1、 1 基因工程 (双语 )练习题 第一章 绪论 1、孟德尔法则的基本假设是生物体的遗传特性由一种因子控制，这种因子称为（ 基因 ）。它是存在于细胞之中的某种物质颗粒。 2、 孟德尔所提出的，我们现在称之为遗传第一与第二原理的重要发现被埋没了近（ 30）年，一直到二十世纪初才又被别人再度发现。 3、孟德尔提出的遗传规律埋没 (30)年后，又被三位科学家再次发现，这三位科学家不包括： （ 1）荷兰的植物学家 Hugo de Vries , （ 2）德国的植物学家 Karl Correns （ 3）奥地利的植物学家 E. von Tschermak （ 4）美国科学家 T. H. Morgan 4、
2、孟德尔法则的再次发现标志着 (遗传学 )的诞生，当时这门科学的主要目的是试图研究（ 基因是什么，它们是如何工作的？ ） （ 1）基因是什么，它们是如何工作的？ （ 2）基因在那里，它们是如何工作的？ （ 3）基因是不是蛋白质？ （ 4）基因是不是核酸？ 5、基因在染色体上的思想是 1903 年（ W. Sutton）提出来的，并得到了 1910 年（ T. H. Morgan ）实验的支持。 6、摩尔根等发现了（基因图谱： gene mapping）技术，到 1922 年已经对果 蝇 4 条染色体上的 2000 多个基因的相关位置进行了广泛的分析，他用的具体的实验材料是（黑腹果蝇： Droso
3、phila melanogaster） 。 7、 1902 年，博韦里（ TBoveri）和萨顿（ WSSutton）指出，染色体在细胞分裂中的行为与孟德尔的遗传因子平行 。 8、 艾弗里（ O. T. Avery）最为人称道的贡献是在遗传学方面。 1944 年，他与他的同事麦克劳德（ MacLeod）和麦卡蒂（ McCarty）提供了 DNA 是遗传物质的第一个直接实验证据，从而导致 1953 年沃森克里克提出 DNA（ 双螺旋 结构模型 ），由此诞生了分子遗传学，开创了生命科学的新纪元。 9、 麦克斯 德尔布吕克（ Max Delbruck）在科学上的主要贡献是开创了 噬菌体遗传学的研究。
4、 10、 50 年代， E. Chargaff 研究了不同生物的 DNA 分子组成之后，发现一些共同规律，这些规律现在称为 （ Chargaff 准则 ） 。 2 11、 1952 年，奥地利裔美国生物化学家查伽夫（ E.chargaff， 1905）测定了 DNA 中4 种碱基的含量，发现其中腺膘呤与胸腺嘧啶的数量相等，鸟膘呤与胞嘧啶的数量相等。这使（ 沃森、克里克 ）立即想到 4 种碱基之间 存在着两两对应的关系，形成了腺膘呤与胸腺嘧啶配对、鸟膘呤与胞嘧啶配对的概念。 12、 在 E. Chargaff 等人的研究基础上， Watson 和 Crick 根据 DNA 的 x-射线衍射图及化
5、学分析的结果，于 1953 年提出了著名的关于 DNA 的双螺旋 (DNA double helix modle)结构的模型。 13、 雅克 莫诺 (Jacques LMonod)是 20 世纪中期一位杰出的分子生物学家。他和 F雅各布等人一起在分子水平上探讨了基因的调控机制，创立了（ 操纵子 ）理论。 14、 1973 年 （ Cohen）完成了第一 例成功的克隆实验。 基因工程 的概念 (genetic engineering)： 应用酶学的方法，在体外将目的基因与载体 DNA 结合成一具有自我复制能力的 DNA分子（ 复制子、重组体 ），继而通过转化或转染宿主细胞 ， 筛选出含有目的基因
