1、 基金项目：国家自然基金专项项目/科学部主任基金项目（30940020）作者简介：罗冬梅，1986 年生，华南师范大学生物光子学研究院硕士研究生。 （电话）13560232273；（电子邮箱）*通讯作者：金鹰，1967 年生，华南师范大学生物光子学研究院副教授。 （电话）13610047142；（电子邮箱）肿瘤细胞 DNA 样品基于二次谐波发生（SHG）的非线性光谱学成像罗冬梅 1，邓小元 1，卓双木 2，谭淑雯 1，庄正飞 1，金鹰 1*（1.华南师范大学生物光子学研究院，广州 510631；2.福建师范大学医学光电科学与技术重点实验室，福州 350007）摘 要：二次谐波的产生是一个二阶非
2、线性光学过程，这个过程只发生在中心对称系数不为零的非中心对称区域。利用二次谐波显微技术可以对各种具有内源性信号的生物组织进行无损伤实时成像，如结缔组织的胶原纤维或肌细胞的肌动球蛋白。在生物化学和结构生物学中，虽然 DNA 是由脱氧核糖核苷酸构成而蛋白质是由氨基酸残基组成，但是 DNA 和蛋白质大分子高级结构的形成机制是相似的。本文利用光谱学成像技术对不同 DNA 样品进行检测，来获取 DNA 样品的 SHG 信号并进行高解析度成像。这些 DNA 样品包括基因组 DNA 溶液、细胞核提取物以及培养细胞的细胞核。实验结果表明在常规条件下可以获得基因组 DNA 溶液和细胞核提取物的 SHG 信号，但
3、几乎观测不到来自培养细胞核区的 SHG 信号。通过在培养基中添加少量无水乙醇（体积比小于 5%） ，可以在培养细胞的细胞核区域检测到 SHG 信号。我们推测在培养细胞中乙醇和 DNA 相互作用引起 DNA 分子构象发生变化，这些变化可能导致了 DNA 分子非线性光学性质的改变。关键词：二次谐波发生；基因组 DNA；细胞核提取物；培养肿瘤细胞；乙醇中图分类号：O 433; Q 523文献标识码：ANonlinear spectral imaging of DNA specimens derived from tumor cells based on second harmonic generat
4、ionLuo Dong-Mei1, Deng Xiao-Yuan1, Zhuo Shuang-Mu2, Tan Shu-wen1, Zhuang Zheng-Fei1, Jin Ying1*(1. College of Biophotonics of South China Normal University, Guangzhou 510631, China;2. Key Laboratory of Optoelectronic Science and Technology for Medicine of Fujian Normal University, Fuzhou 350007, Chi
5、na)Abstract: Second harmonic generation (SHG) is a second-order nonlinear optical process that has symmetry constraints confining signal to regions lacking a center of symmetry. Using SHG microscopy, a variety of tissue structures have noninvasively been imaged by virtue of intrinsic signal generate
6、d by structured proteins such as collagen fibrils in connective tissues or the actomyosin lattice of muscle cells. In biochemistry and structure biology, the high-level structures of DNA and protein macro-molecules are similar in constructing mechanism, although DNAs consist of deoxynucleotides and
7、proteins of amino acid residues. The principal purpose of present work is to detect the SHG signal from different DNA samples by spectral imaging technology based on two-photon excited fluorescence (TPEF) and SHG. These DNA samples include the solution of genomic DNA and extracted nuclei, and cultur
