1、1玉米秸秆和白菜废弃物在不同贮存条件下的微生物群落分析 任海伟 1, 2, 3 刘菲菲 2 李梦玉 2 李金平 1, 3 李志忠 2* 李东 4 黄娟娟 1, 3 孙文斌 2 1 兰州理工大学西部能源与环境研究中心 兰州 7300502 兰州理工大学生命科学与工程学院 兰州 7300503 甘肃省生物质能与太阳能互补供能系统重点实验室 兰州 730050 4 中国科学院环境与应用微生物重点实验室（成都生物研究所） 成都 610041摘 要 采用 Illumina Miseq 高通量技术分析不同温度和贮存方式下玉米秸杆（ IO）和白菜废弃物（IA）贮存 30 d 时的微生物群落。设置低温（O）、
2、中温（R）和高温（H）3 种温度。每种温度条件均设有秸杆单贮（O）、白菜单贮（A）和二者混贮（X）3 个处理组。结果表明，IO 原料附着细菌主要有变形菌门（Proteobacteria ，65.26%）和厚壁菌门（Firmicutes，33.78%），IA 主要包括 Proteobacteria（80.23%）和拟杆菌门（Bacteroidetes ）（18.57% ）。贮存 30d 后在属水平上，IO 主要包括肠杆菌（ Enterobacter）（47.11% ）、肉食杆菌（ Carnobacterium）（27.71%）和泛菌（Pantoea ）（10.14%）等；IA 主要包括假单孢菌（
3、Pseudomonas）（48.40% ）、Pantoea （17.10%）和黄杆菌（Flavobacterium）（16.26%）等，IA 中几乎不含乳酸菌，IO 中乳酸菌丰度约 28.71%。IO 组低、高温单贮时主要包括 Enterobacter（21.76%和 35.87%）、Carnobacterium（40.42%和 27.29%）和 Pseudomonas（18%和 26.99%），中温单贮时主要包括Enterobacter（66.72%）；IA 中、高温单贮时主要包括乳杆菌（Lactobacillus）（80.07% 和 74.63%），低温单贮时主要包括Lactobacill
4、us（28.43%）、耶尔森氏鼠疫杆菌（Yersinia）（19.50%）和 Enterobacter（17.13%）；二者低、中温混贮时主要包括 Lactobacillus（52.03%和 53.52%）、Enterobacter（5.98% 和 11.65%）和 Carnobacterium（12.98%和 10.65%），高温混贮时主要包括 Enterobacter（70.57%）。总之，高通量测序技术全面反应了 IO 和 IA 在不同贮存条件下细菌群落的组成及丰度信息，白菜中高温单独贮存、秸秆/白菜中低温混合贮存时乳酸菌占优势。（图 9 表 3 参 24）关键词 高通量测序；玉米秸秆；
5、白菜废弃物；贮存条件；微生物群落结构CLC Q938.1Microbial Community Analysis of Maize Straw and Cabbage Waste under Different Storage ConditionRen Haiwei123, Liu Feifei2, Li Mengyu2, Li Jinping13, Li ZhiZhong2*, Li Dong4, Huang Juanjuan13 maize straw; cabbage waste; storage conditions; microbial community.随着我国粮食和蔬菜产量的提
6、高，作物秸秆和尾菜等农业废弃物资源量逐年增加，这些废弃物的季节性“爆炸”产出给生态环境带来了严重危害，迫切需要对其进行资源化利用。利用青贮原理将干秸秆与尾菜混合贮存能调制获得高品质的秸秆动物饲料和生物能源原料，从而实现秸秆和尾菜的资源化处理利用 1-2。但另一方面，由于一年四季均有蔬菜种植，需要根据季节气候不同来选择适宜的尾菜和秸秆处理方式。因此，在不同季节温度条件下开展干秸秆和尾菜的贮存过程研究显得尤为重要，既能解决农业废弃物资源化利用过程中的原料供应问题，又能无害化消除尾菜污染，一举多得。青贮是由多种微生物菌群（乳酸菌等有益菌和霉菌、梭菌等有害菌）共同作用，并依赖于外部因素进行自我调控的复
