1、免疫荧光显微术Immunofluorescent microscope,荧光显微镜技术是根据标本本身的荧光反应物质具有吸收由荧光源发出的激发光能而呈现荧光的现象，或利用组织及细胞内某成分可与荧光染料结合，并受到荧光激发后呈现出特定颜色荧光的原理，用荧光显微镜进行观察，对待测物质进行定性、定量和定位的技术。 免疫荧光（immunofluorescence，IF）定位是利用抗体与生物分子（抗原）的特异性结合，通过荧光结合抗体对抗原的特异性标记显现图像，从而对标本中的抗原进行定性、定量和定位。由于荧光与标本黑暗的背景对比强烈，所以荧光显微术的灵敏度非常高。荧光强度与激发光的量及荧光染料的量成线性比例
2、关系，因此可以根据镜下荧光强度对标本中的抗原进行定量测定。,目前，免疫荧光显微术已广泛应用于研究胚胎发育、病理组织、癌症及正常细胞表型，植物、真菌、细菌、病毒、亚细胞定位，以及抗原的辅助定位等。该技术的关键是抗体的特异性、标本的制备、自身荧光、显微镜的使用及操作者。抗体特异性取决于免疫时用的抗原的纯度，使用亲和纯化的多克隆抗体或单克隆抗体可以获得满意的结果。自身荧光通常限制细胞和组织中荧光抗体探针的可检测性。,通过光谱辨别（spectrum discrimination）可以将自身荧光的影响减至最低。光谱辨别包括选择适当的探针和滤光器以使探针的荧光信号相对于自身荧光之比达到最大。 哺乳动物细胞
3、中自身荧光物质主要是黄素辅酶（FDA和FMN，吸收光波长为450 nm，发射光波长为515 nm）和还原型吡啶核苷酸（NADH，吸收光波长340 nm，发射光波长为460 nm）。 植物的自身荧光物质常是木质素，产生绿色荧光；卟啉，如叶绿素，产生长波长的红色荧光。因此，在IF中使用发射蓝光的短波长荧光染料比较好。对于固定细胞，在抗体孵育前先用含0.1硼氢化钠的PBS溶液漂洗30 min，可显著地减低自身荧光。,1. 荧光显微镜及其附属设备,荧光显微镜观察是在光学显微镜水平上对蛋白质和亚细胞组分进行定位的最常用的方法一。荧光显微镜由光源、滤片和显微镜三个系统组成。（一）光源 荧光显微镜的光源系统
4、是应用高压汞灯，该灯能以最小的表面积释放出最大量的短波光源（紫外线）。由启动装置控制，每次启动可工作23 h。其使用寿命与启动次数、工作时间密切相关，故在使用时避免频繁启动而损坏电极。,（二）滤片系统 滤片系统包括激发滤片、阻断滤片和吸热滤片。 1激发滤片：大多以其所表现的光谱基本色调性质命名。（1）UV激发滤片 激发光通常为波长365400 nm的紫外线。该滤片适于樱草素（primulin）、硫磺素（thioflavine）、Hoechst 33258及Hoechst 33342等荧光染色观察。（2）V干涉激发滤片：激发光为波长410420 nm的紫光。适于单胺类的荧光观察。（3）BV激发滤
5、片：激发光为波长404435 nm的蓝紫光。适于吖啶橙及异硫氰酸荧光素（faluorescein isothiocyanate, FITC）标记抗体的免疫荧光染色观察。（4）B干涉激发滤片：激发光为波长490nm的蓝光。也适于FITC标记抗体的免疫荧光观察。（5）G干涉激发滤片：激发光为波长520550 nm。适于四甲基异硫氰酸罗丹明（TRITC）标记抗体的免疫荧光染色观察 。,2. 阻断滤片：在光路中吸收那些经过标本后未被标本转化，吸收而射到视野的激发光，起保护观察者眼睛的作用。激发与阻断滤片配合使用的范围。,3. 吸热滤片：由于光源都含有一定量的红光而产生热量，此类滤片具有吸收热量的作用。
