1、项目名称: 主要生物毒素检测技术与检测试剂盒及仪器研制推荐奖种: 福建省科学技术进步奖推荐单位：福建省教育厅主要完成单位：福建农林大学，福州大学，福建拓天生物科技有限公司，厦门斯坦道科学仪器股份有限公司，江苏省农业科学院，福建商学院，济南大学主要完成人：汪世华，高跃明，王荣智，肖志勇，林晓丽，祭芳，陈清爱，黄加栋，姜海燕，张彦丰项目简介1、研究内容本项目为农产品食品中生物毒素检测项目。该项目重点研究内容是采用单克隆抗体、基因工程抗体、ELISA 技术、分子免疫学技术、和胶体金技术，开展海洋生物毒素分离分析、鉴定鉴别，在较短时间内建立起重要生物毒素的快速、准确、灵敏、可信度高、科学性强、能适应我
2、国国情、符合国际惯例的检测技术体系。建立一套基于基因工程抗体的农产品和食品中生物毒素检测试剂盒及检测仪器，本项目首创利用基因工程抗体建立主要生物毒素的检测试剂盒和检测仪器，具有很高的创新性。有着十分重要的社会意义和良好的市场应用前景。2、发现点（1）利用化学交联的方法与钥孔戚血蓝素（KLH）标准品和牛血清白蛋白（BSA ）标准品反应，完成了主要生物毒素毒素（黄曲霉毒素、伏马毒素、黄绿青霉素、橘青霉素、腹泻性贝毒、神经性贝毒、河豚毒素、芋螺毒素等）的完全抗原的交联，并采用琼脂糖凝胶电泳、紫外和红外光谱扫描等方法对交联的产物进行验证，最终获得了高纯度的、性能稳定的海洋毒素完全抗原分子。（2）制备了
3、针对主要生物毒素毒素稳定分泌的单克隆细胞株，亚型鉴定都属于 IgG1。单克隆细胞株经过扩大培养，体内诱生腹水。采用辛酸-硫酸铵法纯化获得较纯的 IgG 抗体，亲和力均在 109 L/mol 以上，属于高亲和力抗体。同时完成了单克隆抗体的纯化，特异性和亲和力等性质鉴定。（4） ）通过噬菌体展示技术，淘选获得了可以和主要生物毒素毒素特异性结合的基因工程抗体，并通过间接 ELISA 对其进行了定量的分析，选定其中亲和力最高的单克隆株进行了单链抗体的可溶性表达和各方面性质研究。（5）建立了针对主要生物毒素毒素的 ELISA 标准曲线的检测线性范围和最低检出限。最后，完成了模拟样品和实际样品的 ELIS
4、A 检测，分析了批间和批内变异系数和样品回收率。最后，成功研制出针对主要生物毒素的 ELISA 检测试剂盒。（6）制备并成功组装了针对主要生物毒素的高灵敏度的金标快速检测卡，检测时间小于 10 min。（7）研制可应用于检测生物毒素的快速检测仪，并实现了 ELISA 试剂盒及胶体金检测卡的产业化，并获得中华人民共和国制造计量器具许可证 。（8）建立免疫层析试条读数仪量程调节理论模型，实现读数仪检测量程的自适应调节，在保证灵敏度的同时，提高检测范围。（9）结合滚环扩增、内切酶辅助信号放大等等温酶放大技术，构建了多种基于目标- 核酸适体绑定介导等温酶放大的通用性新原理，发展了多种简单、快速、低成本
5、且具有高灵敏度和高选择性的抗生物/致病菌检测新方法。3、授权专利和论文项目共申请了专利 21 项，其中获得授权发明专利 12 项、其他类型专利 9项；发表了 31 篇科技论文，其中 SCI 收录论文 31 篇。4、应用推广及效益通过产学研联合，以高校和研究所开展技术创新，以企业开展工程化建设，获得了专利 21 项，形成了高水平的主要生物毒素研发队伍。通过成果转化，形成了一系列的快速分析检测体系和快速分析仪器技术体系，部分 ELISA 检测试剂盒、胶体金检测卡和检测仪器实现了批量生产，在全国多个省（直辖市）推广，累计新增产值达 20563 万元以上。5、主要完成人及其贡献汪世华 项目总负责人，负
6、责协调各参与单位的相关事宜；完成了主要生物毒素的免疫原制备、单克隆抗体和基因工程抗体的制备；建立了主要生物毒素的 ELISA 检测方法，并制备了 ELISA 检测试剂盒；建立了主要生物毒素的胶体金检测方法，制备了生物毒素的胶体金快速检测卡发表学术论文 15 篇，申请国家发明专利 8 项。投入的工作量占本人工作总量的 80%。高跃明 项目主要完成者，设计了检测仪主控电路结构；设计了主要光源系统，进行了光源系统、检测系统、交互与控制系统等关键模块的组装；投入的工作量占本人工作总量的 70%。王荣智 项目主要完成者和主要执行者，完成了主要生物毒素完全抗原制备和抗体筛选与鉴定；建立了基于 ELISA
7、和胶体金的生物毒素检测方法；投入的工作量占本人工作总量的 70%。肖志勇 项目主要完成者，主要进行产品检测技术及检测方法的研究与应用；进行本项目技术的推广及示范；负责产品的售后和技术指导等相关工作。投入的工作量占本人工作总量的 50%。林晓丽 项目主要完成者，完成了海洋生物毒素 ELISA 试剂盒及胶体金检测卡在仪器上的配套应用；建立了检测卡生产平台，开展了产业化工作；取得计量器具许可证 1 项。祭芳 项目主要完成者，协助项目设计和实施，主要进行了生物毒素完全抗原制备；进行了动物免疫以及抗血清效价的 ELSIA 分析；发表论文 5 篇，SCI收录 3 篇，申请国家专利 2 项。陈清爱 项目主要
