1、产地对 蟾酥药材质量 影响研究 袁旭江 1 沈嘉茵 2 吴燕红 1 （ 1-广东药学院中药开发研究所，广东 广州 510006； 2-深圳市妇幼保健院，广东 深圳 518000） 摘 要 目的 : 建立蟾酥药材质量分析方法 ，并分析产地对其 有效 成分的影响 。 方法 : 以华蟾酥毒基和脂蟾毒配基为 对照 ，采用薄层色谱法和高效液相色谱法进行分析 和含量测定 。 结果 : 不同产地蟾酥药材 所含成分类型基本相似，但 在成分 含量 上 存在明显的差异， 以 脂蟾毒配基含量变化最为明显， 其中 产地 山东 的蟾酥的华蟾酥毒基和脂蟾毒配基 含量基本最高 ； 成分差 异在 薄层色谱图谱 中 主要表现在
2、斑点 2（脂蟾毒配基） 、斑点 3（华蟾酥毒基） 、斑点 4、斑点 6和斑点 9上， 在 高效液相 图谱中 表现在 3号、 4号、 6号、 7号、 8号、 9号、 14号、 15号峰上，且 还可以看出 7号、 8号峰的含量与 14号（华蟾酥毒基）、 15号（脂蟾毒配基） 峰 含量 可能存在相关性 。 结论 : 不同产地蟾酥药材存在明显质量差异；本文方法稳定可行，重现性和专属性好，可用于蟾酥鉴别及质量分析。 关键词 蟾酥； 质量 ；高效液相 色谱 ；薄层色谱 Influence of Different Producing Area on Quality of Venenum Bufonis Y
3、uan Xu-Jiang1, Shen Jia-Yin2, Wu Yan-Hong 1 1- Chinese Materia Medica R Quality;HPLC;TLC 蟾酥的应用始载于唐代的药性论，在中华人民共和国药典 2005年版一部中明确记载了蟾酥为蟾蜍科动物中华大蟾蜍 Bufo bufo gargarizans Cantor或黑眶蟾蜍 Bufo melanostictus Schneider的耳后腺及皮 肤腺分泌的白色桨液，经加工干燥而成 1。蟾酥性味甘辛、温，有毒，具有解毒、消肿、醒神、开窍、强心和止痛等作用。蟾酥药理活性较强，作用广泛，早已引起国内外的广泛关注。蟾酥产地繁多
4、，质量差异较大，但现有文献未曾更为细致的从化学成分角度对其质量差异进行 定性和定量 比较分析。因此，笔者收集不同产地蟾酥药材，以华蟾酥毒基和脂蟾毒配基 2、 3为指标，运用薄层色谱法和高效液相 色 谱法 4，对不同产地蟾酥药材进行 定性和定量 分析，从多个化学成分含量角度上反映不同蟾酥的质量差异，为蟾酥的鉴别和质量分析提供依据。 1 仪器与 试药 BS124S电子分析天平 (德国 Sartorius)，电动恒温水浴锅 (上海一恒电子仪器厂 )， Agilent 1100高效液相色谱仪。 硅胶 GF254预制板 (浙江台州 )；定量毛细管 (DrummondUSA)； CAMAGREPROSTA
5、R3硅胶 GF254预制板 (浙江台州 )；定量毛细管 (DrummondUSA)； CAMAGREPROSTAR3薄层摄相仪、 基金项目 ：广东省中医药管理局（ 1060042）：治疗冠心病复方中蟾酥来源及其炮制工艺研究，负责人：袁旭江。 作者简介 ：袁旭江 (1976-),助理研究员 ,从事中药新药开发与质量研究 ,Tel:020-39352540,E-mail:. 半自动点样器 (瑞士 )。华蟾酥毒基对照品 (中国药品生物制品检定所，批号 803-9202)、脂蟾毒配基对照品 (中国药品生物制品检定所，批号 110718-200507)；甲醇、乙腈为色谱纯，磷酸等均为分析纯，水为三蒸水。
