1、一、名词解释：1、基因：2、基因组：3、操纵子:4、启动子:5、增强子:6、基因表达：7. 基因工程：8. 载体：9. 转化：10.感染：11.转导：12.递遗传物质：13.感染转移：14. 转染：二、简答题1、说明限制性内切核酸酶的命名原则要点。2、什么是限制性内切核酸酶的星号活性？受哪些因素影向？3、影响 DNA连接酶催化连接反应的因素有哪些？4、什么是 Klenow酶？有哪些活性？在基因工程中有什么作用？5、细菌碱性磷酸酯酶和小牛肠碱性磷酸酯酶有什么不同？在基因工程中有什么用途？6、YAC 载体具有什么样的功能性 DNA序列？为什么在克隆大片段时，YAC 具有优越性？7、列举质粒载体必须
2、具备的 4个基本特性。8、PCR 的基本原理是什么？用 PCR扩增某一基因，必须预先得到什么样的信息？9、cDNA 克隆与基因组克隆有何不同？10、怎样将一个平末端 DNA片段插入到 EcoR I限制位点中去？11.什么是 Western印迹？它与 Southern印迹有什么不同11、什么是蓝白斑筛选法？12、什么是基因文库？13、黏性末端连接法是最常用的连接方法，具有许多优点，但是也有一些不足，请指出这些不足之处。14、什么是同聚物加尾连接法？用何种方法加尾？具有哪些优缺点？15、何谓接头连接法？答案一、名词解释：1、基因：是遗传的物质基础，是 DNA（脱氧核糖核酸）分子上具有遗传信息的特定
3、核苷酸序列的总称，是具有遗传效应的 DNA分子片段。2、基因组该指单倍体细胞中包括编码序列和非编码序列在内的全部 DNA分子3、操纵子:原核生物的几个功能相关的结构基因往往排列在一起，转录生成一个 mRNA，然后分别翻译成几种不同的蛋白质。这些蛋白可能是催化某一代谢过程的酶，或共同完成某种功能。这些结构基因与其上游的启动子，操纵基因共同构成转录单位，称操纵子。4、启动子:是 RNA聚合酶结合位点周围的一组转录控制组件，包括至少一个转录起始点。在真核基因中增强子和启动子常交错覆盖或连续。有时，将结构密切联系而无法区分的启动子、增强子样结构统称启动子。5、增强子:是一种能够提高转录效率的顺式调控元
4、件，最早是在 SV40病毒中发现的长约 200bp的一段 DNA，可使旁侧的基因转录提高 100倍，其后在多种真核生物，甚至在原核生物中都发现了增强子。增强子通常占 100200bp 长度，也和启动子一样由若干组件构成，基本核心组件常为 812bp，可以单拷贝或多拷贝串连形式存在。6、基因表达：是指细胞在生命过程中，把储存在 DNA顺序中遗传信息经过转录和翻译，转变成具有生物活性的蛋白质分子。15. 基因工程：在体外将外源基因进行切割并与一定的载体连接，构成重组 DNA分子并导入相应受体细胞，使外源基因在受体细胞中进行复制、表达，使目的基因大量扩增或得到相应基因的表达产物或进行定向改造生物性状
5、。 简单概括，就是将外源目的基因与载体重组后再进入宿主细胞的过程。16. 载体：能载带微量物质共同参与某种化学或物理过程的常量物质，在基因工程重组DNA技术中将 DNA片段（目的基因）转移至受体细胞的一种能自我复制的 DNA分子。三种最常用的载体是细菌质粒、噬菌体和动植物病毒。17. 转化：指将质粒或其他外源 DNA导入处于感受态的宿主菌，并使其获得新的表型的过程。18.感染：利用噬菌体将外源 DNA导入宿主细胞的方法。19.转导：由噬菌体将一个细胞的基因传递给另一细胞的过程。它是细菌之间传20.递遗传物质的方式之一。其具体含义是指一个细胞的 DNA或 RNA通过病毒载体的21.感染转移到另一
6、个细胞中。22. 转染：指真核细胞主动摄取或被动导入外源 DNA片段而获得新的表型的过程。常用的方法有电穿孔法，磷酸钙共沉淀法，脂质体融合法等。2简答题1、说明限制性内切核酸酶的命名原则要点。答：限制性内切核酸酶采用三字母的命名原则,即属名+种名+株名的各一个首字母,再加上序号. 基本原则: 3-4 个字母组成,方式是:属名+种名+株名+序号; 首字母: 取属名的第一个字母,且斜体大写;第二字母: 取种名的第一个字母,斜体小写;第三字母: (1)取种名的第二个字母,斜体小写;(2)若种名有词头,且已命名过限制酶,则取词头后的第一字母代替.第四字母: 若有株名,株名则作为第四字母,是否大小写,根