7、杂生化过程。在密闭厌氧环境中乳酸菌等有益微生物生长繁殖并逐渐占据优势，使霉菌等有害微生物的生长受到抑制，实现原料的保质贮存 3。贮存温度及体系中乳酸菌种类、数量和活性是影响混贮品质优劣的重要因素，只有加快乳酸菌发酵，使混贮体系 pH 迅速降低，才能有效抑制有害菌生长繁殖 4。乳酸菌的生长温度范围一般为 5 55 ，最适生长温度为 30 40 ，温度过高或过低都会影响其生长和发酵品质 5-6。刘秦华等 7认为高温环境会同时抑制乳酸菌、好氧细菌和酵母菌繁殖，促进乙酸发酵，同时由于多数梭菌属嗜中温细菌，30 时会大量繁殖，从而影响发酵品质 8。低温贮存（5 15 ）时则乳酸菌发酵和 pH 值下降均比
8、较缓慢，需要较长时间才能抑制有害微生物的生长繁殖。 Zhang 等 9发现牧草饲料的贮存品质随温度（10 40 ）升高而降低。温度对贮存品质的影响本质上是微生物菌群对温度变化的差异化响应，探明秸秆和尾菜在不同季节条件下贮存过程中的微生物菌群变化很有必要，但尚未见相关文献报道。目前，微生态环境中微生物菌群多样性的研究主要包括平板纯培养法、变性梯度凝胶电泳（DGGE）和 16s rRNA 基因末端限制性片段分析技术（T-RFLP）等分子生物学方法 10-11。传统的检测方法不能反映出样品中所有菌群的信息，因而只能定性的对微生物群体进行分析 12。高通量和宏基因组测序等新技术为快速寻找适宜人工培养条
9、件、规避传统方法的长周期弊端提供了可能 13。近年来，高通量测序研究微生物多样性愈发受到人们关注，其中 Illumina Miseq 平台已被广泛用于厌氧发酵 14 和肠道 15等微生物菌群分析，不仅能实现一次并行对几十万到几百万条 DNA 分子进行序列测定，还能从分类学的各个水平上对菌群的构成和丰度进行测定，并且可以鉴定到很多低丰度的菌群。但有关 Illumina Miseq 高通量测序用于青贮发酵过程的文献报道还很少。Li 等 16通过 Miseq 高通量测序发现加入微藻会影响五节芒青贮过程中的微生物菌群，五节芒单独青贮 3 d 时的优势菌群为肠球菌属（Enterococcus ），3 d
10、 后乳杆菌属（ Lactobacillus）变为优势菌，加入微藻混贮后 Lactobacillus 始终为优势菌。陶莲等 17用 Miseq 平台分析玉米秸秆青贮前后的菌群变化发现青贮后片球菌属（Pediococcus）和 Lactobacillus 的丰度显著增加。为了研究不同季节温度和贮存方式对秸秆和尾菜贮存过程中微生物菌群影响，本文参照兰州地区不同季节温度和气候条件设置了低温（-9 3 ，代表冬季）、17 中温（代表初春深秋季）和 32 高温（代表夏秋高温季节）3 种条件，研究了不同温度下玉米秸秆单独贮存、白菜单独贮存及二者混合贮存 30 d 时的细菌群落构成，探讨了温度和贮存方式对秸3
11、秆和白菜贮存过程中微生物菌群变化的影响规律。1 材料与方法1.1 实验材料摘穗后的干玉米秸秆（IO）取自兰州市榆中县，采集时间为 2015 年 11 月，收集后粉碎至 12 cm 备用；白菜废弃物（IA）收集自学校家属区菜市场，切成 2 cm2 cm 备用。试验时间为当年 11 月 24 日12 月 23 日，该时间段内兰州市区的日均最低温度-9 ，最高温度 3 。干玉米秸秆和白菜废弃物的理化指标如表 1 所示。表 1 干玉米秸秆和白菜废弃物的理化指标（%）Table 1 Physicochemical indexes of dry maize straw and cabbage waste