6、 收集了 12批不同产地的蟾酥药材，经鉴别均为蟾蜍科动物中华大蟾蜍 Bufo bufo gargarizans Cantor或黑眶蟾蜍 Bufo melanostictus Schneider的耳后腺及皮肤腺分泌的白色桨液。样品见表 1. 表 1 12批药材来源 Table 1 Origins of twelve batchs of samples 样品号 产地及来源 形状 采集时间 1 河南 块状 200703 2 四川 块状 200704 3 河南 块状 200611 4 河北 片状 200611 5 山东 片状 200703 6 湖北 片状 200703 7 辽宁 块状 200704 8
7、 湖南 块状 200704 9 湖南 块状 200704 10 河北 块状 200703 11 山东 块状 200608 12 山东临沂 块状 200610 2 方法与结果 2.1 薄层色谱 分析 2.1.1 供试品溶液 制备 取蟾酥药材 0.2g， 精密称定， 加乙醇 5mL，水浴加热回流 30min，取出，放冷，滤过，取续滤液，即得。 2.1.2 对照品溶液制备 精密称取华蟾酥毒基对照品和脂蟾毒配基对照品适量， 精密称定， 分别用乙醇溶解制备成均为 1mg mL -1的对照品溶液。 2.1.3 展开方法与显色 精密 吸取上述制备的样品和对照品溶液各 10L，分别点于同一硅 胶 G预制板上，
8、用 环己烷 -二氯甲烷 -丙酮 (2:1:1)展开系统进行展开，取出，晾干，再进行第二次展开，每次展距约 8cm，取出，晾干，喷以 10硫酸乙醇， 105 加热至斑点显色清晰，置紫外光灯 365nm下检视。 2.1.4 结果 从薄层色谱图（见图 1）结果可见，在 365nm紫外 灯下 可观察到 12个斑点，斑点分离度较好，显色清晰。不同产地的蟾酥斑点数目基本相同，而斑点颜色的深浅度和斑点大小因产地的不同而各有差异，主要表现在斑点 2、斑点 3、斑点 4、斑点 6和斑点 9上，特别是斑点 2（脂蟾毒配基）。可见，不同产地的蟾酥的组 分基本相同，但各成分的含量因产地不同而存在明显差异。 12批样品
9、中以脂蟾毒配基斑点大小进行排序，分别为 山东临沂 山东 河北 湖南 湖南 辽宁 湖北 山东 河北 河南 四川 河南 。 a b 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 图 1 不同产地蟾酥药材薄层色谱图（ 365nm紫外 灯下） a华蟾酥毒基对照品， b.脂蟾毒配基对照品， 1为 山东 ， 2为河北 ， 3为 山东临沂， 4为 湖南 ， 5为辽宁 ， 6为 湖南 ， 7为 河 南 ， 8为 湖北， 9为河 北 ， 10为 山东 ， 11为河南 ， 12为 四川。 2.2 高效液相色谱分析 2.2.1 色谱条件 色谱柱 ： Agilent ZORBAX SB-C18柱（ 4.625
10、0mm， 5m） ， 流动相 ： 乙腈 -0.01%H3PO4溶液 ， 梯度洗脱 ， 柱温 ： 25 ， 检测波长 ： 296nm， 分析时间 45min， 流速 ： 1mL min -1， 进样量 ：10L。 2.2.2 对照品溶液 制备 取 经五氧化二磷低温真空干燥 24小时的 华蟾酥毒基对照品和脂蟾毒配基对照品 适量 ，精密称 定 ，用甲醇溶解 定 容， 制成浓度为 0.0484mg mL-1的华蟾酥毒基和 0.0532mg mL-1的对照品溶液。 ：药材进行干燥粉碎后，称取药材粉末 0.2g，精密称定，加 80乙醇于 70水浴加热回流 90min，提取两次，每次 50mL，滤过，合并滤