8、ed living cells. Results show that we can obtain the SHG signal from solution of genomic DNA and extracted nuclei in routine condition, but nothing from cultured cell nuclei. After adding a little of absolute ethanol (less than 5% by volume) in culture medium, the SHG signal is detectable in the int
9、erest region of nuclei. The findings suggest that the interaction between ethanol and DNA in living cell gives rise to the shift of molecular conformation, and this shift change some nonlinear optical properties of DNA molecules.Key words: Second harmonic generation; genomic DNA; extracted nuclei; c
10、ultured tumor cell; ethanol双光子激发荧光成像（Two-photon excited fluorescence imaging，TPEF ） 1是上世纪 90年代发展起来的一种非线性显微成像技术，它是一种基于细胞或生物组织中荧光团对两个光子（具有双倍于单光子激发波长）的同时吸收然后再发射的成像过程。由于双光子激发只发生在焦点附近的极小区域，故无需共焦小孔（confocal pinhole）即可实现三维高分辨成像，可降低在光学成像中的荧光漂白效应，减少光化学毒性。其成像可采用近红外的超快激光作为光源，组织吸收和散色效应小，具有成像深度深、对生物体损伤小、分辨率高等优点。
11、虽然 TPEF 成像具有一系列优点，但它仍不能消除焦点内生物组织的光漂白和光损伤。近年来发展起来的二次谐波（Second harmonic generation, SHG） 2成像技术克服了这一缺点，它利用超快激光脉冲与介质相互作用产生的倍频相干辐射作为图像信号来源，具有高分辨、高对比度的三维成像能力。在成像质量和光损方面有了显著提高，是一种理想的非侵入生物活体的成像方法。其成像过程中无能量吸收，对生物体无光损伤和光致毒，且生物组织的许多内在结构无需外加分子探针即可产生较强的 SHG 信号，可消除染料致毒的影响。同时，二次谐波显微镜不受前向发射性质的限制，可以两个方向收集信号，因此很容易与双光
12、子激发荧光显微镜 TPEF、OCT（Optical coherence tomography）等联合使用，进行成像比较，实现信号互补。SHG 和 TPEF 的激发强度与激发光的平方成正比，两种显微方法的空间分辨率相当，意味着能够从同一装置上得到这两种信号的对照模式，除了使用不同的滤光片外，二次谐波显微成像和双光子激发荧光显微成像在系统结构上完全兼容。近年来，二次谐波-双光子（ SHG-TPEF）联合成像技术已经被广泛应用于生物组织和细胞的研究 3-5。 二次谐波技术很早就被应用于生物组织成像 6。其后，在多种生物组织中都可检测到SHG 信号，如角膜 7 、鼠尾肌腱 8和牛的 I 型 Achil
13、les 腱、人的皮肤 9等。此外，手性分子如核酸（DNA 或 RNA） 、蛋白质、糖元、淀粉、纤维素、磷脂等都具有手性，而它们的单体如核苷酸、氨基酸等，也都是手性分子，手性分子具有非中心对称的结构，可以产生SHG 信号，因此对核酸进行二次谐波显微成像成为可能。早期研究表明，在商品化的DNA 样品 10和经过固定处理的前列腺癌细胞样品 11中检测到了 DNA 产生的 SHG 信号。本文以体外培养的肿瘤细胞为实验对象，应用光谱成像技术对新鲜提取的基因组DNA、细胞核提取物和培养状态的肿瘤细胞进行光谱学成像，在此基础上讨论乙醇对DNA 构象可能存在的潜在影响。1 材料与方法1.1 实验装置实验装置使