12、(%)原料 DM WSC CP NDF ADF ADLIA 5.18 8.05 6.31 74.80 50.87 9.93IO 87.86 14.57 20.48 22.89 19.53 14.57IA：原料白菜废弃物；IO：原料干玉米秸秆。DM ：干物质；WSC：可溶性碳水化合物； CP：粗蛋白；NDF：中性洗涤纤维；ADF：酸性洗涤纤维；ADL：中性洗涤木质素。IA: cabbage waste; IO: dried maize straw. DM: dry matter; WSC: water-soluble carbohydrates; CP: crude protein; NDF:
13、neutral detergent fiber; ADF: acid detergent fiber; ADL: acid detergent lignin.1.2 贮存试验设计模拟兰州地区气候条件，设置了 3 种温度梯度，分别为低温（-9 3 ，冬季，代号 O）、中温 17 （初春深秋季节平均温度，代号 R）和高温 32 （夏秋高温季节平均温度，代号 H）。每种温度条件均设有白菜单贮组（代号 A）、秸秆单贮组（代号 O）和秸秆/白菜混贮组（代号 X）3 个对照组。9 个处理组分别命名为 OA（低温白菜单贮组）、OO（低温干秸秆单贮组）、OX（低温混贮组）、RA （中温白菜单贮组）、RO （中
14、温干秸秆单贮组）、RX（中温混贮组）、HA（高温白菜单贮组）、HO（高温干秸秆单贮组）和 HX（高温混贮组）。其中，秸秆单贮组为 3 kg IO，白菜单贮组为3 kg IA，混贮组为 0.79 kg IO 和 2.21 kg IA 的混合物，混贮组中初始水分含量为 73.01%。每个处理组均设置三个平行，软体发酵装置中厌氧密闭贮存 30 d。1.3 贮存料的 DNA 提取无菌环境下准确称取 60 g 贮存样品，分成三份后分别加入 200 mL 无菌生理盐水，37 恒温振荡 2 h 后提取细菌基因组 DNA，方法参照 Water DNA Isolation Kit 说明书。1.4 PCR 扩增以
15、上述微生物基因组DNA为模板进行PCR扩增，扩增区域为16S rDNA V4-V5区，选择的引物为带有barcode的515F(5-GTGCCAGCMGCCGCGG-3)和907R(5-CCGTCAATTCMTTTRAGTTT-3)。采用PCR仪（ABI GeneAmp 9700型）对细菌16s rRNA基因进行PCR扩增。每个样本3个重复，将同一样本的PCR 产物混合后用2% 琼脂糖凝胶电泳检测，使用AxyPrepDNA凝胶回收试剂盒（ AXYGEN公司）切胶回收PCR产物 18。1.5 荧光定量参照1.4中琼脂糖凝胶电泳初步定量结果，将PCR产物用QuantiFluor -ST蓝色荧光定量
16、系统（Promega公司）进行检测定量 18。1.6 Illumina 文库构建 Illumina文库构建：连接“Y”字形接头，使用磁珠筛选去除接头自连片段，利用 PCR扩增进行文库模板的富集，利用氢氧化钠变性，产生单链DNA片段 19。1.7 Illumina 平台测序DNA片段的一端与引物碱基互补，固定在芯片上；另一端随机与附近另外一个引物互补，也被固定，形成“桥”；PCR扩增，产生DNA簇；DNA扩增子线性化成为单链；加入改造过的DNA聚合酶和带有4种荧光标记的dNTP，每次循环只合成一个碱基；用激光扫描反应板表面，读取每条模板序列第一轮反应所聚合上去的核苷酸种类；将“荧光基团”和“终止
17、基团”化学切割，恢复3端粘性，继续聚合第二个核苷酸；统计每轮收集到的荧光信号结果，获知模板DNA片段的序列419。1.8 生物信息学分析使用CLUSTALW 软件分析，序列相似性大于97% 时定义为相同的操作分类单元（operational taxonomic units, OTUs）。测序得到的原始数据存在一定比例的干扰数据，为使信息分析结果更准确可靠，首先对原始数据进行过滤处理，得到优化序列 17。然后在去除嵌合体序列后进行OTU聚类分析，对OTU 的代表序列做分类学分析。基于OTU聚类分析结果，可对OTU进行丰度、Alpha 多样性及物种在各分类水平上的群落结果统计分析，得到细菌群落组成