6、的转化细胞，再进行扩增、提取获得大量同一 DNA 分子拷贝，或其表达产物。 请简述 基因克隆的基本过程或基本步骤？ (The basic steps in a gene cloning？ ) 答案：基因克隆实验的基本步骤如下： 第一步：含有被克隆基因的 DNA 片段首先要插入到称为载体的环状 DNA 分子中，产生出 嵌合体或重组 DNA 分子。 第二步： 作为 运载工具的载体将基因转移到宿主细胞中，这些宿主细胞通常为细菌，也包括其他类型的活细胞。 第三步： 在宿主细胞内载体进行复制，这里不仅载体本身能够复制，其携带的基因也同样的进行复制。 第四步：当宿主细胞分裂时，重组 DNA 分子的拷贝被传
7、递给子代细胞，更多的载体发生复制。 第五步：大量的细胞分裂后，产生确定的宿主细胞的菌落或克隆。克隆内的每一个细胞都包含了一个或更多的重组 DNA 分子的拷贝，这时候我们可以说 重组 DNA 分子携带的基因就被克隆 了。 第 2 章基因克隆载体 :质 粒和噬菌体 一、 简答题 简述质粒的基本特征？ 1、 质粒是一种能够在细菌细胞中独立生活的环状 DNA 分子。 2、 质粒上总是携带一个或多个基因，在实验室中抗生素抗性基因常常作为 选择标记 以能够确定培养物中的细菌包含某种特定的质粒。例如 RP4这个质粒子就携带对氨卞青霉素、四环素、卡那霉素等抗生素的抗性基因。因此，仅仅含有 RP4 或相关质粒的
8、大肠杆菌能够在含有一种或多种抗生素的培养基中生存和生长。 3 3、 所有质粒至少含有一个充当 复制起点 的 DNA 序列，因此能够在细胞 中 独立于主要染色体之外进行复制，例如非整合型质粒子就是这样。 一些质粒也能插入到染色体中进行复制，整合型质粒子就是这样。 二、 填空题 1、对质粒而言，作为一个理想克隆载体的适当范围是小于（ 10kb）。但较 大 的质粒在某种情况也适合于克隆。 2、质粒的大小范围在（ 1.0kb 250kb） 之间。 3、质粒分成两个组群：接合性的和非接合性的，接合性的质粒的特征是能够促进细菌细胞之间的（ 性接合 ）。 4、为了能在同一细胞内共存，不同的质粒一定是相容的，
9、如果两种质粒不相容，那么一种或另一种将迅速地从细胞内消失，因此不同的质粒依是否能共存而分成不同的 不相容群 。 三、 名词解释： 1、质 粒的拷贝数： 一般是指单个细菌细胞中发现的单一质粒的分子数目，一般在细胞内用于 克隆载体 的质粒以多拷贝形式存在以获得大量的重组 DNA 分子。 2、 致育（ fertility）质粒（又称 F质粒） ：仅携带转移基因，并且能够促进质粒间有性接合的转移外，不再具备其他的特征，如大肠杆菌中的 F 质粒。 3、耐药性质粒（ resistance）质粒或称 “R”质粒 ：携带有能够赋予宿主细胞对某种或多种抗菌药的耐药基因，如抗氯霉素，抗氨卞青霉素，抗水银等的抗性基
10、因。 R 质粒因其通过正常繁殖而传播，在临床微生物学上具有重要作用，能够对细菌感染 的治疗产生深远的影响，如 RP4 通常在 （ 假单胞菌 ） 中发现，但也能在其他菌中出现。 4、 Col 质粒： 编码大肠杆菌素，一种能够杀死其他细菌的蛋白，比如大肠杆菌的 ColE1质粒 。 5 降解质粒：（ degradative plasmid）： 使宿主菌能够代谢一些通常情况下无法利用的分子，如甲苯、水杨酸，例如假单胞菌中的 TOL 质粒 。 6、毒性质粒（ virulence plasmid）： 赋予宿主菌致病性，比如根瘤农杆菌中的 Ti 质粒 ，能够在双子叶植物中诱导冠樱瘤。 简答题 : 一、 简述