6、,（三）荧光显微镜 荧光显微镜依照光路照射方向分为透射式和落射式两种。大部分荧光显微镜兼有透射和落射两种功能。通过改变光路中的反光镜可以进行透射光或落射光荧光观察。,2. 抗体标记,抗体与抗原的结合方法：直接法和间接法。直接法是将带有标记的抗体与抗原反应，显示出抗原存在的部位。间接法是在抗体抗原初级反应的基础上，再用带标记的次级抗体同初级抗体反应，从而使初级反应得到放大，显示增强。,图 免疫细胞化学直接法（A）与间接法（B）示意图,3. 荧光染料,荧光染料是否发射荧光及荧光的强弱主要决定于该染料的分子结构，同时与其所处的环境及其状态也有密切的关系。如：染色液的pH、浓度和染色时的温度等均对荧光
7、效应有一定的影响。 在进行荧光染色时，还要注意避免与对荧光有淬灭作用的物质接触。例如卤酸盐，碘离子作用最强，其次为溴离子，而氯离子作用最小；金属离子，如铁离子、银离子等对荧光亦有淬灭作用。,荧光素是免疫荧光术中最常用的荧光染料，经紫外光（400 nm）或蓝光（常为490 nm）激发后，发射出绿色荧光（500550 nm），其波长范围正是暗适应时眼睛最敏感的范围，而且显微镜的光学系统也能进行最佳校准。 罗丹明、伊红、四甲基罗丹明、Texas红也是常用的荧光染料，其激发光波长为520590 nm，发射光波长为550620 nm，可通过一个异硫氰酸基团与抗体相连。 一般来说，由于眼睛对黄光、红光比蓝
8、光敏感，所以黄色和红色荧光染料比蓝色荧光染料更有用。蓝色荧光染料常需紫外线激发，还可能损伤许多细胞结构，并易使细胞产生自发荧光。,许多荧光染料也可与毒素结合。每种毒素特异性结合一种细胞靶结构，从而能够显示这些细胞结构。例如，荧光毒伞素用于标记细胞的丝状肌动蛋白（F肌动蛋白）。DAPI是用于荧光标记双链DNA最常用的荧光染料。,图2（a）上皮细胞（b）细胞线粒体（c）肌动蛋白（d） HeLa细胞(Alexa Fluor 546共轭毒伞素)（e）非洲绿猴肾细胞肌动蛋白（f）棕榈树组织,DAPI与A-T碱基结合后，其荧光比处于溶液中的自由状态或与G-C碱基结合的荧光强约20倍。DAPI可用于显示支原
9、体污染及线粒体，但最常用于显示细胞核和染色体。缺点是，在多色成像中，用360 nm的光激发时，DAPI发射的光太亮，从而掩盖了其他的荧光信号，可改用405 nm的光作为激发光。 长波长的光不仅能很好地激发DNA，还可减少对细胞的损害，而且也减少对其他荧光染料的漂白作用。由于DAPI有足够的明亮度，故仍是标准的DNA荧光染料。,三、用酶标法检测细胞内蛋白质的定位,（一） 原理 免疫酶标技术（Immunoenzymatic Technique）是指用酶标记抗体或酶标记抗抗体进行抗原抗体反应。这种标记物可同时保留抗体的免疫特性和酶的活性。用酶标记抗体与抗原结合后，需再滴加酶的底物过氧化氢（H2O2）
10、和供氢体二氨基联苯胺（diaminobenzidine terrahydrochloride，DAB）。酶和底物反应后可产生有色沉淀物，借助一般光学显微镜或电子显微镜进行定位、定性研究，也可应用光电比色计或酶标仪进行定量测定。,采用酶检测法常遇到的问题及解决方法（1）内源性细胞酶活性的存在对反应结果的影响：虽然细胞内源性酶活性的问题并不是普遍存在，但有些细胞和组织有内源性的过氧化物酶（如巨噬细胞、骨髓细胞及红细胞）或碱性磷酸酶（如胎盘、小肠），这些内源性酶活性的存在会给实验结果的判定带来麻烦。,如果已知或怀疑存在内源性过氧化物酶活性，可以用含有1乙酸的甲醇室温处理15 min，或用含0.03