14、用多光子激光扫描共聚焦显微成像系统（Fig.1） 。该系统由飞秒激光系统、扫描显微系统、探测系统三部分组成。飞秒激光系统由高能量的二极泵源固体激光器(VerdiV-10)作为激发光源、美国 Coherent 公司生产锁模钛宝石 (Ti：Sapphire Laser，Mira-900F)作为激光工作物质和声光调制器(AOM)三部分组成。声光调制器（AOM）用来调节激光的功率，激光的偏振方向为水平偏振，光纤耦合。波长可调协范围为 700nm980 nm，脉冲宽度约为 110 fs，重复频率 76 MHz。扫描显微系统是由德国 Zeiss 公司生产的LSM510 Axiovert 200 倒置激光扫
15、描共聚焦显微镜，实验所用探测系统配置的是 META 探测器。图 1 多通道非线性光学实验装置原理图Figure1 Schematic of multimode nonlinear optical imaging system钛宝石飞秒激光器发出的超短脉冲激光通过声光调制器（AOM）后到达双光子激光扫描显微镜作为激发光，经过主二向色性光束分束器（MDBS）由油浸物镜（63，N.A.=1.4）聚焦到样品上，样品在基频光激发下产生背向二次谐波再经油浸物镜收集，经过红外光束滤色片（IR Block：Zeiss KP650）滤除漫反射的基频光后将激发光输送到 META 探测器，由探测器探测后转变为电信号
16、传输至计算机。实验探测系统配置了 META 探测器，它是由一个高质量的反射光栅和一个 32 通道的光电倍增管（photomultiplier tube, PMT）阵列组成。该系统有多通道成像模式和光谱成像模式两个成像模式，这两个成像模式均使用 META 探测器获取图像。其中多通道成像模式有八个独立的通道，通过设置相应的参数可检测样品 382714nm 波段的发射光信号并得到该波段的光学二次谐波-双光子二维图像；光谱成像模式可以记录相应波段的光学二次谐波-双光子荧光图像的光谱。本文结合这两种成像模式获取样品的多通道非线性二次谐波- 双光子图像及其相应的光谱。1.2 样品制备人肝癌细胞系 BEL-
17、7402（中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心） ，37快速复苏，洗涤后接种于含生长在含 10%胎牛血清，100U/mL 的青霉素及链霉素的DMEM (Gilbco Invitrogen)完全培养液中，37、5%CO 2 培养箱中培养。根据细胞生长状况更换培养液或进行传代培养。传代培养时用 0.25%胰蛋白酶（含 0.02%EDTA）进行消化，经洗涤后，每培养瓶（25ml）的接种量约为 1105 个细胞。收集处于对数生长期的肿瘤细胞用于基因组 DNA 和细胞核的提取。用于 SHG 成像的培养肿瘤细胞提前一天接种于共焦显微镜专用培养皿（NEST, GBD-35-15） 。根据操作手册，利用组
18、织/细胞基因组 DNA 快速提取试剂盒 (Dongsheng, Guangzhou, China)提取肿瘤细胞的基因组 DNA；利用组织/ 细胞细胞核快速提取试剂盒 (Solarbio, Beijing, China) 提取肿瘤细胞的细胞核。1.3 SHG 成像实验前首先开启激光器和显微镜，激光器预热约两小时稳定工作后开始实验。分别将实验样品置于显微镜下进行观察，首先找到样品分散良好的视野，将荧光显微镜转到扫描的位置，然后不断缩小扫描范围，以获得完整清晰的图像，观察目标样品的细微结构。选择两个通道来采集和记录被检测样品的二次谐波-双光子荧光信号获得该样品的二次谐波-双光子荧光成像图像。系统自带
19、工具调焦平台(HRZ 200 stage, Carl Zeiss)用来改变焦点的位置，得以在不同区域处成像。用 ROI 工具获取各个区域处二次谐波信号的光强分布，用Histo 工具获得各个区域处二次谐波信号的平均光强。从 382nm 处( 设定后保持不变)开始扫描，每增加 10nm 扫描一次直到没有信号，获得了不同波长处的二次谐波-双光子荧光成像，与此同时光谱成像模式记录相应的光谱。LSM 510 Image Examiner 软件处理获得的图像，调整图像的对比度、亮度对图像进行进一步的处理以期获得较好的图像。2 结果2.1 基因组 DNA 溶液的发射光谱经紫外分光光度计测量，基因组 DNA
20、溶液的浓度为 30g/ml，A260/A280=1.90，符合实验要求。图 2 为实验中得到的肝癌细胞基因组 DNA 的二次谐波-双光子荧光发射光谱。实验中使用激发光波长为 800nm、功率为 10mW 的飞秒激光对肝癌细胞 DNA 进行扫描，光谱信号变化范围为 382714nm。从图中可以看出基因组 DNA 溶液在 404nm 和 639nm 处各有一个波峰，其中 404nm 处的波峰是来自于 SHG 的信号，639nm 处的波峰是来自于TPEF 的信号。该 DNA 样品的光谱学成像在整个扫描窗口中显示为均质的背景，表明DNA 分子在溶液中均匀分布（结果未显示） 。图 2 基因组 DNA 溶
