1、临床常见病原真菌耐药监测,北京大学第一医院皮肤科北京大学真菌和真菌病研究中心李若瑜,第16期国家级继续医学教育项目（2015），皮肤真菌病基础和临床研究进展讲习班,内 容,药敏试验的常用方法及应用抗真菌药物的耐药监测现状抗真菌药物的耐药机制研究近况,抗真菌药物的种类,麦角固醇,多烯类如 两性霉素 B,唑类如 氟康唑伊曲康唑伏立康唑泊沙康唑,核苷类如 5-氟胞嘧啶,角鲨烯,羊毛甾醇,K+Mg 2+,丙烯胺类如 特比萘芬,乙酰辅酶A,棘白菌素 类如 卡泊芬净 米卡芬净 安尼芬净,尼可霉素,核酸合成,葡聚糖合成,甲壳质合成,侵袭性真菌感染逐渐增多,念珠菌院内感染第位的病原菌曲霉第2位的病原真菌接合菌
2、(毛霉)隐球菌,临床有增多趋势的条件性真菌,非白念念珠菌感染毛孢子菌感染地霉感染镰刀菌感染枝顶孢霉感染暗色真菌感染马尔尼菲青霉,真菌耐药菌株的不断出现.,耐氟康唑的白念珠菌 耐伊曲康唑、伏立康唑以及泊沙康唑的丝状真菌 耐两性霉素B丝状真菌 耐卡泊芬净的念珠菌株,药敏试验的作用,评价新型抗真菌药物的体外抗菌活性，开发新药;检测临床病原真菌对不同抗真菌药物的体外敏感性;指导临床用药的选择, 监测疗效,发现耐药株.,药敏试验测定方法,液基稀释法CLSI M27-A3，M38-A2琼脂稀释法纸片扩散法CLSI M44-A2Etest法, ATB Fungus2,3联合用药：棋盘法棘白菌素类,标准化的药
3、敏方法日趋成熟,CLSI （NCCLS)制定的标准被普遍接受M27A3 酵母菌肉汤稀释法体外抗真菌药敏试验参考方法 _棘白菌素类折点M38A2丝状真菌肉汤稀释法体外抗真菌药敏试验参考方法 _新质控株、皮肤癣菌M44A2酵母菌纸片扩散法抗真菌药敏试验EUCAST标准（European Committee for Antibiotic Susceptibility Testing）与CLSI取得一致,酵母菌药敏试验,建立了对以下药物的测定方法: 氟康唑、伊曲康唑、 5-FC、两性霉素B、伏立康唑;体外-体内疗效关系已初步建立,特别对氟康唑;已提出判定折点及其解释.,丝状真菌药敏试验,产孢菌种已建立
4、方法;针对目前临床常用药物(棘白菌素);但尚未建立折点;体外体内的一致性尚在探讨中;检测烟曲霉菌 对唑类药物的敏感性有意义; 两性霉素B 解释仍然困难;详细鉴定到种水平是必要的;如土曲霉, 尖端赛多孢子菌, 和多育赛多孢一般对两性霉素B 耐药.,Etest和其它商品化方法,优点: 使用简便；对酵母菌比较稳定, 丝状菌尚在研究中；与CLSI方法有较高一致性；但对唑类的MICs 常由于存在拖尾难以判断；其它的快速检测试剂尚需进一步验证, 如ROSCO纸片法。,CLSI方案测定念珠菌体外敏感试验折点,*数据主要基于粘膜疾病,M-44A方案测定念珠菌体外敏感试验折点,药敏试验的应用指征,尽可能将临床分
5、离株鉴定到种； 意义：曲霉中敏感性不同，土曲、新种无菌部位的念珠菌，常规做氟康唑和 5-FC药敏；黏膜感染，治疗失败后应行药敏；天然耐药者不测.,内 容,药敏试验的常用方法及应用抗真菌药物的耐药监测现状抗真菌药物的耐药机制研究近况,ARTEMIS DISK药敏监测来自全球40个国家134个研究点,氟康唑:205,329株酵母菌(1997至2005)；伏立康唑:147,776株酵母菌(2001至2005)；方法：CLSI M44-A纸片扩散法结果：BIOMIC图象分析系统自动判读。,Pfaller et al. J Clin Microbiol 2007, Vol.45, P.1735-45,A
6、RTEMIS DISK 监测结果,90.1%的念珠菌株对氟康唑敏感，22个种中有10个种出现敏感性降低(敏感度75% )，对氟康唑耐药的种主要为光滑念珠菌和克柔念珠菌。94.8%的念珠菌对伏立康唑敏感，3.1%耐药。对氟康唑耐药的白念珠菌、光滑念珠菌、热带念珠菌和皱落念珠菌菌株中对伏立康唑保持敏感的比例不足30% 。非念珠菌酵母菌(8,821 株)，对氟康唑不敏感，除红酵母菌对伏立康唑敏感。本研究证实了唑类药物对临床最常见酵母菌的广谱抗菌活性，但也发现一些少见酵母菌的敏感性下降。,Pfaller et al. J Clin Microbiol 2007, Vol.45, P.1735-45,念
7、珠菌血症病原菌的药敏,China-Scan项目：2009年11月至2011年4月，全国63家医院67个ICU病房共同参加，249例念珠菌血症了解我国ICU患者中侵袭性念珠菌血症病原菌的体外药物敏感性特征,判断抗真菌药的敏感性和耐药性,*数据主要基于粘膜疾病,The CLSI breakpoint for echinocandins=2 g/ml,药敏试验结果（MIC90）,%,%,g/ml,%,Fluconazole不敏感念珠菌对Voriconazole的药敏数据,Pfaller MA, JCM, 2010,48(4): 13661377,唑类交叉耐药比例升高,全球念珠菌监测体外药敏数据(19
8、97-2007),荷兰伊曲康唑耐药菌比例有所上升,Year,% R,N,Snelders et al. PLoS Medicine. 2008;5:e219.,L98H (TR) was the dominant resistance mechanismIsolates genetically distinct but clustered.,曲霉临床菌株的分离鉴定,来源：北大医院皮科真菌室受检标本时间：2008年7月到2011年11月 鉴定：所有菌株均经标准的曲霉鉴定方法进行鉴定，即在麦芽琼脂和查氏琼脂平皿25度培养7天后，经形态学鉴定（据齐祖同主编中国真菌志-第5卷：曲霉属及其相关有性型，科