8、完成者，主要主要负责金溶液还原与抗体的标记处理；完成了胶体金检测卡组装与初步检测分析。 。投入的工作量占本人工作总量的40%。黄加栋 项目主要完成者，主要构建了基于目标介导双重循环放大的高灵敏生物毒素素电化学检测方法；基于滚环扩增（RCA ）技术，设计包含核酸适体的生物毒素素电化学检测方法。姜海燕 项目主要完成者，主要研制出生物毒素金标试纸条定量检测的图像采集装置；进行了免疫层析定量测试的数据优化与处理；校正了特征值的分析数据。张彦丰 项目主要完成者，协助项目设计和实施，建立的基于抗体分子的ELISA 检测方法；进行了模拟的样品和实际样品的 ELISA 检测和数据统计分析。6、代表性论文目录(
9、1) Hang Yang, Yanfang Zhong, Juncheng Wang, Qinghong Zhang, Xiulan Li, Sumei Ling, Shihua Wang*, Rongzhi Wang*. Screening of a ScFv Antibody With High Affinity for Application in Human IFN- Immunoassay. Frontiers in Microbiology. 2018, 9:261. (2) Sumei Ling, Shiwei Xiao, Chengjie Xie, Rognzhi Wang,
10、Linmao Zeng, Ke Wang, Dangping Zhang, Xiulan Li, Shihau Wang*. Preparation of Monoclonal Antibody for Brevetoxin 1 and Development of Ic-ELISA and Colloidal Gold Strip to Detect Brevetoxin 1. Toxins. 2018, 10(2): E75. (3) Dangping Zhang, Chengjie Xie, Rognzhi Wang, Qinghai Yang, Hui Chen, Shihua Wan
11、g*, Kunzhi Jia. Effective preparation of a monoclonal antibody against human chromogranin A for immunohistochemical diagnosis. BMC Biotechnology. 2018, 18(1):25. (4) Rongzhi Wang, Linmao Zeng, Hang Yang, Yanfang Zhong, Juncheng Wang, Sumei Ling, Saeed AF, Jun Yuan, Shihua Wang*. Detection of okadaic
12、 acid (OA) using ELISA and colloidal gold immunoassay based on monoclonal antibody. J Hazard Mater. 2017 339:154-160. (5) Abdullah Farhan UI Haque Saeed, Sumei Ling, Jun Yuan, Shihua Wang*. The Preparation and Identification of a Monoclonal Antibody against Domoic Acid and Establishment of Detection
13、 by Indirect Competitive ELISA. Toxins. 2017, 9(8): E250. (6) Abdullah Farhan UI Haque Saeed, Rongzhi Wang, Sumei Ling, ShihuaWang*. Antibody Engineering for Pursuing a Healthier Future. Frontiers in Microbilogy, 2017, 8: 495. (7) Abdullah Farhan ul haque Saeed, Saima Ashraf Awan, Sumei Ling, Rongzh
14、i Wang, Shihua Wang*. Domoic acid: attributes, exposure risks, innovative detection techniques and therapeutics. Algal Research, 2017, 24: 97-110. (8) Shimuye Kalayu Yirga, Sumei Ling, Yanling Yang, Jun Yuan, Shihua Wang*. The Preparation and Identification of a Monoclonaln Antibody against Citrinin
15、 and the Development of Detection via Indirect Competitive ELISA.Toxins (Basel). 2017, 9(3): E110. (9) Rongzhi Wang, Xiaosong Gu, Zhenghong Zhuang, Yanfang Zhong, Hang Yang, Shihua Wang*. Screening and molecular evolution of a single chain variable fragment antibody (scFv) against Citreoviridin toxi
