1、FGF10 单克隆抗体对银屑病皮损治疗作用研究 课题申报书提纲 一 、 课题概述 银屑病是一种常见的多发的 受多基因控制的 慢性炎症性皮肤病， 其重要组织病理学的特征性表现为角质形成细胞 (keratinocyte,KC)过度增生， 棘层增厚以及真皮血管扩张同时伴有炎细胞浸润为主要表现的皮肤病。病因和发病机制尚不完全清楚，考虑与遗传、感染、代谢障碍、内分泌紊乱及免疫因素等有关 1 。关于银屑病的治疗，目前国内外传统的治疗方法主要有以下几种： 1、全身用药，口服维甲酸，口服免疫抑制剂如环孢素、雷公藤，静脉给与免疫调节 剂等。 2、光化学疗法。 3、外用制剂，如达力士、皮质类固醇激素和维甲酸类外用
2、药等。 4、中医中药口服和外用。近几年，基于银屑病是以淋巴细胞异常活化为始发环节的免疫炎性疾病的理论，人们开发了多种抑制 T 淋巴细胞异常活化和异常活化后释放的各种细胞因子的药物，迄今己出现了与此概念相关的 20余种用于治疗银屑病的生物制品，其作用机制涵盖了从 T 细胞激活的起始点及各中间环节，如抑制 抗原提呈细胞 （ APC）的抗原提呈功能、抑制 T 细胞的活化和增殖、抑制 T 细胞粘附、抑制炎症细胞因子的生成或活性、利用细胞因子的免疫调节 作用等2-4 。 这些生物治疗药物较传统的免疫抑制剂选择性高，可通过联合疗法来发挥作用，表现出较好的发展前景。 研究表明，活化的 T 淋巴细胞、炎性细胞
3、、成纤维细胞及相互作用产生的细胞因子和炎症介质是造成银屑病病理生理异常的物质基础，对于这些细胞因子和炎症介质的异常改变，任何对银屑病的病理生理研究和任何治疗药物必然直接或间接地涉及 5。体内和体外的研究都表明， 在银屑病形成过程中，在一些生长因子的作用下 KC表现为异常增殖和分化，如表皮生长因子、转化生长因子 a和成纤维细胞生长因子等，其中成纤维细胞生长因子 10 （ fibroblast growth factors10, FGF10） 对 KC的异常增殖和分化可能起着重要的调节作用， 郗彦萍 6、7等 采用组织切片免疫组化技术检测 FGF10在寻常型银屑病患者皮损、非皮损及正常皮肤中的分布
4、， 研究了成纤维细胞生长因子 10及其 mRNA在寻常型银屑病皮损中表达情况。研究结果显示 银屑病真皮浸润的激活的淋巴细胞可分泌一些细胞因子，这些细胞因子作用于真皮成纤维细胞后，可能产生 FGF10，后者可能对维持银屑病角质形成细胞呈持续过度增殖状态密切相关。在寻常型银屑病皮损中 , FGF10 mRNA阳性主要表达于其表皮的基底层或棘层，以表皮的中下层表达较明显，角质层及颗粒层不显示阳性表达。阳性表达主要定位于细胞质、部分位于细胞核内。在真皮浅层浸润的淋巴细胞以及成纤维细胞的胞质中也可见阳性表达，在汗腺上皮细胞中呈强阳性表达；寻常型银屑病非皮损处的表皮中， FGF10 mRNA阳性表达于表皮
5、的中下层的细胞质内；正常皮肤 FGF10mR-NA阳性仅表达于表皮的基底层细胞，且表达较弱。 FGF10 mRNA检测阳性率在皮损组与正常皮肤组、非皮损组与正常皮肤组比较 ,差异均有统计学意义 (P均 0.05),三组间半定量结果比较，差异均有统计学意义(P0.05)。 FGF10mRNA在银屑病的颗粒层、角质层中表达为阴性，在表皮的下层阳性率较高，从而对 KC产生明显的促增殖作用。 因此， FGF10 mRNA 在银屑病KC异常增殖中起重要的作用。国外学者 Kovacs等 8的研究也表明，银屑病皮损中激活的淋巴细胞能刺激成纤维细胞产生 KGF和 FGF10，其结果是维持角质形成细胞呈持续过度
