1、Click-iT EdU成像检测试剂盒 Page 1kFluor488 Click-iT EdU 成像检测试剂盒说明书修订日期：20160907产品编号：KGA331-100/KGA331-500/KGA331-1000Store at -20, protected from lightFor Research Use Only一、组份及保存温度组份 KGA331-100 KGA331-500 KGA331-1000 保存温度 稳定性组份A：EdU 0.2ml 1ml 2ml -20 组份B：kFluor488-azide 30l 530l 1030l-20 ，避光组份C：10 Click-i
2、T EdU反应缓冲液 1ml 5ml 10ml 2-8 组份D ：CuSO4 0.5ml 2.5ml 5ml 2-8 组份E：Click-iT EdU 缓冲液添加物 30mg 530mg 1030mg 2-8 组份F：Hoechst 33342 25l 125l 250l 2-8 按指定稳定保存可有效放置一年其他所需试剂 10mM PBS,pH7.2-7.6 中性多聚甲醛固定液（4%多聚甲醛in PBS） 2mg/ml甘氨酸溶液（去离子水配制） 促渗试剂（0.5% Triton X-100 in PBS） 3% BSA in PBS，pH7.2-7.6 去离子水 18 18-mm 盖玻片规格:
3、针对96孔板培养的细胞，KGA331-100可以提供至少100个孔反应的量；KGA331-500可以提供500 个孔反应的量，KGA331-1000 是可以提供1000个孔反应的大包装。（不同容器细胞成像的具体用量可参考附表1.EdU 培养基及染色反应液的使用量参考）荧光光谱数据: kFluor488-azide: 495/520nm; Hoechst 33342: 350/461nm, bound to DNA. Click-iT EdU成像检测试剂盒 Page 2二、产品介绍细胞增殖检测是评估细胞健康程度、遗传毒性及抗肿瘤药物效果的基础实验手段。最精确的检测细胞增殖方法是BrdU法。 Ed
4、U法检测试剂盒是brdu 方法的革命性突破。EdU （5-溴-2-脱氧尿嘧啶）试剂盒是一种嘧啶类似物，可以在DNA合成期整合入DNA 双链。 EdU法检测是基于“点击”反应，一种由铜催化的叠氮化合物和炔烃的原子共价反应。本试剂盒中，EdU 试剂含有炔烃，而 kFluor488染料试剂含有叠氮化合物。点击法的EdU标记增殖快速有效，易于使用。只需少量的叠氮化染料即可非常有效地标记出整合的EdU。标准化的戊二醛固定和去污剂促渗可以使检测试剂进入细胞，而brdu方法则需要DNA 变性（如酸变性、热变性或者用Dnase消化）去暴露BrdU，从而方便BrdU抗体结合。本试剂盒包含EdU 法检测所需要的所
5、有组份，可以检测细胞增殖与细胞周期分析。对于细胞周期的分析，试剂盒可以提供蓝色细胞核染料Hoechst33342。培养细胞可选：样本处理EdU孵育细胞细胞固定与促渗检测EdU可选：抗体孵育或其他细胞染色固定拍照及分析EdU成像检测工作流程Click-iT EdU成像检测试剂盒 Page 3Click-iT EdU成像检测试剂盒 Page 4三、实验操作步骤1、EdU标记细胞注意： EdU的标记浓度应根据所用的细胞类型做相应的优化选择，推荐客户以10M的EdU 初始浓度进行摸索。细胞培养基、细胞生长密度及细胞类型和其他实验条件都有可能影响细胞的标记效果。预实验中，我们建议客户设置一系列的EdU浓
6、度梯度，以确定最佳的合适您的细胞的实验浓度。您也可以参考本操作说明附表2.常见细胞系EdU 孵育时间设定参考以及附表3. 细胞实验EdU孵育浓度及时间参考。1.1 以每孔 41031105细胞接种于 96孔板中，进行您所需要的药物处理或者其他刺激处理。1.2 准备一份 2的EdU 工作液( 组份A)：以完全培养基稀释10mM的储液至合适的工作浓度。建议您以10M的初始工作浓度开始预实验。1.3 预热 2的EdU 工作液，加入等体积的培养基，使浓度变为1（如：需要得到10M的终浓度，应以新鲜培养基等体积加入到20M的EdU 工作液中。）1.4 合适时间合适条件孵育细胞，EdU孵育细胞的时间可以直
7、接用做测定细胞DNA合成的指标，时间点选择以及孵育时间的长度取决于细胞生长速率。通过短暂的EdU孵育进行的脉冲式标记细胞可以用于研究细胞周期动力学。2、细胞固定及促渗注意：本参考步骤是针对以4%中性多聚甲醛固定且以0.5% Triton X-100促渗操作样本而优化的操作方法，但本参考所介绍的步骤同样可用于其他类似操作的样本，如以甲醇固定以皂苷固定的样本等等。2.1 孵育完成后，去除培养基加入50l 4%中性多聚甲醛至各个孔的玻片上，室温孵育 15-30分钟后，去除固定液。2.2 每孔加入 50l 2mg/ml的甘氨酸溶液，室温孵育5分钟，中和残留的固定液。2.3 以每孔 0.1ml 3% B
8、SA in PBS 的洗涤液洗涤细胞2次。 2.4 去除洗涤液，加入0.1ml 0.5% Triton X-100 in PBS到每个孔中，室温孵育20分钟。3、EdU检测注意：本参考步骤每个孔反应使用100L的Click-iT 反应混合物。用户可以根据自己的样本情况调整等比例减少所用的溶液体积。3.1 准备 1 Click-iT EdU反应缓冲液（组份C）:转移10组份C试剂以去离子水稀释 10倍即可。3.2 制备一份 5的Click-iT EdU反应添加物储液（组份E）：加0.3mL去离子水至含30mg的E组份试管中，混匀至全部溶解。使用后，剩余储液存放在-20，可保存一年，溶液一旦呈现棕