11、噬菌体的基本特征 （ Basic features of bacteriophages） ? 1、 噬菌体一般是专一侵染细菌的病毒。像所有病毒一样，噬菌体的结构十分简单，仅仅由携带若干基因的 DNA（偶尔也有 RNA）组成，包括几个用于噬菌体复制的基因，同时被由蛋白质组成的衣壳包围着。 2、 裂解性侵染循环的特定特征是噬菌体的 DNA 复制紧随衣壳蛋白合成之后发生，并且噬菌体 DNA 决不会稳定地在宿主细胞内存在。与裂解性侵染循环相比，溶源性感染的特征是也许细胞经过上千次的分裂后，噬菌体 DNA 分子仍保留在宿主菌内。 噬菌体是典4 型的溶源性噬菌体 ，其侵染循环就是这种类型的。 3、 有限的
12、几种 溶 源性噬菌体进行着一种相当不同的侵染循环，当 M13 噬菌体或相关噬菌体侵染大肠杆菌时，新的噬菌体颗粒不断的组装并且从细胞不断的释放。它不整合到细菌基因组中去也不会保持静止，这样细胞决不会发生裂解，被侵染的细胞继续生长分裂，只是比未被侵染的细胞更慢一些。 4、 尽管有很多种噬菌体， 仅 和 M13 被发现可以作为克隆载体。 二、 简述 DNA 分子中基因组织方式？ 1、通过基因图谱和 DNA 测序技术的细致研究发现 DNA分子的大小是 49kb。研究结果已经搞清了 DNA分子上的基因的位置和特征。 2、 噬菌体的 遗传图谱的特点是，相关功能基因在其基因组上成簇聚集在一起。例如，所有 编
13、码衣壳组分的基因 都成群聚集在分子的 左手 1/3 处 ；控制前噬菌体 整合 到宿主基因组上的基因成簇聚集在分子的 中部 。基因成簇排列对控制 基因组的表达具有十分重要的作用，因为它使基因以一个群体开闭，而不是单一进行。另外，基因成簇排列在基于 噬菌体的克隆载体的构建也是十分重要的。 3、现已证明在克隆载体的构建过程中， 噬菌体的第二个重要特征是其 DNA 分子的构型 。带有两个游离端的 线型分子 代表着在 噬菌体头部 中 DNA分子存在方式。这种线型分子由两链条互补链 组成，分子的两端各含有一个由单链形式存在的短的 12 核苷酸 的延伸区，这两条单链是互补的，因而能够相互配对形成环状的完整的
14、双链分子。互补的单链常常称作粘性末端，因为它们之间的配对能把 DNA 的两段粘在一起。 4、 分子的粘性末端被称作 柯斯位点（ the cos sites） ，在 噬菌体侵染周期中起着两种截然不同的作用。首先，该位点允许注入到细胞中的线型 DNA 分子环化，而环化是 插入基因组 的先决的必要条件。柯斯位点（ the cos sites）的第二个作用是相当不同，它是在前噬菌体切离宿主基因组之后开始起作用。在这一阶 段，新的 DNA分子通过 滚环复制机制 不断地从模板分子上滚落，结果产生了由带有柯斯位点（ the cos sites.）的一系列 线型分子 组成的 连环体 。此时，柯斯位点的作用是充
15、当在柯斯位点处切割连环体的限制性内切酶的 识别序列 ，从而产生单一的 噬菌体基因组。该内切酶由 DNA基因组上的 A 基因产生，它不仅能够切割产生单链的粘性末端也和其他的蛋白质联合作用把各个 噬菌体的基因组包装 进噬菌体的头部结构中去。 三、简述噬菌体 M13 的主要特征，回答为什么它是一种很有吸引力的适合构建克隆载体噬菌体？ 1、噬菌体 M13 是单连丝状 DNA 噬菌体，其分子小于 基因组，长度仅为 6407 个核苷酸大小，分子是 环型 的通常是完整的单链 DNA 分子。 2、它是一种很有吸引力的适合构建克隆载体噬菌体。基因组大小小于 10kb，恰好处于有潜力的载体的理想范围内。另外， M