21、液的二次谐波光谱Figure 2 SHG-TPEF Spectra of genomic DNA solution2.2 细胞核提取物的成像与光谱为了获得肝癌细胞核提取物的二次谐波信号，实验中对提取出来的肝癌细胞核进行了二次谐波-双光子成像扫描并作出了相应的发射光谱图。图 3（a）和图 3（b）是肝癌细胞核提取物双光子二次谐波成像，图 3（c）是相应的发射光谱。其中图 3（b）的扫描区域是图 3（a）扫描区域的 4.5 倍，即放大了 4.5 倍。实验中激发光波长、激发功率及光谱信号变化范围同上(2.1)。从图 3（a）和图 3（b）中可以看出肝癌细胞核提取物具有很强的二次谐波信号，相应的光谱图
22、也显示肝癌细胞核提取物的 SHG-TPEF 信噪比较高。图 3 细胞核提取物的二次谐波-双光子荧光成像（a, b）及其相应的发射光谱（c）Figure 3 SHG-TPEF imaging of the extraction of the hepatocellular carcinoma cells (HCC) nuclei (a, b) and the corresponding emission spectra(c)2.3 培养细胞的 SHG/TPEF 成像在未改变任何实验条件的情况下，用同样的方法对培养状态下的肿瘤细胞的细胞核区域进行光谱扫描时，几乎无法获得可以识别的 SHG 信号。考虑
23、到基因组 DNA 和细胞核提取过程中广泛使用有机溶剂可能是造成 DNA 分子光学特性改变的因素，因此尝试在实验中向细胞培养液中添加少量的无水乙醇，具体步骤是：在培养液中滴入 4 滴无水乙醇溶液（体积比5%） ，约 3 分钟后进行光谱扫描。图 4（a）和图 4（b）分别为不添加乙醇的肝癌细胞和添加了无水乙醇的肝癌细胞的二次谐波- 双光子成像，图 3(c)为对应的光谱图。从图(a) 和图(b)中可以看出添加了乙醇的肝癌细胞的二次谐波-双光子成像明显强于未添加乙醇的肝癌细胞的二次谐波- 双光子成像,相应的光谱显示未添加乙醇的样品无 SHG 信号，添加乙醇的样品在激发光的半波长 404nm 处有波峰，
24、此为 SHG 信号。图 4 肝癌细胞的二次谐波 -双光子成像 (a)和添加乙醇的肝癌细胞的二次谐波-双光子成像(b)及其相应的发射光谱(c)Figure 4 SHG-TPEF images from the HCC (a) and the HCC of adding ethanol (b), the corresponding emission spectra are shown in (c).The red box is the region of interest of nuclei of the cell, six regions of interest are detected in
25、(a) and eight regions of interest are detected in (b), the corresponding spectra are separately made according to the average of these regions of interest in (a) and (b)3 讨论二次谐波-双光子共聚焦显微技术是近年来发展起来的观察微观世界和生物细胞结构的有力工具。它最大的优点探测深度深，对生物体的损伤小，时间空间分辨率高以及对结构的对称性敏感等 12-13。我们采用二次谐波- 双光子共聚焦显微技术对三组 DNA 样品进行观察，实
26、验结果显示在常规条件下即可观测到基因组 DNA 和细胞核提取物的 SHG 信号，但却未检测到培养细胞细胞核区的 SHG 信号，当在培养基中添加了少量无水乙醇后可观测到其 SHG 信号。由于 DNA 大分子具有非中心对称的手性结构 12，且其反向平行的双螺旋结构造成的准相位匹配（Pseudo-phasematching）使其能够产生二次谐波 10，因此可被作为产生 SHG的标本。早期的研究发现，在商品化的 DNA 样品 10和经过固定处理的前列腺癌细胞样品11中检测到了 DNA 产生的 SHG 信号，其中 Sheppard10等人利用 SHG 显微成像观察到了鲱鱼精 DNA 在蒸馏水中的 SHG
27、 成像， 而庄正飞 11等人则利用 SHG-TPEF 显微成像技术获得了前列腺组织细胞细胞核切片的 SHG 信号。本实验 2.1 和 2.2 的 DNA 样本均来自新鲜培养的肿瘤细胞，实验结果再次说明了基因组 DNA 和细胞核均可以产生较强的 SHG 信号。2.1 的光谱图中在 639nm 处还有一个波峰，这是来自于卟啉及其衍生物的 TPEF 信号14-15，细胞中的细胞色素、血红素等生物大分子均含有卟啉，卟啉可以与 DNA 结合并发生相互作用 16-17，故可能是在 DNA 提取过程中细胞中的卟啉大分子与 DNA 结合很难被完全洗脱残留在 DNA 溶液中造成在 639nm 处有一个波峰。 2
