1、生物化学实验一、 糖的颜色反应及还原作用实验一：糖的颜色反应实验 1.1 莫氏实验一、目的掌握莫氏（molisch）实验鉴定糖的原理和方法。二、原理糖经浓无机酸（浓硫酸、浓盐酸）脱水产生糠醛或糠醛衍生物，后者在浓无机酸作用下，能与 -萘酚生成紫红色缩合物，在糖液和浓硫酸的液面间形成紫环，因此又称“紫环反应” ，其反应如下图：利用这一性质可以鉴定糖。三、实验器材1、棉花或滤纸。2、吸管 1.0ml(*4)、2.0ml(*1)。3、试管 1.5*15cm(*4)。四、实验试剂1、莫氏试剂：称取 -萘酚 5g，溶于 95%乙醇并稀释至 100ml。此试剂需新鲜配置，并贮于棕色试剂瓶中。2、1%蔗糖溶
2、液：称取蔗糖 1g，溶于蒸馏水并定容至 100ml。3、1%葡萄糖溶液：称取葡萄糖 1g，溶于蒸馏水并定容至 100ml.4、1%淀粉溶液：讲 1g可溶性淀粉与少量冷蒸馏水混合溶液合成薄浆状物，然后缓缓倾入沸蒸馏水中，边加边搅。最后以沸蒸馏水稀释至 100ml。五、操作于 4支试管中，分别加入 1ml1%葡萄糖溶液、1%蔗糖溶液、1%淀粉溶液和少许纤维素（棉花或滤纸浸在 1ml水中） 。然后各加莫氏试剂 2滴 1，摇匀，讲试管倾斜，沿管壁慢慢加入浓硫酸 1.5ml(切勿振摇！)硫酸层沉于试管底部与糖溶液分成两层，观察液面交界处有无紫色环出现。六、注意事项1、试管中加入各种糖后，应做好标记，浓硫
3、酸加入的方式应保持一致。2、莫氏反应非常灵敏，所用的试剂应洗净，不可再样品中混入纸屑等杂物。3、当糖浓度过高时，由于浓硫酸对他的焦化作用，将呈现红色及褐色而不呈现紫色，需稀释后再做。思考题：1、 解释 -苯酚反应的原理。2、 用莫氏试验鉴定糖时需注意哪些？试验 1.2 塞氏试验一、 目的掌握塞氏（Seliwanoff）实验鉴定酮糖的原理和方法。二、原理酮糖在浓酸的作用下，脱水生产 5-羟甲基糠醛，后者与间苯二酚作用，呈红色反应，有时亦同时产生棕色沉淀，此沉淀溶于乙醇，呈鲜红色沉淀 2，以果糖为例，其反应如下：三、实验器材1、吸管 0.5ml(*3)、5.0ml(*1)。2、试管 1.5cm*1
4、5cm（*3） 。3、水浴锅。四、实验试剂1、塞氏试剂：溶 50mg间苯二酚于 100ml盐酸中V(H 2O):V(HCl)=2:1,临用时配制。2、1%果糖溶液：称取果糖 1g，溶于蒸馏水并定容至 100ml。3、1%葡萄糖溶液：见实验 1.1。4、1%蔗糖溶液：见实验 1.1。五、操作于 3支试管中分别加入 1%葡萄糖溶液、1%蔗糖溶液和 1%果糖溶液各0.5ml。各加塞氏试剂 2.5ml，摇匀。同时至沸水浴内。比较各管颜色变化及红色出现的先后次序。六、注意事项1、试管中加入各种糖后，应做好标记，并按顺序置于沸水锅内。2、实验过程中，要仔细观察溶液颜色的变化情况。思考题1、 在塞氏实验中，
5、反应产生的沉淀为何能够溶于乙醇溶液并产生鲜红色？2、 蔗糖为何有塞氏反应？实验 1.3 杜氏实验一、目的掌握杜氏（Tollen）实验鉴定戊糖的原理和方法。二、原理戊糖在浓硫酸溶液中脱水生成糠醛，后者与间苯三酚结合成樱桃红色物质：本实验虽常用以鉴定戊糖，但并非戊糖的特有反应。果糖、半乳糖和糠醛等都是呈阳性反应、戊糖反应最快，通常在 45s内即产生樱桃红色沉淀。三、实验器材1、吸管 1.0ml(*3)2、试管 1.5cm*15cm(*3)3、水浴锅四、实验试剂1、杜氏试剂：2%间苯三酚乙醇溶液（2g 间苯三酚溶于 100ml95%乙醇中）3ml，缓缓加入浓盐酸 15ml及蒸馏水 9ml即得，临时用