16、13 基因组的双链复制型（ RF）的行为很像质粒，能够同样的处理以适应实验目的。它易于从感染的大肠杆菌中制备也可通过感染再次导入。 5 3、特别是使用基于 M13 载体克隆的基因能够以单链形式获得。克隆基因的单链副本可以用于几个技术中，例如有名的 DNA 测序和体外突变。对于这种类型的工作，使用 M13载体获 得单链 DNA 是一种容易而可靠的方式。 第三章 从活细胞中纯化 DNA 一、填空题 1、在不同时间 ， 我们要进行基因克隆实验一般至少要制备三种不同种类的 DNA,他们是：（ 细胞总 DNA）、（ 纯化的质粒子 DNA）、（ 噬菌体 DNA）。 2、从细菌细胞中制备总 DNA 的方法可
17、以分成哪四个阶段？ 答案：（ 1）细胞培养物的生长和收获。 （ 2）细胞被转移并破碎以获得细胞提取物。 （ 3） DNA 从细胞提取物中纯化。 （ 4） DNA 被浓缩。 3、 LB 培养基的主要成分是（ 蛋白胨 ）、（ 酵母提取物 ）、（ 氯化钠 ）。 二、简答题 1、简述细菌培养 物的生长和收获？ （ 1） 37 下， LB 培养基在摇床上以 150 250rmp 通气培养 ，大肠杆菌细胞每大约 20分钟 分裂一次，直到达到最大浓度，大约每毫升内含 2 3109 个细胞为止。 （ 2）培养物的生长可以通过读取 600nm 处的 OD 进行检测，此波长下， 1OD 相当于每毫升菌液中含有 0
18、.8109 个细菌。 （ 3）为了制备细胞提取液，提取的细菌细胞尽可能处于较小的体积中，因此要在离心机上进行旋转离心以 收获细菌 。 （ 4）相对较低的速度就可以将细菌离心到离心管管底，接下来要把培养基成分倒掉，在细菌的最大浓度下， 1 升培养物 中的细菌可以再悬浮于在 10ml 的体积内。由此细菌培养物得以浓缩。 2、请问如何制备细胞提取物（ a cell extract）？ （ 1）破碎细胞的技术可分为物理和化学两种方法，当你的实验目地是 DNA 制备时，对大肠杆菌而言常常使用化学方法。 （ 2）化学裂解一般使用一种药品攻击 细胞壁 用另一种药品破坏 细胞膜 。 （ 3）使用什么化学药品要
19、依细菌的种类而定，但对于大肠杆菌或相关的有机体来说，弱化细胞壁的韧性 时， 往往采用 溶菌酶 、乙二胺四乙酸 (EDTA)或两者混合使用。 （ 4）溶菌酶是存在于蛋清或眼泪和唾液中的一种酶，能消化 多聚复合物使细胞壁产生脆性。 （ 5）另一个方面， EDTA 能移除镁离子 ，而镁离子对维持细胞壁的完整结构是必要的，同时它也能抑制细胞中的酶对 DNA 的降解。 （ 6）在某些情况下，使用溶菌酶或 EDTA 足可以使菌体细胞破裂，但通常还要加像 十6 二烷基磺酸钠 （ SDS）那样的去垢剂。去垢剂通过去除脂类分子而促进裂解过程，因此引起细胞膜的破裂。 （ 7）裂解细胞后，制备细胞提取物的最后一步是
20、去除不容的细胞碎片，例如部分消化的细胞壁碎片等组分可以通过 离心 去除，这样 细胞提取物 就保留在上清中而得以制备。 3、得到细菌细胞提取物之后，你 如何从提取物（ a cell extract）中纯化 DNA？ （ 1）除了 DNA 外，细菌细胞提取物中还包含大量的蛋白质和 RNA，可以使用不同的方法去除这些污染物，已得到纯净的 DNA。 （ 2）去除提取物中蛋白质的标准方法是加入苯酚或苯酚和氯仿（ 1： 1）的混合物， .这些有机溶剂能够 使 蛋白质沉淀 下来，而把核酸（ DNA 和 RNA）保留在 水相 中。这样提取物轻轻与这些有机溶剂混合，用离心方法分层，沉淀的蛋白质分子就在 有机相和
