因在特定组织表达，但不能特异性靶向干细胞 13-14。本研究首先在体外构建了表达 HBx 的肝前体细胞，使 HBx 能靶向针对肝前体细胞，再经小鼠门静脉注射后移植到小鼠体内，并利用绿色荧光蛋白作为失踪剂，其生长微环境更接近体内的发病模式，这为相关方面的进一步深入研究提供了基础。但在体内 HBx 对肝前体细胞的作用和影响是否能与体外研究所显示的结果保持一致，其如何对肝前体细胞进行调控并影响正常的肝细胞，在肝癌的发生、发展中具体的机制又是
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