16、n. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2016, 64: 7640-7648. (10) Sumei Ling, Qing-Ai Chen, Yuming Zhan, Rongzhi Wang, Ni Jin, Jie Pang, Shihua Wang*. Development of ELISA and colloidal gold immunoassay for te-trodotoxin detetcion based on monoclonal antibody. Biosensors and Bioelectronics. 2
17、015, 71:256-260. (11) Sumei Ling , Rongzhi Wang, Xiaosong Gu, Can Wen, Lingling Chen, Zhibin Chen, Qing-Ai Chen, Shiwei Xiao, Yanling Yang, Zhenhong Zhuang *, Shihua Wang*. Rapid detection of fumonisin B1 using a colloidal gold immunoassay strip test in corn samples. Toxicon. 2015. 108:210-215. (12)
18、 Sumei Ling, Jie Pang, Jinjin Yu, Rongzhi Wang, Licai Liu, Yanling Ma, Yuming Zhang, Ni Jin, Shihua Wang*. Preparation and identification of monoclonal antibody against fumonisin B1 and development of detection by Ic-ELISA. Toxicon, 2014, 80: 64-72. (13) Ni Jin, Sumei Ling, Chi Yang, Shihua Wang*. P
19、reparation and Identification of Monoclonal Antibody against Citreoviridin and Development of Detection by Ic-ELISA. Toxicon, 2014, 90: 226-236. (14) Rongzhi Wang, Shuangshuang Xiang, Yonghui Zhang, Qiuyu Chen, Yanfang Zhong, Shihua Wang*. Development of functional antibody using green fluorescence
20、protein (GFP) frame as template. Applied and Environmental Microbiology, 2014, 80 (14) : 4126-4137. (15) Jinghua Chen, Xi Zhang, Shuxian Cai, Dongzhi Wu, Mei Chen, Shihua Wang*, Jing Zhang*, A Fluorescent Aptasensor based on DNA Scaffolded Silver-Nanocluster for Ochratoxin A Detection. Biosensors an
21、d Bioelectronics, 2014，57：226-231. (16) Rongzhi Wang, Ailing Huang, Licai Liu, Sumei Ling, Lei Wang, Tun Lu*, Shihua Wang*. Construction of a Single Chain Variable Fragment Antibody against Tetrodotoxin (TTX) and its Interaction with TTX. Toxicon, 2014，83:22-34. (17) Jing Zhang, Xi Zhang, Guidi Yang
22、, Jinghua Chen*, Shihua Wang*. A signal-on fluorescent aptasensor based on Tb3+ and structure switching aptamer for label-free detection of Ochratoxin A in wheat. Biosensors and Bioelectronics, 2013, 41: 704-709. (18) Yue-Ming Gao, Jian-Chong Wei , Peng-Un Mak, Mang-I. Vai, Min Du and Sio-Hang Pun.