18、；基于分类学信息，在各个分类学水平上进行群落结构的统计分析；基于系统发育进行unifrac等分析 20。2 结果与分析2.1 OTU 分布统计OTU是在系统发生学或群体遗传学研究中，为了便于进行分析，人为给某一分类单元（品系、属、种、分组等）设置的统一标志。通过归类操作，将序列按照彼此的相似性分归为许多小组，一个小组就是一个OTU 21。利用Usearch软件对优化序列提取非重复序列，去除没有重复的单序列，按照97%相似性对非重复序列进行OTU 聚类，在聚类过程中去除嵌合体，得到OTU 的代表序列 20。 由表2可知，RX1组和HX1组的OTU数量明显高于相同温度时的秸秆单贮组（RO1和HO1
19、）和白菜单贮组（RA1和HA1）中OTU 数量，且高于IO 和IA 本底OTU数量；相反，OX1的OTU数量明显低于OA1和OO1组OTU数量，也远低于原料本底OTU数量。另一方面，中、高温条件 IO和IA混合贮存时的OTU数量较高，IA 低、中温单独贮存时的OTU数量较高，IO低温单独贮存时的OTU数量高于RO1 和HO1 ；而且低温和高温时IO单贮组OTU数量均高于IA单贮组OTU 数量。可见，原料种类、贮存温度和方式对细菌群落多样性有很大影响。表 2 原料和不同处理组的 OTU 数Table 2 OTU in the raw material and different treatmen
20、t groups原料 Material 低温 Low temperature 中温 Medium temperature 高温 High temperature样品 Sample IA IO OA1 OO1 OX1 RA1 RO1 RX1 HA1 HO1 HX1OTU 67 91 84 102 46 87 88 109 66 84 98OA1：低温单贮 IA；OO1：低温单贮 IO；OX1：低温 IO 和 IA 混贮；RA1：中温单贮 IA；RO1：中温单贮 IO；RX1 ：中温 IO 和 IA 混贮；HA1：高温单贮 IA；HO1：高温单贮 IO；HX1：高温 IO 和 IA 混贮。下同。O
21、A1: IA stored at low temperature; OO1: IO stored at low temperature; OX1: IO stored with IA at low temperature; RA1: IA stored at medium temperature; RO1: IO stored at medium temperature; RX1: IO stored with IA at medium temperature; HA1: IA stored at high temperature; HO1: IO stored at high tempera
22、ture; HX1: IO stored with cabbage waste at high temperature. The same below. 2.2 Venn 图根据处理组贮存前后 OTU 的相似性和差异性得到图 1 所示的维恩图，如图所示，IA 、OA1 、RA1 和 HA1 中共有的OTU 为 35 个，IO、OO1 、RO1 和 HO1 中共有的 OTU 数为 59 个，OX1、RX1 和 HX1 中共有的 OTU 数位 68 个。不同温度下贮存样品的物种多样性存在明显差异，且 3 种温度时的混贮组样品 OTU 共有数量最多，它们之间的微生物群落相似性最高。5图 1 原料和不