11、H2O2的甲醇室温处理30 min。如果是经乙醛固定过的细胞或组织，在制作光学显微镜标本时，可用高碘酸硼酸钠处理以封闭内源性过氧化物酶活性（在与一抗反应之前，首先将标本用0.01 mol/L。高碘酸处理10 min，随后在0.1 mg/ml硼酸钠溶液中孵育10 min）。标本用缓冲液漂洗后再进行定位检测实验操作的其余步骤。内源性碱性磷酸酶活性可以通过在底物混合液中加入左旋咪唑来加以封闭。,（2）对反应产物的检测结果模棱两可：如果对过氧化物酶反应产物判断不清，可以在DAB底物溶液中加入镍或钴等金属盐，会使反应更为敏感，此时反应产物呈紫色或黑色。首先用水配制8 NiCl2贮存液，再按每0.5 ml
12、 DAB溶液（0.5 mg/m1）加入4 L 8 NiCl2贮存液进行孵育，最后加3 L 2 H202使反应进行。,（二）材料 包括22 mm25 mm的1.5号盖玻片、35 mm的培养皿或6孔细胞培养板、2甲醛、戊二醛、PBS、0.3 mol/L甘氨酸、0.5 mg/ml硼酸钠、l0TritonX-100贮存液、正常血清、一抗、二抗（根据自己的需要选定）、0.05 mol/L Tris-HCl（pH 7.6）、DAB显色剂、BCIP/NBT显色剂、20 mmol/L EDTA。 缓冲液l：含150 mmol/L NaCl、 l00 mmol/L Tris-HCl，用NaOH或HCl调pH为7
13、.5。 缓冲液2：含l00 mmol/L Tris-HCl（pH 9.5）、100 mmol/L NaCl、50 mmol/L MgCl2。,（三）方法 1过氧化物酶偶联抗体进行蛋白质的定位（1）在35 mm的培养皿或6孔细胞培养板的一个孔中放入一张盖玻片（22 mm25 mm），在盖玻片上培养细胞。当细胞在盖玻片上铺满50-70是最理想的状态，但具体情况应视实验研究决定。 悬浮培养的细胞可通过细胞离心涂片器（Cytospin，Shandon Lipshaw）或用多聚L赖氨酸包被盖玻片来使其黏附在盖玻片上。,（2）用2甲醛加0、0.01、0.1、0.25或0.5戊二醛-PBS溶液（pH 7.4
14、）固定细胞，室温下放置20 min。 用不含戊二醛的甲醛固定后，大部分抗原能够很容易地被定位。这样固定可满足光学显微镜检测，且通常可作为电镜定位的一种良好的阳性对照。但有些抗原会由于固定不充分而丢失，遇到这种情况时就需在固定混合液中加人一些戊二醛，并需通过滴定来确定戊二醛的最适浓度。由于不同的抗原对戊二醛的敏感性不同，因此需要尝试一系列浓度的戊二醛，从中确定出能保存免疫反应性的最高浓度。,（3）用0.3 mol/L甘氨酸或含有0.5 mg/ml硼酸钠的PBS洗细胞3次，每次10 min，以减少游离的醛类。（4）按所需的终体积用PBS将10 Triton X-100贮存液稀释成0.5的溶液。由于