11、液，并定容至 500mL，用 0.22m微孔滤膜滤过，备用。 2.2.4 HPLC梯度分析方法考察 对 蟾酥 HPLC梯度 分析方法进行了方法学考察，包括精密度、重复性、稳定性试验，各主要色谱峰相对保留时间和相对峰面积的 RSD值均 小于 2.0%， 符合 HPLC色谱 图谱技术 分析 要求。 2.2.5 不同产地蟾酥 HPLC图谱 梯度 分析 成分 比较 分别取 12批蟾酥药材，按照 2.2.3项下方法制备蟾酥样品的供试品溶液并按照 2.2.1色谱条件项下测定，记录 45min色谱图。通过比较各样品色谱图，并标示出 15个共有峰作为构成 液相色谱 稳定的特征峰，其中 14号峰为华蟾酥毒基，
12、15号峰为脂蟾毒配基， 12批蟾酥药材 HPLC色谱图谱见图 2。 图 2 12个产地蟾酥药材高效液相色谱分析图 1为河南 ， 2为 四川， 3为河南 ， 4为河北 ， 5为 山东 ， 6为 湖北， 7为辽宁， 8为 湖南 ， 9为湖南 ， 10为河北 ， 11为 山东 ， 12为 山东临沂 2.2.5 结果 从图 2可见， 12批 不同产地蟾酥药材具有相似的高效液相色谱峰貌， 不同产地蟾酥之间具有一致的特征性 ，反映蟾酥所含化学成分基本类似。 但所含成分含量存在明显差异 ，表现在3号、 4号、 6号、 7号、 8号、 9号、 14号（华蟾酥毒基）、 15号（脂蟾毒配基）峰上，特别是在 7号、
13、8号和 14号（华蟾酥毒基）、 15号峰（脂蟾毒配基）上，产地不同其含量差异明显，且 7号、 8号峰的含量与 14号、 15号峰的含量基本呈相反趋势， 14号和 15号峰含量越高 7号和 8号峰含量就越低，反之也然 。从 脂蟾毒配基和 华蟾酥毒基的含量看， 12批样品含量依次为： 山东临沂 山东 河北 湖南 湖南 辽宁 湖北 山东 河北 河南 四川 河南 。 2.3 华蟾酥毒基和脂蟾毒配基 有效成分含量 测定比较 按照 2005年版中华人民共和国药典一部蟾酥项下含量测定色谱条件 1进行测定。 2.3.1色谱条件 Agilent ZORBAX SB-C18柱（ 4.6150mm， 5m），流动相
14、 ： 0.5%KH2PO4(调 pH至3.20.05)溶液 -乙腈 (50:50)，流速 1mLmin-1，检测波长为 296nm。 2.3.2 线 性关系考察 分别精密吸取 2.2.2项下的 对照品溶液 1、 2、 4、 6、 8、 10L，按 2.3.1项下色谱条件测定峰面积积分值，以 对照品 进样量为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，得华蟾酥毒基在 0.0484g-0.484g范围内线性关系良好，其回归方程为 Y=695.25X-3.26， r=0.9993；脂蟾毒配基在 0.0532g-0.5320g范围内线性关系良好，其回归方程为 Y=657.42X-4.89， r=0.9998
15、。 2.3.3含量测定和结果 分别精密吸取 2.2.3项下的供试品溶液 10L注 入 高效液 相色谱仪，按 2.3.1项下色谱条件采用外标法进行测定，计算，结果见表 2. 表 2 12批次 蟾酥药材 华蟾酥毒基和脂蟾毒配基 含量测定结果 样品号 样品产地 华蟾酥毒基 % 脂蟾毒配基 % 1 河南 0.943% 0.198% 2 四川 0.940% 0.201% 3 河南 0.937% 0.203% 4 河北 2.43% 0.275% 5 山东 2.42% 0.291% 6 湖北 2.41% 0.307% 7 辽宁 4.89% 0.672% 8 湖南 3.94% 1.81% 9 湖南 4.00%