23、同处理组的 OTU 维恩图Fig. 1 Venn diagram of operational taxnonmic unit in the raw material and different treatment groups 2.3 物种丰度分析2.3.1 稀释性曲线从样本中随机抽取一定数量的个体，统计这些个体所代表的物种数目，并以个体数与物种数来构建曲线，这种曲线叫做稀释性曲线。它可以用来比较测序数据量不同的样本中物种的丰富度，也可以用来说明样本的测序数据量是否合理 22。如图 2，横坐标代表样本量，纵坐标代表抽样后 OTU 的数目。随着样本量的加大，曲线越来越平缓，说明测序数据量合理，更
24、多的数据量只会产生少量新的 OTU23。在相同序列数时，RX1 和 OX1 的 OTU 数量较高，说明中、低温混贮时的微生物群落多样性较高。图 2 原料和不同处理组的稀释性曲线Fig. 2 Rarefaction in the raw material and different treatment groups2.3.2 Rank-Abundance 曲线样品的物种丰度和物种均匀度可以用 Rank-Abundance 曲线可以用来解释。物种的丰度由曲线的宽度来反映，物种的丰度越高，曲线在横轴上的范围越大；曲线的形状反映了样本中物种的均度，曲线越平缓，物种分布越均匀 24。由图 3 可知，RX
25、1 在横轴上范围最广，其次是 OX1，说明 RX1 和 OX1 的物种丰度较高。随着 OTU 等级数的增加，所有曲线均变得较为平缓，说明各组中的物种分布比较均匀。6图 3 原料和不同处理组的 Rank-Abundance 曲线Fig. 3 Rank-Abundance curve in the raw material and different treatment groups2.4 Alpha 多样性分析Alpha 多样性分析是指对一个特定区域或生态系统内的多样性分析，其反应了两个综合指标，即群落丰富度指数，包括 Chao 指数和 Ace 指数；群落多样性指数包括 Shannon 指数和
26、Simpson 指数 21。其中 Chao 指数或 Ace 指数越大，意味着群落丰富度越高；Shannon 指数越大，意味着群落多样性越高 25；Simpson 指数越大，意味着群落多样性越低。由表 3可以看出，混贮组的 ace 指数和 chao 指数均高于 IO 单贮组，说明其群落丰富度较高，且 RX1 组中指数最大，群落丰富度最高。RX1 和 OX1 的 shannon 指数也较大，表明它们的群落多样性也较高。所有处理组的 coverage 数值都较大，说明本次测序的结果可以代表样本中微生物群落的真实情况。表 3 原料和不同处理组的 Alpha 多样性指数Table 3 Alpha div
27、ersity in the raw material and different treatment groups 样品 Sample ace Chao shannon simpson coverageIA 82.597333 82 1.993987 0.22144 0.999388IO 113.90205 125.5 1.661429 0.30587 0.99902OA1 134.195654 111.083333 2.548452 0.108297 0.998938OO1 116.146071 114.363636 1.996784 0.233043 0.999306OX1 129.362
28、529 134.666667 2.543813 0.146352 0.99902RA1 109.547558 112.090909 1.94305 0.242174 0.99902RO1 100.308032 101.333333 1.529553 0.457086 0.999347RX1 136.257306 130.9375 2.358596 0.165404 0.998898HA1 132.646608 108.166667 1.747618 0.308656 0.999061HO1 101.091135 110.25 1.970495 0.206442 0.999143HX1 114.