6、配制。2、1%阿拉伯糖溶液：称取阿拉伯糖 1g，溶于蒸馏水并稀释至 100ml。3、1%葡萄糖溶液，见实验 1.1。4、1%半乳糖溶液：称取半乳糖 1g，溶于蒸馏水并稀释至 100ml。五、操作于三支试管中加入杜氏试剂 1ml，再分别加入 1滴 1%葡萄糖溶液、1%半乳糖溶液和 1%阿拉伯糖溶液，摇匀。将试管同时加入沸水浴中，观察颜色变化，并记录颜色变化的时间。六注意事项1、试管中加入各种糖后，应做好标记，并按顺序置于沸水浴锅中。2、实验过程中，要仔细观察溶液颜色的变化情况。思考题1、在 Tollen反应分析位置样品时，应注意些什么问题？2、列表总结和比较本实验三种颜色反应的原理及其应用。二、
7、 多糖的性质多糖的实验一、目的1、 熟悉淀粉多糖的碘实验反应原理和方法。2、 进一步了解淀粉的水解过程。二、原理淀粉分布于植物界，谷、果实、种子、块茎中含量丰富，工业用的淀粉主要来源于玉米、山芋、马铃薯。本实验以马铃薯为原料，利用淀粉不溶于或难溶于水的的性质来制备淀粉。淀粉遇碘呈蓝色 1，是由于碘被吸附在淀粉上，形成一复合物，此复合物不稳定，极易被醇、氢氧化钠和加热等使颜色褪去，其他多糖大多数能与碘呈特异的颜色，此类呈颜色物质也不稳定。淀粉在酸催化下加热，逐步水解成分子较小的糖、最后水解成葡萄糖，（C 6H10O5） （C 4H10O5） C 17H22O11 C4H12O4淀粉 各种糊精 麦
8、芽糖 葡萄糖淀粉完全水解后，失去与碘的作用，同时出现单糖的还原性。三、 实验器材1、马铃薯 3、布氏漏斗（*1） 、抽滤瓶 500ml（*1）2、纱布、研钵（*1） 4、表面皿 10cm（*1） 、白瓷板、皮头滴管5、试管 1.5cm*15cm(*4) 8、量筒 25ml（*1）6、电炉、石棉网 9、吸管 1.0ml(*1)7、烧杯 50ml（*1） 10、木质试管四、实验试剂1、稀释液：配制 2%碘化钾溶液，加入适量碘，使溶液呈淡棕黄色即可。2、0.1%淀粉：称取淀粉 1g，加少量水，调匀，倾入沸水，边加边搅，并以热水稀释至 1000ml，可加数滴甲苯防腐。3、10%NaOH 溶液:称取 N
9、aOH10g，溶于蒸馏水并稀释至 100ml。4、本尼迪特试剂：见实验 2.5、20%硫酸（V/V）：量取蒸馏水 78ml置烧杯中，加入浓硫酸 20ml（相对密度 1.84）.摇匀，冷却后贮于试剂瓶中。6、10%碳酸钠溶液：称取无水碳酸钠 10g，溶于蒸馏水并稀释至 100ml。五、操作1、马铃薯淀粉的制备讲生马铃薯去皮，在研钵中充分研碎，加水混合，用纱布过滤，除去粗颗粒，滤液中的淀粉很快沉到底部，多次用水洗淀粉，抽滤，滤饼放在表面皿上，在空气中干燥即得。2、淀粉与碘的反应（1）置少量自制淀粉于白瓷板上，加 1至 3滴稀碘液，观察颜色变化。（2）取试管 1支，加 0.1%淀粉液 5ml，再加