21、水相之间 凝结成白色的团快。 （ 3）一些 RNA 分子，特别是 mRNA 分子通过苯酚处理可以去除，但大多数 RNA 分子仍同 DNA 分子混合在水相中。唯一有效的去除 RNA 的方法是使用 核糖核酸酶 ，该酶能把 RNA 分子降解成 核糖核酸亚单位 。 4、如何对得到的 DNA 样品进行浓缩？一般采用乙醇沉淀的方法对 DNA 样品进行浓缩。 5、有人已经制备出了大肠杆菌基因组 DNA，让你测量一下 DNA 的浓度，你会采用什么方法如何进行？ （ 1）要进行基因克隆实验，确切的知道溶液中有多少 DNA 是十分重要的，紫外吸收分光光度测定法能够精确地测量 DNA 的浓度。 （ 2） DNA 溶
22、液的紫外光吸收的数量直接与样品中 DNA 的含量成比例。 （ 3）通常在 260nm 处测 量光吸收值，在该波长下 (A260)，对于一个纯的 DNA 样品来说，1 个光吸收值 （ 1OD） 相当于每 mg 样品中含有 50g 的双链 DNA。 （ 4）另外紫外光吸收也能用来检测 DNA 制备物的纯度， A260/A280 是 1.8，如果这个比值小于 1.8，说明制备物被污染了，不是污染了蛋白质就是污染了苯酚。 6、简述质粒制备的一般原理？ （ 1）在制备质粒的过程中，将质粒 DNA 与同处于细胞中的细菌染色体 DNA 分开总是必要的。有几种基于质粒和细菌 DNA 物理特性 不同而采用的方法
23、，特别明显的就是 大小的差异 。 （ 2）常用的质粒载体大小一 般在 1kb 至 10kb 之间 ， 如 pBR322、 pUC 系列、 pGEM 系列和 pBluescript（简称 pBS）等。细菌的基因组大小约 5106bp，约含 3000 个基因。 （ 3）除了大小外，质粒和细菌 DNA 的 构象 也不同。大多数质粒以超螺旋分子存在于细胞中，这种超螺旋结构仅当两条多聚核苷酸链保持完好的情况下保持稳定，因此更专业的说法称为 cccDNA。 （ 4） 碱裂解法 的基础是要有一个狭窄的 pH 范围 。 在该范围内 非超螺旋 DNA 变性而超螺旋的质粒不变性。如果把氢氧化钠加到细胞提取物中，调
24、 pH 到 12.012.5 狭窄的 pH 范7 围 ， 非超螺旋 DNA 氢键断裂，引起双螺旋解开，两条多聚核苷酸链分离。 （ 5）如果此时加入酸，这些变性的菌体 DNA 链聚成一团，通过离心能将不溶解的网状结构析出，在上清中就保留了 质粒 DNA。 第四章 DNA 纯化后的利用 填空题 1、一旦制备出 DNA 样品 ， 基因克隆的下一步工作是构建 (重组 DNA 分子 )。 2、构成基因克隆基础的切割和连接操作要通过称为（ 限制性核酸内切酶 ）和（ 连接酶 ）实现。 简要题 一、 DNA 操作酶的范围？（也可以作为填空题） DNA 操作酶依其催化的反应类型分成 （ 5） 大类。 （ 1）核
25、酸酶是能切割、缩短、降 解核酸分子的酶。 （ 2）连接酶能够把核酸连接在一起。 （ 3）多聚酶能使分子进行复制。 （ 4）修饰酶能去除和填加化学基团。 （ 5）拓扑酶能引入和去除 cccDNA 的超螺旋结构。 选择题 关于核酸酶下列说法不正确的是 （ 1）外切酶的作用方式是从 DNA 分子的末端逐一切去核苷酸。 （ 2）内切酶能够切断一个 DNA 分子中内部的磷酸二酯键。 （ 3）不同 核酸外切酶的主要区别在于攻击双链分子时所降解的链的数目不同。 （ 4）内切酶不能切断一个 DNA 分子中内部的磷酸二酯键。 填空题 1、 Bal31 是从一种（海洋）细菌（ Alteromonas espeji