28、.2 的光谱图中 SHG-TPEF 信噪比较 2.1 高，由于在真核生物，DNA 以非常致密的形式存在于细胞核内，能够以多种形态（超螺旋和环形等）构象存在于细胞核中，而基因组 DNA 是以线性双链存在于溶液中，其 DNA 致密程度远低于细胞核 DNA，故基因组 DNA 的 SHG-TPEF 信噪比较细胞核提取物的 SHG-TPEF 信噪比低。理论研究表明，二次谐波的产生必须满足两个条件，一是介质必须具有非中心对称结构(Non-centrosymmetric structures)，二是必须满足相位匹配（Relaxed phase matching）的条件 3-4,18。2.1 和 2.2 验证
29、了 DNA 分子是能够满足发生的条件的，但从 2.3 （a）可以看出在常规培养的肿瘤细胞的核区几乎无法检测到 DNA 的 SHG 信号，但加入乙醇后（唯一的条件改变）却可以观察到其 SHG，推测可能是乙醇诱导活细胞内 DNA 构象发生了变化致使 DNA 的非线性光学特性发生改变从而使得变构后的 DNA 满足了产生 SHG 的条件，并最终探测到了其 SHG 信号。目前，关于乙醇诱导溶液中 DNA 分子构象之间的转变已经被广泛研究 19-22，加入乙醇到 DNA 溶液中使溶液中水活性降低，致使结合到 DNA 上的水分子数减少，原来被水分子支撑而伸展的 DNA 沟槽收缩，大沟槽变得更窄更深，小沟槽变
30、得更宽更浅，使 DNA 整体外形结构变得更短，从而导致 DNA 构象由 B 型转化为 A 型，这种构型的转变将改变双螺旋结构中大沟槽和小沟槽的氢键类型 23-25。在体内，这种类型的影响取决于与 DNA 结合的蛋白质 14-15,18。研究表明，DNA 随着乙醇浓度的增大稳定性会降低 22，推测当加入乙醇到培养的细胞中，乙醇小分子会通过核孔进入到细胞核内，致使 DNA 的稳定性降低从而使 DNA 与蛋白质的结合松散，使双链处于较松散的状态，有利于 DNA 与 RNA 的结合致使构象发生改变。在活细胞中，由于细胞本身不满足非中心对称结构，每个核苷酸分子产生的二次谐波相互叠加抵消使得我们在实验中并
31、未观测到 SHG 的产生。加入乙醇分子后，分子表面电荷特性发生改变以及分子螺旋构象形态发生改变，使得每个分子在同样入射光的激发下所产生的超级化强度的方向与之前相比发生改变，进而每个分子产生的二次谐波的方向也发生改变，在我们观察的生物组织区域内，所有的二次谐波相位一致而相互干涉加强，满足相位匹配原理 18，使得我们在加入乙醇后观察到了 SHG。由此，反推 2.1 和 2.2 的实验结果，由于在提取基因组 DNA 和细胞核的试剂中包含了乙醇，推测提取过程中乙醇的加入也会影响 DNA 的构象，对二次谐波的产生和增强造成一定的影响。此外，加入乙醇分子后细胞的荧光强度也明显增强（图 3） 。其原因可能是
32、由于乙醇介入蛋白质分子，改变蛋白质分子所处环境的介电常数，引起肽链伸展，从而降低了某些氨基酸如色氨酸（Trp）、酪氨酸(Tyr)残基的微环境极性，使得 Tyr 残基形成的氢键遭到破坏，以致处于淬灭状态的 Tyr 残基荧光得以恢复，并使其量子率增加。另外可能的原因是加入乙醇可使细胞起到脱水作用，降低细胞所处的微环境极性，使得荧光强度增强。4 结论我们利用 SHG-TPEF 显微成像技术分别对基因组 DNA、细胞核提取物和培养细胞进行光谱成像，结果显示常规条件下可检测到基因组 DNA 和细胞核提取物的 SHG，但无法检测到培养细胞的 SHG，乙醇的加入可使得我们在培养细胞中也检测到 SHG， 表明
33、乙醇可对 DNA 的空间构象产生影响，致使 DNA 光学特性发生改变从而产生二次谐波。由此，反推在基因组 DNA 和细胞核提取试剂中包含了有机物乙醇，可能对这两组样品的 DNA 空间构象产生影响，并最终影响二次谐波的产生和增强。同时，在 DNA 和细胞核的提取试剂中还包含了其它的化学试剂（如十二烷基硫酸钠：SDS，乙二胺四乙酸二钠盐：EDTA等）也有可能对 DNA 非线性光学特性产生影响，要得出确切的结论还需要更进一步的研究。References:1 Denk W, Stickler H, Webb W W. J. Science, 1990, 248(4951): 73-76. 2 Gann
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