16、 1.86% 10 河北 4.06% 1.916% 11 山东 4.95% 6.67% 12 山东临沂 6.52% 7.55% 由表 2可见， 12个不同来源的蟾酥药材的测定结果表明，不同产地药材中均含有华蟾酥毒基和脂蟾毒配基两种成分，但含量差异较大， 以 产自 山东 临沂和山东 的蟾酥 有效成分 含量均较高，河北 、湖南 、 次之，河南 、 与四川的含量较低。 3 讨 论 3.1 曾用中国药典（ 2005年版一部）蟾酥项下的薄层鉴别方法，用环己烷 -氯仿 -丙酮 (4:4:3)展开系统进行一次展开并显色后 ，结果斑点分离不佳，且显色不清晰。故对展开剂比例进行调整，且由于氯仿毒性较大，替换为二
17、氯甲烷，最后以环己烷 -二氯甲烷 -丙酮 (2:1:1)比例展开两次，显色，斑点分离清晰，分离度较好。薄层色谱方法采用两次展开方式，有效地将多种成分较好地分离，更好地反映样品中所含组分的情况，可用于蟾酥药材的快速鉴别和质量分析。 3.2 曾进行流动相的选择，对乙腈 -水、甲醇 -水、甲醇 -磷酸液 、甲醇 -磷酸液 等的不同比例进行比较分析，以 乙腈 -0.01 H3PO4溶液为流动相洗脱最佳，且梯度洗脱能够较好地使样品中各色谱峰分离且出峰最多 ，基线较平 ，同时避免缓冲盐对色谱柱的伤害 。也对 C8和 C18色谱柱进行过比较，以 C18色谱柱的分离度高，峰型也较为对称。曾对蟾酥采用不同乙醇浓
18、度和甲醇 5、 6进行提取比较，结果以 80乙醇提取蟾酥结果最佳，因此，本文采用了 80乙醇对不同产地蟾酥进行了研究分析。 3.3 薄层色谱和 高效液相色谱研究结果表明， 不同产地蟾酥药材质量所含成分类型基本相似，但也存在明显的差异，其中以 脂蟾毒配基含量变化最为明显。 12批样品中以脂蟾毒配基斑点大小进行排序，分别为 山东临沂 山东 河北 湖南 湖南 辽宁 湖北 山东 河北 河南 四川 河南 。 从高效液相色谱图还可以看出其他成分存在的明显差异， 主要表现在 7号、 8号峰的含量与 14号（华蟾酥毒基）、 15号（脂蟾毒配基）峰 ，其含量 显示一定的 相反趋势 ，提示可能存在一定相关性 。
19、由研究结果可知， 蟾酥质量差异明显，蟾酥在制剂应用中应明确产地并做深层的质量跟踪控制，确保制剂疗效。 3.4 含量测定方面：通过比较 12批次蟾酥药材中的 华蟾酥毒基和脂蟾毒配基含量 ， 以产自山东 临沂和山东 的蟾酥有效成分含量均较高，河北 、湖南 、 次之，河南 、 与四川的含量较低，可见不同产地蟾酥质量参差不 齐。 3.4 本文方法稳定可行、重现性好，薄层色谱法和高效液相色谱法均能从不同角度上反映蟾酥的质量差异情况，可用于蟾酥药材 质量 鉴别及其 应用 。 参考文献 : 1 国家药典委员会 .中华人民共和国药典 S. (一部 ),北京 :化工出版社 , 2005.265-266. 2 付
20、兰 ,何树芸 ,潘德敏 .蟾酥不同炮制品蟾毒内酯的含量测定 J.中药材 ,1990,13(2):25 3 杜立颖 ,王爱民 ,王玺 ,等 .HPLC 法测定蟾酥内华蟾毒精和脂蟾毒配基 .沈阳药科大学学报 ,1997,14(1):33 4 袁旭江 ,霍务 贞 ,朱盛山 ,等 .广藿香 HPLC指纹图谱的初步研究 .中药新药与临床药理 ,2006,17(3):195 5袁旭江 ,沈嘉茵 ,朱盛山 .不同提取方法对蟾酥有效成分的影响 .上海中医药大学学报 ,2008,22(65):66-67 6沈嘉茵 ,袁旭江 ,朱盛山 ,等 .正交法对蟾酥提取工艺影响研究 .中国实验方剂学杂志 ,2008,14(2):27-28