10、2滴稀碘液，摇匀后，观察其颜色变化。将管内液体分成 3分，其中 1分加热，观察颜色是否褪去。冷却后，颜色是否全部恢复。另 2份分别加入乙醇或 10%NaOH溶液，观察颜色变化并解释之。3、淀粉的水解在一小烧杯内加入 1%淀粉溶液 25ml及 20%硫酸 1ml，放在石棉网上小火加热，微沸后每隔 2min取出反应 2滴置于白瓷板上做碘试验。与此同时另取反应液 3滴，用 10%碳酸钠溶液中和后，做本尼迪特试验（参阅试验 2） ，记录试验结果并解释之。六、注意事项1、淀粉提取时可适当加热以促进淀粉聚沉，但温度不能超过 50，否则会因溶解度增大而减少产量。2、用水洗涤淀粉时需待淀粉沉降完全后再小心倾出
11、上清液，亦可直接用滴管吸去上清液。思考题淀粉有没有还原性？如何验证？三、 植物组织中可溶性总糖的测定一、目的掌握蒽酮比色法定糖的原理和方法。二、原理糖在浓硫酸作用下，脱水生成糠醛或羟基糠醛，糠醛或羟基糠醛可与蒽酮反应生成蓝绿色糠醛衍生物，在 60nm处有最大吸收。在一定范围内，颜色的深浅与糖的含量成正比，故可用于糖的定量。蒽酮法几乎可以测定所有的糖类物质，不但可以测定戊糖于己糖，而且可以测定寡糖类和多糖类，其中包括淀粉、纤维素、糖原等（因为反应液中的浓硫酸可以将多糖水解成单糖而发成反应） ，所以用蒽酮法测出的糖含量，实际上是溶液中的总糖含量。此外，不同的糖类与蒽酮试剂的显色深度不同，果糖显色最
12、深，葡萄糖次之，半乳糖、甘露糖较浅，五碳糖显色更浅。三、实验器材1、新鲜植物叶片 5、水浴锅、电炉2、吸管 1.0ml（*2） 、5ml（*1） 、0.1ml 6、电子分析天平（*1） 、0.2ml(*1)、0.5ml(*3). 7、容量瓶 100ml（*1） 、玻璃漏斗。3、试管 1.5cm*15cm(*7) 8、量筒、研钵、三角烧杯4、紫外可见分光光度计。四、实验试剂1、蒽酮试剂：取 2g蒽酮溶于 1000ml80%（V/V）的硫酸中，当日配制使用。2、标准葡萄糖溶液（0.1mg/ml）：100ml 葡萄糖溶于蒸馏水并稀释至1000ml（可滴加几滴甲苯作防腐剂）五、操作1、制作标准曲线取干
13、净试管 6支，按表 6进行操作。以吸光度为纵坐标，各标准溶液浓度（mg/ml）为横坐标作为图得标准曲线。表 6 蒽酮比色法定糖标准曲线的制作管号试剂0 1 2 3 4 5标准葡萄糖溶液/ml 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5蒸馏水/ml 1.0 0.9 0.8 0.7 0.6 0.5置冰水浴中 5min蒽酮试剂 4.0 4.0 4.0 4.0 4.0 4.0沸水浴中准确煮沸 10min，取出，用自来水冷却，室温放置 10min，在 620nm处比色。A620nm3、 可溶性糖的提取和测定取新鲜植物叶片，洗净表面污物，用滤纸吸去表面水分。称取 0.5g，剪碎、加入 3ml蒸馏水，在年播