29、729208 107 1.664408 0.408565 0.999224Chao：是用 chao 算法估计样品中所含 OTU 数目的指数。Ace：用来估计群落中 OTU 数目的指数。Simpson ：用来估算样品中微生物多样性指数之一。Shannon：用来估算样品中微生物多样性指数之一。Coverage：反映本次测序结果是否代表了样本中微生物的真实情况。Chao: It is used to estimate the number of OTUs contained in the sample using the Chao algorithm. Ace: It is used to esti
30、mate the number of OTUs in a community. Simpson: It is used to estimate one of the microbial diversity indices in the sample. Shannon: It is used to estimate one of the microbial diversity indices in the sample. Coverage: It reflects whether the results of this sequencing represent the real situatio
31、n of microbes in the sample.2.5 温度和贮存方式对微生物群落结构的影响2.5.1 各处理组的门分类群落组成7由图 4 可知，原料 IA 中的优势菌门为变形菌门（ Proteobacteria）和拟杆菌门（Bacteroidetes ），丰度分别为 80.23% 和 18.57%；低温贮存后优势菌门为 Proteobacteria 和厚壁菌门（Firmicutes），与原料相比 Proteobacteria 丰度降低而Firmicutes 丰度上升；中温贮存后 Firmicutes 的丰度上升为 87.27%，Proteobacteria 的丰度下降为 12.07%
32、；高温时Firmicutes 的菌群丰度为 82.39%。原料 IO 中 Proteobacteria 门丰度最高达 65.26%，而 Firmicutes 丰度较低，仅有 33.78%，低温单贮后 Firmicutes 丰度增加至 44.23%，中、高温贮存时 Firmicutes 丰度降至 8.14%和 29.38%。原料 IA 和 IO 高温混合贮存 30 d 时 Proteobacteria 丰度最高（85.16%），Firmicutes 丰度最低（13.74%）；低、中温混贮时 Firmicutes 为优势菌门，还有少量 Proteobacteria、放线菌门（Actinobacte
33、ria）和 Bacteroidetes。 IA IO RA1 RO1 RX1 HA1 HO1 HX1 OA1 OO1 OX10%20%40%60%80%100%Actinobacteria Bacteroidetes CyanobacteriaFirmicutes ProteobacteriaRelativeabundance图 4 原料和不同处理组的门水平分类细菌群落Fig. 4 The community composition in the raw material and different treatment groups at the level of Phylum2.5.2 各处
34、理组的属水平群落组成各处理组中属水平群落组成如图 5 所示，由图可知，原料 IO 附着的细菌群落包括肠杆菌属（Enterobacter）、肉食杆菌属（Carnobacterium）、泛菌属（Pantoea）和假单孢菌属（Pseudomonas）等，其中 Enterobacter 丰度最高为 47.11%；原料 IA 附着的细菌群落包括 Pseudomonas、Pantoea、黄杆菌属（Flavobacterium）和 Enterobacter 等，其中优势菌群Pseudomonas 丰度最高为 48.40%。IA 低温单独贮存时细菌种群最为丰富，乳杆菌属（Lactobacillus）丰度为 2
35、8.43%，耶尔森氏鼠疫杆菌（Yersnia ）和Enterobacter 丰度次之，分别为 19.50%和 17.13%，还含有少量明串珠菌属（ Leuconostoc）（11.02%）、Pantoea（8.62% ）和乳球菌属（Lactococcus）（5.73% ）等。中、高温单贮时乳杆菌属（ Lactobacillus）均为优势菌，丰度分别高达 80.07%和 74.63%。RA1 中 Enterobacter 相对丰度为 8.62%，明串珠菌属（Leuconostoc）相对丰度为6.19%， Pantoea、 Pseudomonas 和 Flavobacterium 等细菌丰度均低于