26、ana） 中纯化得到的，它是一种核酸外切酶，能够去除双链分子两条链上的核苷酸。这样该酶作用分子的时间越（长），得到的片段越（短）。 2、 E.coli exonuclease III 只降解双链分子的一条链，得到（ 单链分子 ）产物。 3、 核酸内切酶的分类标准与外切酶（相同），内切酶 S1 来自于（ Aspergillus oryzae :米曲霉 ），一种真菌，而 (DNase I)制备于 （ 牛的胰腺 ） ， 既能切割单链分子又能切割双链分子。 4、另外，（ 限制性核酸内切酶 ）是一种特殊类群的酶，仅仅在有限数目的 （ 特异识别位点 ）切割双链分子。 5、在细胞内，（ 连接酶 ）的功能是在
27、复制期间修复双链 DNA 分子上产生的单链（ 缺失 ） (discontinuities)，大多数生物产生的这种酶能把双链分子的两个独立片段连接在一起。 6、 DNA 连接酶 是 1967 年在三个实验室同时发现的。它是一种封闭 DNA 链上缺失8 (discontinuities)酶，借助 ATP 或 NAD 水解提供的能量催化 DNA 链的 5-PO4 与另一 DNA链的 3-OH 生成 磷酸二酯键 。但这两条链必须是与同一条互补链配对结合的 (T4DNA 连接酶除外 )，而且必须是两条 紧邻 DNA 链才能被 DNA 连接酶催化成磷酸二酯键。 7、 DNA 聚合酶 ， 以 DNA 为复制
28、模板，从将 DNA 由（ 5端 ）开始复制到（ 3端 ）的酶。 8、 在 50 年代的中期， A. Kornberg 等就想到 DNA 的复制必然是一种酶的催化作用，经过大量的工作，于 1956 年终于发现了（ DNA 聚合酶 ）（ DNA polymerase ， DNA pol ）原来称为 Kornberg 酶。 9、 DNA 聚合酶 能合成与已有的（ DNA 或 RNA）模板互补的能的 DNA 链，大多数聚合酶只有模板具有一个 双链区域 下才能发生作用，该区域充当聚合起始的 引物 结合区。 简答题 一、简述通常用于基因工程的 4 种聚合酶？ （ 1）第一种聚合酶是 DNA polymer
29、ase I， 来源于大肠杆菌（ E.coli） 。 该酶作用于主要双链 DNA 分子的单链区域 （ nick:缺口） ，合成互补的新链，在催化过程中同时还 降解已有的分子链 。因此它是具有双重活性的酶，即（聚合和降解）。 （ 2） DNA polymerase I 的核酸酶活性位于多肽的最初的 323 氨基酸分子处，移除该片段后使酶更改，更改后的酶保留了聚合酶的功能但不再有降解活性，称为 Klenow 片段。 （ 3） Taq DNA polymerase 用于 PCR 反应，它是一种（耐热细菌） Themus aquaticus.的DNA polymerase I。 （ 4）逆转录酶专门在几
30、种病毒的复制上发挥作用。它有一种独一无二的作用，它使用的模板不是（ DNA）而是（ RNA ）。这种以 RNA 模板合成互补 DNA 链的性质是称为（ cDNA）技术的核心内容。 二、简述 DNA 分子的修饰酶的种类和性质？ （ 1）有多种酶可以通过添加或移除特异的化学基团而对 DNA 分子进行修饰。 （ 2） 碱性磷酸酶（ Alkaline phosphatase） 可来自大肠杆菌、小牛肠组织和北 极虾。它能去除位于 DNA 分子 5端的磷酸基团。 （ 3） 多核苷酸激酶（ Polynucleotide kinase） 来源于侵染 T4 噬菌体的大肠杆菌，其作用与碱性磷酸酶（ Alkalin