14、种磨成匀浆，转入锥形瓶，并用 12ml蒸馏水冲洗研钵2至 3次，洗出液也转入锥形瓶中。用塑料薄膜封口，于沸水中提取 30min，冷却后过滤并定容至 100ml，此为待测液，吸取待测液 0.5ml于试管中，加蒸馏水 0.5ml，浸于冰水浴中冷却，再加入 4ml蒽酮试剂，沸水浴中煮沸 10min，取出用自来水冷却后比色，其他条件与做标准曲线相同，测得的吸光度值有标准曲线查算出样品液的糖含量。六、计算（总糖）=(C*V)/m*100%式中 （总糖）：总糖的质量分数（%） ；C:从标准曲线上查出的糖含量（mg/ml）;V:样品稀释后的体积（ml）m:样品的质量（mg）七、注意事项1、若提取物中过多色素
15、会干扰显色，须事先除去。2、参见实验 8注意事项。思考题1、 本实验蒽酮法用于测定植物叶片的可溶性糖，非可溶性糖可用此方法除去吗？2、 制作标准曲线时应注意哪些问题？三、 蒽酮-硫酸比色定糖法一、 目的掌握蒽酮比色法定糖的原理和方法。二、原理蒽酮比色法是一个快速而简便的定糖方法。蒽酮可以和游离得的己糖或多糖中的己糖基，戊醛糖及己糖醛酸起反应，反应溶液呈蓝绿色，在 620nm出有最大吸收。蒽酮可与其他一些糖类发生反应，单显现的颜色不同，当样品中存有含有较多色氨酸的蛋白质时，反应不稳定，呈红色，对于以上特定的糖类，反应较稳定。本法多用于测定糖原含量，亦可用于测定葡萄糖含量。三、 实验器材1、无蛋白
16、滤液或其他材料 4、紫外可见光光度计2、吸管 1.0ml（*2） 、5ml（*1） 、0.1ml 5、水浴锅（*1） 、0.2ml(*1)、0.5ml(*3). 6、电炉3、试管 1.5cm*15cm(*7) 7、电子分析天平。四、实验试剂1、蒽酮试剂：取 2g蒽酮溶于 1000ml体积分数为 80%(V/V)的硫酸中，当日配制使用。2、标准葡萄糖溶液（0.1mg/ml） ，100mg 葡萄糖溶于蒸馏水并稀释至1000ml（可滴加几滴甲苯作为防腐剂） 。3、标准唐宇溶液（0.1mg/ml）:100mg 糖原溶于蒸馏水并稀释至1000ml（可滴加几滴甲苯作为防腐剂） 。五、操作1、创作标准曲线取
17、干净试管 6支，按表 5进行操作。表 5 蒽酮比色法定糖标准曲线的创作管号试剂0 1 2 3 4 5标准葡萄糖溶液/ml 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5蒸馏水/ml 1.0 0.9 0.8 0.7 0.6 0.5置冰水浴中 5min蒽酮试剂 4.0 4.0 4.0 4.0 4.0 4.0沸水浴中准确煮沸 10min，取出，用自来水冷却，室温放置 10min，在 620nm处比色。A620nm以吸光度为纵坐标，各种标准浓度（mg/ml）为横坐标做图得标准曲线。3、样品含糖量测定吸去 1ml无蛋白糖类溶液置试管中，浸于冰浴中冷却，再加入 4ml蒽酮试剂，沸水浴中煮沸 10min，取出用
18、哪个自来水冷却后比色，其他条件与做标准曲线相同，测得的吸光光度值由标准曲线查算查出样品液的糖含量。四、 计算=CV/m*100%式中 ，糖的质量分数（%）C:从标准曲线上查出的糖质量浓度（mg/ml）V:样品稀释后的体积m:样品的质量五、 注意事项1、 蒽酮试剂中硫酸的浓度为 80%。因为蒽酮不能溶于低于 80%的硫酸溶液中，测定样品含水量不能多，试管应干燥污水，否则蒽酮会在测定液中析出而影响测定。2、 不同显色温度和时间对产物的吸光度影响较大，沸水浴时间过长，糠醛衍生物遭破坏，颜色会消退。3、 试剂为浓硫酸，操作时要小心，注意安全。思考题1、 蒽酮法中硫酸起什么作用？2、 有哪些糖可用蒽酮法