36、 1%，HA1 中 Enterobacter、 Leuconostoc 和 Yersnia 丰度分别为 11.24%、5.98%和 4.37%。综合分析，IA 低温单贮时乳酸菌属丰度之和仅为 48.93%，Enterobacter 和 Yersnia 等腐败菌丰度较高，低温贮存可能导致 Enterobacter 等有害微生物大量繁殖，影响发酵品质 18；中、高温单贮时 Lactobacillus为优势菌，乳酸菌属的丰度之和分别高达 87.14%和 82.29%，腐败菌被有效抑制，对白菜青贮发酵有积极作用。 IO 单独贮存后，中温 RO1 组中的 Enterobacter 丰度升至 66.72%
37、，Carnobacterium 丰度降至 1.69%，Pantoea 和Pseudomonas 丰度变化不大；低、高温贮存时 Enterobacter 和 Carnobacterium 仍为优势菌属，Pseudomonas 丰度也分别升至18.00%和 26.99%，Pantoea 丰度分别降至 4.66%和 3.92%。可见干秸秆单贮时无论温度高低腐败菌均占主导优势。二者混贮后，高温 HX1 组中 Enterobacter 丰度高达 70.57%，Carnobacterium 等乳酸菌丰度仅有 4.90%，Pantoea 和 Pseudomonas的相对丰度分别为 5.43%和 6.16%；
38、低、中温时腐败菌 Enterobacter 丰度明显下降，乳酸菌属丰度分别高达 82.21%和 77.80%，其中 Lactobacillus 仍为优势菌属，丰度分别为 52.03%和 53.53%， Leuconostoc 的丰度分别为 13.07%和 5.94%。可见，中、低温 IO/IA 混合贮存有利于乳酸菌生长繁殖进而变为优势菌群，有效抑制 Enterobacter 等腐败菌，而高温环境贮存时腐败菌高达 83%以上，有发生腐败变质的危险。8IA IO RA1 RO1 RX1 HA1 HO1 HX1 OA1 OO1 OX10%20%40%60%80%100%Enterobacter La
39、ctobacillus CarnobacteriumPseudomonas Pantoea YersiniaLeuconostoc Flavobacterium ExiguobacteriumLactococcus Enterococcus SaccharibacillusArthrobacter Weissella Cyanobacteria_norankSphingobacterium Stenotrophomonas JanthinobacteriumRelativeAbundance图 5 原料和不同处理组的属水平分类细菌群落Fig. 5 The community compositi
40、on in the raw material and different treatment groups at the level of Genus2.5.3 属水平各处理组的乳酸菌多样性由图 6 可知，原料 IA 中主要包括乳杆菌属（ Lactobacillus），肉食杆菌属（Carrobacterium），明串珠菌属（Leuconostoc），肠球菌属（ Enterococcus），乳球菌属（Lactococcus ）和链球菌属（Streptococcaceae）等乳酸菌。IA 单独贮存后，低、中、高温时各处理组中 Lactobacillus 占乳酸菌比重均较原料有所提高，且中温时比重最
41、高为40%；Carrobacterium 和 Enterococcus 所占比重有所减少，低温时仅有 4.35%；Lactococcus 和 Streptococcaceae 比重也有所降低，中、高温时仅有 10%；Leuconostoc 、 片球菌属（Pediococcus ）和魏斯氏菌属（Weissella）所占比重均有不同程度的提高。原料 IO 主要包括 Carrobacterium、Marinilactibacillus、Enterococcus、Vagococcus、德瑟兹氏菌属（Desemzia）和乳球菌属（Lactococcus）。IO 原料中未发现乳杆菌属（ Lactobaci
42、llus），但贮存后 Lactobacillus 比重显著增加，低温时比重约占 41.68%，中、高温时 Lactobacillus 比重分别为 37.50%和 30.76%；另一方面，原料 IO 中 Carrobacterium 比重较高（37.51% ），但贮存后比重有所下降，低、中、高温时分别下降为 25.01%、12.50%和 23.07%； IO 中 Enterococcus 和Vagococcus 比重均为 12.50%且不含有 Leuconostoc，低、高温时 Enterococcus 和 Vagococcus 比重分别降至 8.34%和7.69%， Leuconostoc 比