7、据原来的情况而定,但用正体. 顺序号: 若在同一菌株中分离了几种限制酶,则按先后顺序冠以 I, 等,用正体.2、什么是限制性内切核酸酶的星号活性？受哪些因素影向？答：类限制酶虽然识别和切割的序列都具有特异性，但是这种特异性受特定条件的限制，即在一定环境条件下表现出来的特异性。条件的改变，限制酶的特异性就会松动，识别的序列和切割都有一些改变，改变后的活性通常称第二活性，而将这种因条件的改变会出现第二活性的酶的右上角加一个星号表示，因此第二活性又称为星号活性。 概括起来，诱发星活性的因素有如下几种： (1)高甘油含量(5, vv)； (2)限制性内切核酸酶用量过高(100UugDNA)； (3)低
8、离子强度(25 mmolL)； (4)高 pH(8.0以上)；(5)含有有机溶剂，如 DMSO，乙醇等； (6)有非 Mg2+的二价阳离子存在(如 Mn2+，Cu2+，C02+，Zn2+等)。3、影响 DNA连接酶催化连接反应的因素有哪些？答：（1）DNA 的纯度 （2）DNA 甲基化的程度 （3）酶切消化反应的温度 （4）DNA 的分子结构 （5）核酸内切限制酶的缓冲液4、什么是 Klenow酶？有哪些活性？在基因工程中有什么作用？答：Klenow 酶是 1974年 Klenow用枯草杆菌蛋白酶水解 DNA聚合酶 I，得到两个片段，其中大片段的分子量为 75kDa，它具有 5-3聚合酶和 3
9、-5外切核酸酶的活性，小片段具有5-3外切核酸酶活性。由于大片段失去了 DNA聚合酶 I中会降解 5引物的 5-3外切核酸酶的活性，所以在基因工程中更有用。Klenow酶主要有下列用途：(1)修复反应，制备平末端可用 Klenow酶修复限制性内切核酸酶或其他方法产生的 5或 3突出末端，制备平末端，这样可以使原来具有不相容的黏性末端的 DNA片段通过平末端重组。如在反应系统中加入放射性同位素标记的脱氧核苷酸，用这种末端填补的方法可以制备 3末端标记的探针。用 Klenow酶修复 5突出末端的反应主要是利用了 Klenow酶的 DNA聚合酶活性，是填补反应；而修复 3突出末端则是用 Klenow
10、酶的 3-5外切核酸酶的活性，是切割反应。用Klenow酶的切割反应来修复 3突出末端是不理想的，改用 T4DNA聚合酶或其他的酶是更好的选择。(2) 标记 DNA3突出末端(protruding end)该反应分两步进行：先用 3-5的外切核酸酶活性除去 3突出末端，产生 3隐含末端，然后在高浓度的标记底物( -32p-dNTP)存在下，使降解(3-5)作用与聚合(5-3)作用达到平衡。这种反应也叫交换或取代反应(exchangereplacement reaction)。不过这一反应用 T4DNA聚合酶的效果更好，因它的 3-5外切核酸酶活性较强。(3)其他的一些用途：包括用双脱氧末端终止
11、法进行 DNA序列分析、用于 cDNA第二链的合成、在定点突变中用于合成第二链、用引物延伸法(primer extension)制备单链 DNA探针等。5、细菌碱性磷酸酯酶和小牛肠碱性磷酸酯酶有什么不同？在基因工程中有什么用途？答：主要差别是：CIP68C 时失活，而 BAP68C稳定，且耐酚抽提。应用：(1)dsDNA的 5端脱磷酸，防止 DNA的自身连接。但是用 CIP处理后，最好将 CIP除去后，再进行连接反应。(2)DNA和 RNA脱磷酸，然后用于多核苷酸激酶进行末端标记。6、YAC 载体具有什么样的功能性 DNA序列？为什么在克隆大片段时，YAC 具有优越性？答：YAC 带有天然染色
12、体所有的功能元件，包括一个着丝粒，一个 DNA复制起点，两个端粒。YAC 能够容纳长达几百 kb的外源 DNA，这是质粒和黏粒办不到的。大片段的插入更有可能包含完整的基因，在染色体步移中每次允许更大的步移距离，同时能够减少完整基因组文库所需的克隆数目。7、列举质粒载体必须具备的 4个基本特性。答： (1)独立复制； (2)有选择标记； (3)有独特的酶切位点； (4)能转化但不扩散。8、PCR 的基本原理是什么？用 PCR扩增某一基因，必须预先得到什么样的信息？答：)DNA 半保留复制的原理，在体外进行 DNA的变性、复性和引物延伸。(2)至少要预先知道足够合成一对引物的靶 DNA序列。9、c