19、测定？六、 脂肪酸价的测定一、目的了解脂肪酸价测定的原理和方法。二、原理天然优质长期暴露在空气中会发生臭味，这种现象称为酸败，酸败是由于油脂水解释放出的脂肪酸，在空气中被氧化成醛或酮，从而有一定的臭味，酸败的程度用酸价来表示，酸价是中和的 1g油脂的游离脂肪酸所需 KOH的毫克数。油脂中的游离脂肪酸与 KOH发生中和反应，从 KOH标准溶液消耗量可计算出游离脂肪酸的量。反应时如下：RCOOH+KOH RCOOK+H2O三、实验器材1、油脂（猪油、豆油等均可） 4、三角烧杯（锥形瓶）100ml（*3）2、电子分析天平 5、量筒 50ml（*1）3、碱式滴定管 25ml（*1） 6、水浴锅。四、试
20、剂1、0.100mol/LKOH 标准溶液。2、1%酚酞指示剂：用 70%至 90%乙醇配制。3、中性醇醚混合液：取 95%乙醇（C.P.）和乙醚（C.P.）按 1:1等体积混合；或苯醇混合液：取苯(C.P.)和 95%乙醇（C.P.）等体积混合；上述混合液加入酚酞指示剂数滴，用 0.100mol/L，KOH 溶液中和至红色。五、操作准确称量油脂 1至 2.000g于 100ml三角烧瓶中，加入醇醚混合液 150ml，振荡溶解（固体脂肪需水浴溶化再加入混合溶液）或 40水浴中溶化至透明，溶液由红色变为无色，继续用 0.100mol/LKOH标准液滴定至淡红色，1min 不褪色为终点，记录 KO
21、H的用量 V(ml)。六、计算脂肪的酸价=(cV*56.1)/m式中 c：标准 KOH物质的量浓度（mol/L）V:样品消耗 KOH的体积（ml）56.1：每摩尔 KOH的质量（g/mol）m:样品质量（g）七、注意事项去油脂的量尽量根据样品大致酸价取样，或者先做预实验，在做正式试验。思考题1、 实验中能否用相同浓度的 NaOH替代 KOH作为滴定用碱。2、 造成食品酸价升高的因素有哪些？有何办法可防止油脂的水解、氧化和酸败？六、卵磷脂的提取与鉴定一、目的了解用乙醇作为溶剂提取卵磷脂的原理和方法。二、原理软磷脂在脑、神经组织、肝、肾上腺和红细胞中含量较多，蛋黄中含量特别多。卵磷脂易溶于醇、乙醚
22、等脂溶剂，可利用这些脂溶剂提取。新提取得到的卵磷脂为白色蜡状物，与空气接触后因所含不饱和脂酸被氧化而呈现黄褐色，卵磷脂中的胆碱基在碱性溶液中可分解成三甲胺，三甲胺有特异的鱼腥臭味，可鉴别。三、实验器材1、鸡蛋黄。 5、试管 1.5cm18cm（ 1） 。2、烧杯 50ml（1） 。 6、吸管 2ml（1） 。3、量筒 50ml（1） 。 7、电子天平。4、蒸发皿（1） 。四、实验器材1、95%乙醇（ C.P.） 。2、10%氢氧化钠溶液： 10gNaOH 溶于蒸馏水，稀释至 100ml。五、操作1、提取 于小烧杯内置蛋黄约 2g，加入热 95%乙醇 15ml，边加边搅，冷却，过滤，将滤液置于蒸