43、重分别增至 8.34%和 15.38%；并且三种温度下贮存后均未发现 Lactococcus。混贮组中，低温时 Lactobacillus 所占比重最大为 30%，高温时 Carrobacterium 和 Lactobacillus 所占比重最大，均为25.01%， Desemzia、 Marinilactibacillus、 Enterococcus 和 Lactococcus 的比重均为 12.5%。中温时 Lactobacillus 比重最大为25%，Leuconostoc 比重为 16.67%，Carrobacterium 比重为 12.50%，Weissella 和 Leuconos
44、toc 比重为 8.33%，其余乳酸菌数均在 5%以下。 总之，原料 IA 中 Lactobacillus 比重较高，且在 3 种温度贮存后不同处理组种 Lactobacillus 比重均有所增加。原料 IO中不含 Lactobacillus，但在 3 种温度贮存后 Lactobacillus 所占比重均在 30%以上。混贮组 Lactobacillus 比重均在 25%以上。原料 IA、 IO 及所有处理组均含有 Carrobacterium 和 Enterococcus。IO 及其单贮组中不含 Pediococcus、 Weissella 和Streptococcaceae， 混贮低、中温
45、组 Pediococcus 比重分别为 5%和 4.17%，Weissella 比重分别为 10%和 8.33%；中温组Streptococcaceae 比重为 4.17%。9IA IO RA1 RO1 RX1 HA1 HO1 HX1 OA1 OO1 OX10%20%40%60%80%100%Aerococcus Carnobacterium Desemzia MarinilactibacillusEnterococcus Vagococcus Lactobacillus PediococcusLeuconostoc Weissella Lactococcus Streptococcaceae
46、Relativeabundance图 6 原料和不同处理组的乳酸菌多样性分析Fig. 6 Composition of Lactic Acid Bacteria in the raw material and different treatment groups at the level of Genus2.5.4 基于 PCA 的群落结构分析为进一步分析样品间的差别，对每一个样品的 OTU 信息构建了未加权的 Unfirac 欧氏距离矩阵（unweighted Unifrac distanc matrix），基于这一矩阵进行了主坐标分析，即 PCA 分析。它是基于每个样品中所含有的全部 OT
47、U 完成的，以百分数的形式体现主成分的主要影响程度 26。样本间的组成越相似，反映在 PCA 图中的距离越近。通过在 PCA 图中的样本间的分散和聚集分布反映样本间细菌群落的相似程度 27。如图 7 所示，每个点代表了一个处理组，主成分分析共提取了三个主成分，其中第一主成分 PC1 和第二主成分 PC2 贡献率分别为 48.8%和 21.24%，累计贡献率达到了 70.04%，可以解释变量的绝大部分信息。OO1 组与 HO1 组距离较近，RA1 组与 HA1 组距离较近，RX1 组与 OX1 组的距离较近，说明它们两两之间的相似性较高。并且 IA 组与 IO 组和其余样品的距离都比较远，说明贮
48、存前后样品的微生物群落有较明显的变化。由此可见，贮存原料的种类和温度是影响微生物群落组成的主要影响因素。图 7 原料和不同处理组的 PCR 分析Fig.7 Principal Component Analysis in the raw material and different treatment groups2.6 基于 Unifrac 的聚类的比较分析2.6.1 多样本相似度树状图利用树枝结构描述和比较多个样本间的相似性和差异关系。首先使用描述群落组成关系和结构的算法计算样本间的距10离，即根据 beta 多样性距离矩阵进行层次聚类（ Hierarchical cluatering）分析
49、，使用非加权组平均法 UPGMA（Unweighted pair group method with arithmetic mean）算法构建树状结构，得到树状关系形式用于可视化分析 28。通过 braycurtis 算法使用 Qiime 计算 beta 多样性距离矩阵，算法如下： DBray-Curtis=1-2(SAi,Bi)mini+Si SA,i = 表示 A 样本中第 i 个 OTU 所含的序列数；SB,i = 表示 B 样本中第 i 个 OTU 所含的序列数 27。由图 8 可以看出，11 个处理组可以分为两大类，其中 IO、RO1、HO1、OO1 与 HX1 聚为一大类，且 IO、OO1 与HO1 在同一分支上，HX1 与 RO1 在同一分支上，说明它们的细菌群落组成相似性较高；IA 单独为一个分支，说明它与其余试验组的群落组成差异性较大；RX1、OX1、RA1、OA1 与 HA1 均在第二分支上，说明其趋同性较高，；OX1 与 RX1在同一分支，它们的群落组成相