15、Triton X-100非常黏稠，这样做可使这种去污剂溶液的最终浓度更恒定一些。用0.5 Triton X-100 + 0.5 NGS-PBS对细胞进行透化处理，冰浴作用5 min。（5）用产生二抗的动物正常血清封闭试剂，室温封闭10 min。（6）用PBS+1NGS洗3次，每次10 min。（7）加入一抗，室温孵育1 h。,（8）用PBS+1NGS洗3次，每次10 min。（9）用1:50稀释的过氧化物酶偶联的二抗（用亲和层析纯化）室温孵育1 h，反应在潮湿仓里进行。（10）用PBS洗3次，每次10 min。（11）用0.05 mol/L Tris-HCl（pH 7.6）洗2次，每次l0 m
16、in。（12）放人DAB+H202中孵育，直到形成足够满意的反应产物。 配制DAB时首先用0.05 mol/L Tris-HCl（pH 7.6）将其溶解成1 mg/ml，然后用Tris-H202 15 ml Tris-HCl（pH 7.6）+10 L 30 H202稀释成0.5 mg/ml。（13）用0.05 mol/L Tris-HCl（pH 7.6）洗3次，每次10 min，以终止反应。,（14）用PBS洗10 min。（15）用含有2戊二醛的PBS室温固定20 min。（16）用PBS洗2次，每次10 min。（17）按常规方法进行封固，用光学显微镜观察。（18）结果与分析 检测过氧化物
17、酶活性时常用DAB作为电子受体，以H2O2作为底物。在存在酶活性的部位可观察到棕色的反应沉淀物。,2碱性磷酸酶偶联的抗体对蛋白质进行定位按上述的免疫过氧化物酶实验方案中的步骤(1)(7)操作。与经亲和层析纯化的、用PBS（pH 7.4）1:50稀释的、与碱性磷酸酶偶联的二抗室温孵育1 h，反应在潮湿仓里进行。用PBS洗3次，每次5 min。在室温下用缓冲液1洗2次，每次15 min，随后在缓冲液2中室温平衡1 min。将细胞与2 ml BCIP-NBT（2 mg BCIP、3 mg NBT，用10 ml的缓冲液2溶解）孵育，室温下振荡显色。定时用倒置显微镜检查显色情况。通常的温育时间可以从5
18、min2 h。用含20 mmol/L EDTA的PBS冲洗以终止反应。按常规方法进行封固，用光学显微镜观察。结果与分析 碱性磷酸酶活性的检测常用BCIP-NBT作为底物，在酶活性存在的部位产生一种深黑色或紫色的沉淀。,（四）注意事项1. 甲醛和戊二醛均有毒，甲醛还是致癌剂。两种物质均容易经皮肤吸收，对皮肤、眼睛、黏膜及上呼吸道有刺激性或破坏性，应戴手套、护目镜在通风橱内操作。甘氨酸及硼酸若被吸人、吞食或经皮肤吸收，可能对人体有害，应戴手套及护目镜操作。33-二氨基联苯胺（DAB）为致癌剂，要非常小心地在通风橱中操作。2. 更换缓冲液及转移盖玻片的过程应迅速，以避免细胞风干。将盖玻片放在一个35
19、 mm培养皿中进行缓冲液更换，操作起来很方便。当吸弃溶液时不要完全吸干，应在细胞上留下一薄层的液体。,3. 将盖玻片从培养皿中移出时，培养皿中应有缓冲液。如转移盖玻片时培养皿中没有缓冲液，表面张力的作用就有可能造成盖玻片破碎。用一张滤纸轻轻地接触到盖玻片的边缘，以吸走盖玻片上残留的缓冲液。小心地擦干盖玻片的上面（即没有细胞的一面）。在盖玻片上加30 L稀释好的抗体溶液，将其颠倒过来放在一张载玻片上。用一个140 mm培养皿可以很容易地制成一个潮湿仓。在培养皿的底部放一张潮湿的纸巾，在纸巾上放两块木条，将载玻片安放在两块木条上，使其不能与纸巾直接接触。一个140 mm培养皿可放置4张载玻片。 4. DAB反应混合物应现用现配，装溶液的试管应用铝箔包裹以避光。反应孵育时间的长短取决于检测的抗原，通常的反应时间为530 min。反应产物呈棕色。,