23、Development of a Calibration Strip for Immunochromatographic Assay Detection Systems. Sensors. (19) YunaGuo, YuWang, SuLiu, JinghuaYu, HongzhiWang, YalinWang, Jiadong Huang*. Label-free and highly sensitive electrochemical detection of E. coli based on rolling circle amplifications coupled peroxidas
24、e- mimicking DNAzyme amplification. Biosensors & Bioelectronics, 2016, 75: 315-319. (20) Hongzhi Wang, Yu Wang, Su Liu, Jinghua Yu, Yuna Guo, Ying Xu, Jiadong Huang*, Signal-on electrochemical detection of antibiotics at zeptomole level based on target-aptamer binding triggered multiple recycling am
25、plification. Biosensors & Bioelectronics, 2016, 80: 471-476. (21) Ying Xu, Yu Wang, Su Liu, Jinghua Yu, Hongzhi Wang, Yuna Guo, Jiadong Huang*. Ultrasensitive and rapid detection of miRNA with three-way junction structur(22) Hongzhi Wang, Yu Wang, Su Liu, Jinghua Yu, Wei Xu, Yuna Guo, Jiadong Huang*
26、. Target-aptamer binding triggered quadratic recycling amplification for highly specific and ultrasensitive detection of antibiotics at the attomole level. Chemical Communications, 2015, 51: 8377-8380.(23) Weiyan Liu, Hongmei Yang, Shenguang Ge, Lei Shen, Jinghua Yu, Mei Yan*, Jiadong Huang*. Applic
27、ation of bimetallic PtPd alloy decorated graphene in peroxydisulfate electrochemiluminescence aptasensor based on Ag dendrites decorated indium tin oxide device. Sensors and Actuators B: Chemical, 2015, 209: 32-39. (24) Shenguang Ge, Weiyan Liu, Haiyun Liu, Fang Liu, Jinghua Yu, Mei Yan*, Jiadong Hu
28、ang*. Colorimetric detection of the flux of hydrogen peroxide released from living cells based on the high peroxidase-like catalytic performance of porous PtPd nanorods. Biosensors & Bioelectronics, 2015, 71: 456-462.(25) Hongzhi Wang, Yu Wang, Su Liu, Jinghua Yu, Yuna Guo, Ying Xu, Jiadong Huang*.
29、Signal-on electrochemical detection of antibiotics based on exonuclease III-assisted autocatalytic DNA biosensing platform. RSC Advances, 2016, 6, 43501.(26) Wei Xu, Yu Wang, Su Liu, Jinghua Yu, Hongzhi Wang, Jiadong Huang*. A nocel sandwich-type electrochemical aptasensor for sensitive detection of
30、 kanamycin based on GR-PANI and PAMAM-Au nanocomposites. New Journal of Chemistry. 2014, 38, 4931. (27) Wei Xu, Su Liu, Jinghua Yu, Min Cui, Jie Li, Yuna Guo, Hongzhi Wang, Jiadong Huang*. An ultrasensitive HRP labeled competitive aptasensor for oxytetracycline detection based on grapheme oxidepolya
31、niline composites as the signal amplifiers. RSC Advances, 2014, 4, 10273. (28) 28 Xia Sun, Falan Li, Guanghui Shen, Jiadong Huang* and Xiangyou Wang*. Aptasensor based on the synergistic contributions of chitosangold nanoparticles, graphenegold nanoparticles and multi-walled carbon nanotubescobalt p
32、hthalocyanine nanocomposites for kanamycin detection. Analyst, 2014, 139, 299.(29) Fang Ji, Mduduzi P. Mokoena, Hongyan Zhao, Ademola O. Olaniran, Jianrong Shi. Development of an immune chromatographic strip test for the rapid detection ofzearalenone in wheat from Jiangsu province, China. Plos one.