31、e phosphatase）相反，将磷酸基团加到游离的 5末端。 （ 4） 末端脱氧核苷酸转移酶（ Terminial deoxynucleotidyl transferase） 来源于小牛的胸腺组织，能将一个或多个 脱氧核苷酸 加到 DNA 分子的 3末端上。 填空题 最后一种 DNA 操作酶是 拓扑酶（ topoisomerases）可以通过引入或去除 （超螺旋）而使cccDNA（如质粒 DNA）的构像发生改变。 论述题 一、结合限制性核酸内切酶的发现简要论述该类酶，特别是 II 型限制性核酸内切酶在基因9 工程实验中的重要意义？ （ 1）基因工程要求 DNA 分子要以十分精确而且可再生的
32、方式被切割，在重组 DNA构建时 ， 载体被切割的方式足以说明这一点。必须在单一的位点切割每个载体分子，以打开环状分子使新的 DNA 分子插入。通常被克隆的 DNA 分子也有必要被切开。 （ 2）纯化的限制性核酸内切酶允许分子生物学家按基因工程要求以精确而可再生的方式切 割 DNA 分子。这些酶的发现致使三位科学家（ W.Arber, H. Smith and D. Nathans）获得了 1978 年的诺贝尔奖金，是基因工程发展的突破性进展之一。 （ 3）最初的观察研究致使 20 世纪五十年代发现了限制性核酸内切酶。当时的结果显示，一些菌株对噬菌体的感染具有免疫力，是一种被称为 宿主控制性限
33、制 的现象。 （ 4） II 型限制性核酸内切酶的集中表现的特征是每一种酶都有一个特异性识别序列，并在该处将 DNA 分子切开。一条链上的识别序，给出的方向是由 5端到 3端。 （ 5）几乎所有的识别序列都是回纹 结构（ palindromes），即当考虑到两条链时，在每条链的各自的方向上，这些序列读起来相同，例如 EcoR I 的识别序列是： 5-GAATTC-3 3-CTTAAG-5 （ 6）设计基因工程实验时，限制性核酸内切酶产生的切口的确切的性质是特别重要的。许多限制性核酸内切酶在识别序列中间直接切割双链，产生平末端或平端。 PvuII and AluI切出的切口就是平末端的。 （ 7
34、）然而，相当多的限制性核酸内切酶切割 DNA 的方式略有不同。这些酶确实不在同一位点切割双链 DNA 分子。切口有两个或四个核苷酸交错。这 样一来，产生的 DNA 片段在切口端都有短的单链 悬垂部分 。这些部分叫做 粘性末端或叫黏端 。因为它们之间的碱基配对可把 DNA 分子在粘在一起。粘端酶的一个重要特性是带有不同识别序列的限制性核酸内切酶可以产生 相同的粘性末端。 BamHI (识别序列为 GGATCC)和 BglII (识别序列是AGATCT)都产生 GATC 粘性末端。 二、在一定假设的条件下，一个已知长度 DNA 分子的识别序列的数目是可以通过数学方法计算的？请回答： 这个假设条件是
35、什么？ 举例说明数学上计 算的识别序列数目与实际识别序列数目有什么差异，这种不同又说明了什么？ （ 1）在一个已知长度的 DNA 分子上，某种特定限制性核酸内切酶识别序列的数目是可以通过数学方法计算出来的。对于 四核苷酸序列 (例如 GATC)，每 44(265 个）核苷酸有一个识别序列；对于 六核苷酸序列 ，每 46(4096 个）核苷酸有一个识别序列。 （ 2）这种算法的 假设 是 核苷酸以随机方式排列同时四种核苷酸以相等比例存在 （例如， GC 含量占 50%).。 （ 3）实际上，这两个假设没有一个是完全有效的。例如， DNA分子（大小为 49kb）对拥有六核苷酸的识 别序列的限制性合