13、DNA 克隆与基因组克隆有何不同？答：基因组克隆包含所有不在 cDNA中出现的内含子。10、怎样将一个平末端 DNA片段插入到 EcoR I限制位点中去？答：化学合成一些长为 10bp含有 EcoRI识别位点的短的 DNA片段，然后与待克隆片段两端连接起来，如果用 EcoRI切割这种连接片段，就会产生 EcoRI的单链末端。这种片段就可以插入到任何 EcoRI的限制性内切酶位点中。11.什么是 Western印迹？它与 Southern印迹有什么不同答： Western 印迹是将蛋白质经电泳分离后从凝胶中转移到固相支持物上，然后用特异性的抗体进行检测。它与 Southern的不同在于探针的性质
14、不同，在 Western印迹中使用的探针是抗体(蛋白质)。11、什么是蓝白斑筛选法？答：这种方法是根据组织化学的原理来筛选重组体。主要是在 载体的非必要区插入一个带有大肠杆菌 半乳糖苷酶的基因片段，携带有 lac基因片段的 载体转入 lac的宿主菌后，在含有 5溴4氯3引哚D半乳糖苷(X-gal)平板上形成浅蓝色的噬菌斑。外源基因插人 lac(或 lac基因部分被取代)后，重组的噬菌体将丧失分解 X-gal的能力，转入 lac-宿主菌后，在含有 5溴4氯3引哚D半乳糖苷 (X-gal)平板上形成白色的噬菌斑，非重组的噬菌体则为蓝色噬菌斑。12、什么是基因文库？用重组 DNA技术将某种生物细胞的
15、总 DNA 或染色体 DNA的所有片断随机地连接到基因载体上,然后转移到适当的宿主细胞中，通过细胞增殖而构成各个片段的无性繁殖系（克隆），在制备的克隆数目多到可以把某种生物的全部基因都包含在内的情况下，这一组克隆的总体就被称为某种生物的基因文库。13、黏性末端连接法是最常用的连接方法，具有许多优点，但是也有一些不足，请指出这些不足之处。答：黏性末端连接法不足之处有：(1)载体易自身环化；(2)若是用同一种限制性内切核酸酶产生的黏性末端连接又不易定向克隆；(3)难插入特定的基因；(4)再者就是大片段 DNA的重组率较低，即使用碱性磷酸酶处理了载体，防止了载体的自身环化，载体也有成环的倾向；(5)
16、用这种方法产生的重组体往往含有不止一个外源片段或不止一个载体连接起来的串联重组体，增加筛选工作的困难。14、什么是同聚物加尾连接法？用何种方法加尾？具有哪些优缺点？答：所谓同聚物加尾法就是利用末端转移酶在载体及外源双链 DNA的 3端各加上一段寡聚核苷酸，制成人工黏性末端，外源 DNA和载体 DNA分子要分别加上不同的寡聚核苷酸，如 dA(dG)和 dT(dC),然后在 DNA连接酶的作用下涟接成为重组的 DNA。这种方法的核心是利用末端转移酶的功能，将核苷酸转移到双链 DNA分子的突出或隐蔽的 3-OH上。以 Mg2+作为辅助因子，该酶可以在突出的 3-OH端逐个添加单核苷酸，如果用 Co2
17、+作辅助因子则可在隐蔽的或平末端的 3-OH端逐个添加单个核苷酸。同聚物加尾法实际上是一种人工黏性末端连接法，具有很多优点：(1)首先不易自身环化，这是因为同一种 DNA的两端的尾巴是相同的，所以不存在自身环化。(2)因为载体和外源片段的末端是互补的黏性末端，所以连接效率较高。(3)用任何一种方法制备的 DNA都可以用这种方法进行连接。同聚物加尾法也有一些不便之处：(1)方法繁琐；(2)外源片段难以回收。由于添加了许多同聚物的尾巴，可能会影响外源基因的表达。另外要注意的是，同聚物加尾法同平末端连接法一样，重组连接后往往会产生某种限制性内切核酸酶的切点。15、何谓接头连接法？答：将人工合成的或来源于现有质粒的一小段 DNA分子(在这一小段 DNA分子上有某种限制性内切核酸酶的识别序列)，加到载体或外源 DNA的分子上，这样便在载体 DNA和外源 DNA上制造出新的酶切点。把这一小段含有酶切点的 DNA分子称为连接器分子，这种方法称为接头连接法。