9、色，则说明有效成分降解不能再用（注意：不同规格的组份E均按照此比例加去离子水溶解为5储液备用）。3.3 准备1Click-iT EdU缓冲液添加物（见表格2）：以去离子水稀释5 储液至1，溶液应新鲜配制，当天用完。Click-iT EdU成像检测试剂盒 Page 53.4 依据表 2准备 Click-iT反应混合物。表2要求添加的组份对于反应来说非常重要，否则反应无法有效进行。表2. Click-iT 反应混合物：3.5 去除促渗液，以每孔0.1mL的3%BSA in PBS的洗涤液洗涤2次，去除洗涤液。3.6 加入 0.1mL Click-iT反应混合物至每个孔，简短摇晃培养板以确保反应混合
10、物可以均匀覆盖细胞。3.7 室温避光孵育30min。3.8 除去反应混合物，每孔以0.1mL 3%BSA in PBS洗涤2次，去除洗涤液。 对于核染色，可以进行DNA复染。如其他无特别要求，即可进行拍照分析。4、DNA复染4.1 以0.1mL PBS洗涤每孔1次，去掉洗涤液。4.2 以PBS 稀释Hoechst33342 （组份F）储液1：2000 至1Hoechst33342溶液，终浓度为5 g/mL。4.3 每孔加 0.1mL 1Hoechst33342溶液，室温避光孵育15-30min 。除去Hoechst33342溶液。4.4 0.1mL PBS洗涤每孔2次，去除洗涤液。5、成像及分
11、析Table 3. 荧光发射光谱.Fluorophore Excitation (nm) Emission (nm)kFluor488 495 520Hoechst 33342, bound to DNA 350 461附录：表1 EdU培养基及染色反应液的使用量参考96孔板 * 48孔板 24孔板 12孔板 6孔板 5.5 cm 小皿EdU培养基 100 l 150 l 200 l 500 l 1ml 2 mL染色反应液 100 l 150 l 200 l 500 l 1ml 2 mL表2 常见细胞系EdU孵育时间设定参考反应组份 以10 个孔的样本数为例1Click-iT反应缓冲液（组份C
12、） 860l CuSO4 (组份D) 40lkFluor488-azide (组份 B) 3l1反应缓冲液添加物 (步骤 3.3所准备) 100l总体积 1mlClick-iT EdU成像检测试剂盒 Page 63T3 Hela HEK293*细胞系 人胚胎细胞 酵母细胞 人成纤维细胞 人宫颈癌细胞 人胚肾细胞系 人神经细胞细胞周期 30min 3h 18h 21h 25h 5d孵育时间 5min 20min 2h 2h 2h 1d表3 细胞实验EdU 孵育浓度及时间参考PubMed ID Reference Cell line Concentration Time18272492 Salic
13、 A, et al. PNAS. 2008 NIH3T3, Hela 10 nM10 M 1 hr18521918 Cappella P,et al. Cytometry A. 2008 HL-60, A2780, U2OS 110 M 30 min18996411 Chehrehasa F, et al. J Neurosci Methods. 2009 Neurospheres 120 M 24 hr19179371 Limsirichaikul S, et al. Nucleic Acids Res. 2009 Primary fibroblasts 10 M 1,2,4 hr19253
14、396 Warren M, et al. Dev Dyn. 2009 Chick embryos 10 M2 mM 4 hr19647746 Yu Y, et al. J Immunol Methods. 2009 Spleen cells 50 M 24 hr19544417 Momcilovi O, et al. Stem Cells. 2009 Human ES cells 10 M 30 min20080700 Cinquin O, et al. PNAS. 2010 emb-30 1 M 12 hr20025889 Han W, et al. Life Sci. 2009 VSMC
15、50 M 2 hr20659708 Huang C, et al. J Genet Genomics. 2010 ESC 50 M 2 hr21310713 Hua H, et al. Nucleic Acids Res. 2011 fission yeast strains 10 M 3 hr20824490 Lv L, et al. Mol Cell Biochem. 2011 EJ cells 50 M 4hr21248284 Yang S, et al. Biol Reprod. 2011 GC cells 50 M 2 hr21227924 Zhang YW, et al. Nucl
16、eic Acids Res. 2011 U2OS, HT29 30 M 90 min21829621 Guo T, et al. PloS One. 2011 HIT-T15 50 M 4hr21980430 Zeng T, et al. PloS One. 2011 MCF-10A 25 M 2hr22012572 Ding D, et al. Int Orthop. 2011 C3H10T1/2 10 M 24hr22000787 Zeng W, et al. Biomaterials. 2011 EPC 50 M 4hr21913215 Xue Z, et al. J Cell Biochem. 2011 SGC7901 25 M 24hr22016038 Peng F, et al. Lasers Med Sci. 2011 MSC 50 M 2hr21878637 Li D, et al. J Biol Chem. 2011 HCC 50 M 2hr