36、算内切酶来说，应该有 12 个位点。 （ once every 46=4096） 10 （ 4） 实实 际际 上上 ， 这这 些些 识识 别别 位位 点点 发发 生生 的的 频频 率率 都都 不不 足足 ， 例例 如如 很很 小小 BglII 有 6 个， BamHI 有 5个， SalI 仅仅有 2 个 ， 这这 个个 事事 实实 反反 映映 了了 GC 的含量远小于 50%。 也反映了 DNA 分子的核苷酸不是随机排列的。 三、请叙述用限制性核酸内切酶 Bgl II 酶切 DNA（浓度为 125g/ml）方法？ （ 1）首先将一定数量的需要酶切 DNA 吸入一个离心管中，吸入的 DNA 数
37、量要依实验的性质而定。在这次实验中，我们要酶解 2g的 DNA（根 据给定的浓度我们取 16l样品即可），因此我们需要微量移液器。 （ 2）大多数限制性核酸内切酶一般适合在 pH7.4 条件下发挥功效。不同的酶依离子强度的不同而有所变化（离子强度一般由 NaCl 和 Mg2+浓度提供，所有 II 酶都需要 Mg2+激活。还需要加入某种还原剂，如二硫苏糖醇 (DTT)，以稳定酶 防止酶失活 。 （ 3）为了方便起见，我们定义一个酶单位为一小时酶切 1g DNA 的所需要的酶的数量。 （ 4）最后要考虑的是反应温度。大多数限制性核酸内切酶（包括 BglII）一般在 37酶解效果最好，但也有个别的酶
38、有所不同。 酶解应该在一个小时后完成。 （ 5）如果由酶切产生的 DNA 片段是用来进行克隆实验，那么必须要以某种方式 破坏所使用的酶 ， 目的是使它不会意外地降解后期所加入的其他 DNA 分子。 有许多方法可以使用破坏酶的活性，可以在 70 -75 短暂保温、可以使用苯酚提取、也可以加入 EDTA鳌合 Mg2+，阻止酶活性。 四、普通电泳能否检验不同大小 DNA 分子的酶解片段，为什么？凝胶电泳检验 DNA 分子酶切片段的原理是什么？ （ 1） DNA 分子，像蛋白质和其他生物复合物一样，携带有电荷，就 DNA 分子而言，常常带有负电荷 ，结果当 DNA 分子放在 电场中时，他们将向正极迁移
39、。分子的迁移率依赖于两个因素： 分子的形状和电荷 /质量的比值 。不幸的 是大多数 DNA 分子的形状相同，电荷 /质量的比值类似 ，因此不同 DNA 大小的片段不能用普通电泳进行分离。 （ 2）最后这些问题在 20 世纪 70 年代 初随着 凝胶电泳 的发展而得以解决。如果电泳在凝胶中进行， DNA 分子的大小 变成了一个可以考虑的因素。凝胶通常由琼脂糖、聚丙烯酰胺，或二这的混合物组成，他们组成了网孔结构， DNA 分子经过这些网孔到达正极。 DNA分子越小，他们向正极迁移的速度越快 ，因此凝胶电泳可根据分子的大小将他们分离。 五、简述使用凝胶电泳中 EB 的作用，效果如何，还存在那些缺点？ （ 1）最容易看到凝胶电泳结果的的方法是用可使 DNA 可视化的化合物对凝胶进行染色。 EB（溴化乙锭）通常用于琼脂糖和聚丙烯酰胺凝胶中 DNA 的染色。 （ 2）只要有充足的 DNA 存在， EB 染色后，在紫外光照射下，染色条带显示了不同大小的 DNA 片段的位置。 （ 3）不幸的是，这种染色方法十分危险，因为 EB 是一种 很强的诱变剂 同时使 DNA可视化的紫外光也能引起严重的灼伤。