9、学出版社，1997年）菌种分布：烟曲霉130株，黄曲霉58株，土曲霉16株，其它9株,药物敏感性测定及结果,测定方法：CLSI M38-A方案和E-试验结果1株烟曲霉对ITC耐药而对VRC敏感1株烟曲霉对ITC和VRC均耐药1株黄曲霉对VRC耐药而对ITC敏感,内 容,药敏试验的常用方法及应用抗真菌药物的耐药监测现状抗真菌药物的耐药机制研究近况,什么情况下容易发生耐药?,P.Verweij, TIMM, 2007,常见耐药菌及其类型,ERG11基因突变ERG11基因过表达ERG3、ERG5基因突变药物泵基因过表达,念珠菌唑类药物耐药机制,Clin Microbiol Rev 1998; 11:
10、 382,烟曲霉菌耐药机制,Chamilos G, Kontoyiannis DP., Drug Resistance Updates 8 (2005) 344358,AF1，2001年12月，第一次就诊； AF2，2002年6月，ICZ 200mg/d治疗6个月后； AF3，2002年8月，停药2个月以后；ICZ静脉给药，200mg bid治疗两周，然后口服，200mg/d继续治疗，其间分离到以下三株： AF4，2002年12月； AF5，2003年1月； AF6，2003年2月；,烟曲霉唑类药物耐药系列分离株,Chen & Li,et al. JAC, 2005.,MIC of itrac
11、onazole against 6 isolates,AF2的CYP51A第220位蛋氨酸被异亮氨酸替代(M220I),AF4-6的CYP51A第54位的甘氨酸被精氨酸替代(G54R),药物流出泵及唑类药物靶酶基因相对表达水平,Mann P. A, et al .Antimicrob. Agents Chemother, 2003,47: 577-581.Diaz-Guerra T. M,et al. Antimicrob. Agents Chemother, 2003,47: 1120-1124 Nascimento A. M,et al. Antimicrob. Agents Chemot
12、her, 2003,47: 1719-1726Mellado E. et al. Antimicrob. Agents Chemother, 2004,48: 2747-2750,烟曲霉菌 cyp51A 基因突变的报道,有关三唑类耐药的氨基酸替换,许多三唑类耐药是因为在 CYP51A 基因启动子 L89H 与2个拷贝的34 bp片段串联相结合。,药物主动外排泵的变化,Update on azole resistance in Aspergillus fumigatus,曲霉与唑类,In vitro “reduced susceptibility” remains 0-5% in most la
13、rge surveys, often using itraconazoleMost data for A. fumigatus sectionCase reports and case series suggest that multiply-azole resistant Aspergillus could emerge? association with agricultural azole use,Rodriguez-Tudela, et al. Antimicrob Agents Chemother. 2008;52:2468.Verweij, et al. N Engl J Med.
14、 2007;356:1481-83.Arendrup, et al. Antimicrob Agents Chemother. 2008;52:3504-11.Howard, et al. Int J Antimicrob Agents Chemother. 2006;28:450-53.Snelders et al. PLoS Medicine. 2008;5:e219.,唑类药物对曲霉的流行病学折点,Espinel-Ingroff et al. JCM. 2010; submitted.,Development of Azole resistance of A. fumigatus,P.V
15、erweij, TIMM, 2007,耐药曲霉感染的病例报告（1）,女性，10岁，急淋，在化疗过程中出现高热；给予头孢匹胺等抗细菌、氟康唑预防真菌感染处理；肺部CT检示：肺内结节灶；痰液真菌镜检示：分支分隔的菌丝，培养示烟曲霉，故改用伏立康唑；治疗9天后，体温38.1度，咳嗽减轻；继续治疗一周后复查CT见肺脏病变减轻不明显，故而给予AMB，20mg/d，一周后无发热、咳嗽，肺内病变未扩大；继续治疗一周后无明显症状，CT示肺内结节局限，故停用AMB而出院。,临床菌株及药物敏感性特点（1）,烟曲霉唑类药物耐药机制（2）,未见以往的G54、M220、G448、G138（后二者与ITC及VRC交叉耐药
16、相关）Y46F、V172M、T248N、E255D、K427E:文献报告与耐药无关TR/L98H: 导致ITC耐药、VRC中度敏感；故L190P与耐药无关，而L307P的作用需阐明 Qiao, 2008；Mellado, 2007；Howard,2006； Kontoyiannis, 2005； Evelline, 2008,小 结,体外药物敏感性结果与方法有关需要统一和 规范；长期监测意义重要菌种动态变化和耐药监测；可以作为临床经验用药的依据；当治疗效果不满意时应考虑做体外药敏试验；对于有耐药可能的菌株应及时做药敏试验；警惕获得性耐药的发生白念、烟曲霉等。,联系方式: , 83573056,谢谢大家!,