33、2017, 12(5), e0175282. (30) Fang Ji, Jianhong Xu, Xin Liu, Xianchao Yin, Jianrong Shi. (2014). Natural occurrence of deoxynivalenol and zearalenone in wheat from Jiangsu province, China. Food Chemistry, 157: 393-397.(31) Fang Ji, Jirong Wu, Hongyan Zhao, Jianhong Xu, Jianrong Shi. Relationship of De
34、oxynivalenol Content in Grain, Chaff, and Straw with Fusarium Head Blight Severity in Wheat. Toxins. 2015, 7, 728-742. 7、出版专著（1）汪世华等 编著.抗体技术 （第二版）.北京：科学出版社，2018.088、主要知识产权证明目录(1) 一种免疫层析试条定量检测仪的校准试条及其制作方法，中国，ZL201310001848.1 发明专利，授权时间：2014.12.31。(2) 一种免疫试条读数仪的模拟前端检测电路，中国，ZL 201520801340.4，实用新型专利，授权时间
35、：2016.02.24(3) 一种适用于移动终端的生化试条检测装置，中国，ZL 201520666689.1，实用新型专利，授权时间：2015.12.02。(4) 一株能稳定分泌抗黄绿青霉素单克隆抗体的杂交瘤细胞株，中国，ZL201410137850.6，发明专利，授权时间：2017.03。(5) 一种基因工程单链抗体检测伏马毒素 B1 的试剂盒及方法，中国，ZL201110027055.8，发明专利，授权时间：2013.06。(6) 基因工程单链抗体检测黄曲霉毒素 B1 的试剂盒及方法，中国，ZL201010184805.8，发明授权时间：2013.01.03。(7) 基于基因工程单链抗体的
36、 T-2 毒素快速检测试剂盒，中国，ZL201110022813.7，发明专利，授权时间：2014.05.11。(8) 基于核酸适配体检测氨苄青霉素的生物传感器及其制备方法，中国，ZL201410504740.9，发明专利，授权时间：2016.06.29。(9) 一种检测大肠杆菌的电化学传感器及其制备方法，中国，ZL201410576627.1，发明专利，授权时间：2016.05.25。(10)糖基功能化细菌毒素分子印迹膜基片及其制备方法和应用，中国，ZL200910018460.6，发明专利，授权时间：2013.03.20。(11)基于核酸适配体检测氨苄青霉素的生物传感器，中国，ZL2014
37、20559391.6，实用新型专利，授权时间：2015.10.21。(12)用于卡那霉素检测的电化学适体电极，中国，ZL201420502065.1，实用新型专利，授权时间：2015.05.13。(13)一种检测大肠杆菌的电化学传感器，中国，ZL201420621074.2，实用新型专利，授权时间：2015.03.11。(14)一种检测大肠杆菌的生物传感器、中国，ZL201520043401.5，实用新型专利，授权时间：2015.12.02。(15)一种检测鼠伤寒沙门氏菌的生物传感器，中国，ZL201520119390.4，实用新型专利，授权时间：2015.09.16。(16)杂交瘤细胞株及其
38、应用，中国，ZL201010556627.7，发明专利，授权时间：2013.05.08。(17)水稻稻曲病毒素 Ustiloxin A 的提取纯化方法，中国，ZL201210056447.1 ，发明专利，授权时间：2013.10.09。(18)DON 毒素的制备纯化方法，中国，ZL201010226055.6 ，发明专利，授权时间：2012.05.30。(19)通过麦粒培养基制备纯化 ZEN 毒素的方法，中国，ZL201310310376.8，发明专利，授权时间：2015.03.04。(20)手持式执法检测终端，中国，ZL201730103145.9，外观专利，授权时间：2017.08.04。手持式食品安全执法检测终端，中国，ZL201720890933.1，实用新型专利，授权时间：2018.03.13。