23、发皿内，蒸汽浴上蒸干，残留物即为卵磷脂。2、鉴定取卵磷脂少许，置于试管内，加 10%NaOH 溶液约 2ml，水浴加热，看是否产生鱼腥味。六、注意事项卵磷脂粗品因被氧化或色素的存在而颜色较深，可用丙酮进一步提纯。思考题1、卵磷脂提取过程中，加入热 95%的乙醇的作用是什么？2、卵磷脂的生物学功能有哪些？七、血清胆固醇的定量测定（硫酸铁法）一、目的学习胆固醇测定的一种方法，学会制备无蛋白血清液。二、原理血清经无水乙醇处理，蛋白质被沉淀，胆固醇及其酯则溶在无水乙醇中。在乙醇提取液中加磷酸铁试剂（即浓硫酸和三价铁溶液） ，胆固醇及其酯与试剂形成比较稳定的紫红色化合物，呈色程度与及其酯含量成正比，可用
24、比色法（560nm）定量测定。胆固醇的结构如下：三、实验器材1、人血清。 4、离心管 0.6cm4cm（2） 。2、紫外光可见分光光度计。5、试管 1.5cm15cm（3） 。3、离心机（4000r/min） 。 6、吸管 0.1ml（1） 、1ml（3） 、5ml（1） 。四、实验试剂1、10%三氯化铁溶液： 10gFeCl36H2O（A.R.）溶于磷酸（A.R.） ，定容至100ml，贮于棕色瓶中，冷藏，可用一年。2、硫酸铁试剂（PSFe 试剂）：取 10%FeCl3 溶液 1.5ml 于 100ml 棕色瓶内，加浓硫酸（A.R. ）至刻度。3、胆固醇标准贮液：准确称取胆固醇（C.P.）8
25、0mg ，溶于无水乙醇，定容至 100ml。4、胆固醇标准溶液：将贮液用无水乙醇准确稀释 10 倍即得，此标准溶液含 0.08mg/ml 胆固醇。5、无水乙醇。五、操作1、胆固醇的提取吸取血清 0.1ml 置于干燥离心管内，先加无水乙醇 0.4ml，摇匀后再加无水乙醇 0.2ml，摇匀， 10min 后离心（3000r/min）5min ，取上清液备用。2、比色测定取干燥试管 3 支，编号，分别加入无水乙醇 1.0ml（空白管） 、胆固醇标准溶液 1.0ml（标准管） 、上述乙醇提取 1.0ml（样品管） ，各管皆加入硫酸铁试剂1.0ml，摇匀， 10min 后，分别转移至比色杯内，用紫外可见
26、分光光度计在560nm 处比色。六、计算m= 0.04100 A1C0A0式中 m：100ml 血清中胆固醇的质量（mg ） ；A1：样品液的吸光度；A0：标准液的吸光度；C0：标准液中胆固醇浓度，即 0.08mg/ml；0.04：1ml 血清胆固醇乙醇提取液相当于 0.04ml 的血清；100：100ml 血清。100ml 人血清中胆固醇的质量正常值为 110220mg。七、注意事项硫酸铁实际中含磷酸、硫酸，还有三氯化铁，称量三氯化铁时，注意防潮，要快速称量，因其氧化性，称量后注意清洁残留物。不要用称量纸类，要用烧杯称量，再缓慢加入磷酸。用时，小心加入硫酸即成；配置好的磷酸铁试剂，放入通风橱内，用时小心，防止腐蚀。思考题测定血清中胆固醇的含量，有何临床意义？胆固醇对人的作用有哪些？如何控制膳食中的胆固醇？八 维生素 C的定量测定磷钼酸法一、目的1、了解维生素 C 的测定方法。2、加深理解维生素 C的理化性质。二、原理钼酸铵在一定条件下（有硫酸和偏磷酸根离子存在）与维生素 C反应生成蓝色结合物，在一定浓度范围内（样品控制浓度在 25至 250g/ml）吸光度与浓度成直线关系，在偏磷酸存在下，样品所存在的还原糖及常见的还原性物质均无干扰，因而专一性好，且反应迅速。MoOI-+维生素 C Mo(MoO4)3+维生素 C