6、增殖的状态。 郗彦萍 与 Kovacs所报道的 FGF10在寻常型银屑病皮损中的检测结 果基本一致。 以上学者的研究结果均表明 FGF10 在银屑病表皮角质形成细胞的增生、分化中起重要作用 ，参与其发病过程。 目前公认银屑病是由 CD4+Th1 淋巴细胞和多种细胞因子介导的自身免疫紊乱性疾病 9,生物制剂以阻断不同的免疫环节为靶点 ,治疗中重度银屑病疗效显著。欧美国家已广泛应用于银屑病等免疫介导的炎症性疾病 ,展示了显著的疗效及良好的安全性 10。如：抗 CD20 抗体（利妥昔），治疗天疱疮， Kirby 等用其与甲氨蝶吟联合治疗顽固的斑块型银屑病取得了满意的效果；抗 IgE 抗体治疗特应性皮
7、炎以及其他相关的过 敏性疾病都有较好的疗效；抗 IL-8 单克隆抗体能够一直银屑病表皮角质形成细胞的过度增生，东芜宏远逸士生物技术药业有限公司研制生产了抗人白细胞介素 -8（ IL-8）单克隆抗体乳膏。因此，这种新方法受到大家的广泛关注 ， 特别是近年随着基因工程抗体技术的飞速发展 , 抗体疗法从实验研究逐渐向临床应用过渡 , 在银屑病的治疗中展示出良好的前景。 目前国内郗彦萍等采用组织切片免疫组化技术检测 FGF10 在寻常型银屑病患者皮损、非皮损及正常皮肤中的分布。结果表明，寻常型银屑病皮损、非皮损中 FGF10 的阳性检测结果均明显高于对照组，说 明 FGF10 在银屑病 KC异常增殖中
8、起重要的作用。国外研究学者 Kovacs 等研究结果显示：银屑病皮损中激活的淋巴细胞能刺激成纤维细胞产生 FGF10，从而维持 KC 呈持续过度增殖的状态。这些提示了，成纤维细胞释放的 FGF10 可能对银屑病的 KC 增值具有重要的作用，参与其发病过程。目前国内所见 FGF10 单克隆抗体研究的文献报道为本实验室本项目组成员发表。国外， FGF10 单克隆抗体应用于银屑病方面也未见报道。我们拟 采用 FGF10 的单克隆抗体作为药物对患处组织中高表达的 FGF10 进行拮抗，从而阻断或缓解角质细胞的过度增 殖，达到对银屑病的治疗目的。 本项目已经获得校内青年启动基金 2 万元的资助，项目已经
9、启动，开展了一些前期工作，我们 将已获得的高纯度 FGF10 蛋白与弗氏佐剂充分乳化作为免疫 抗原，免疫 BALB/c 小鼠后，将脾脏中的免疫淋巴 B 细胞与小鼠骨髓瘤细胞 SP2/0融合， 并 对融合细胞所分泌抗体的特异性进行筛选。经过 3 次亚克隆，获得 1株可稳定分泌抗 FGF10 单克隆抗体的杂交瘤细胞株 2G6，并对杂交瘤细胞株分泌的抗体特性进行了分析， 经复苏及多次传代后杂交瘤细胞株仍能稳定分泌单克隆抗体，其 产生抗体 亚类为 IgG1。细胞培养上清的抗体 效价达到 1:3200；诱生小鼠腹水的抗体效价为 1:25600； 2G6 腹水经辛酸 -硫酸铵方法纯化后，蛋白质含量为 3.
10、71mg/mL；腹水经纯化后抗体效价为 1:12800。 本研究目前完成了 FGF10 单克隆抗体的制备、 鉴定及纯化 ，这为下一步实验的顺利进行 准备了必需的材料 ，为项目的 深入研究奠定了基础 。 在以上研究背景启示下，我们用杂交瘤技术制备 FGF10 单克隆抗体（ FGF10 McAb），拟利用 HaCaT 细胞体外培养，研究 FGF10 以及 FGF10 McAb 对 HaCaT 细胞培养引起的增殖、抑制、细胞周期、凋亡改变，模 拟银屑病 KC 增殖 ,以求进一步明确 FGF10 及 FGF10 McAb 在银屑病表皮过度增殖机制的作用。在此基础上，进一步深入观察 FGF10 McAb
11、 对小鼠及豚鼠银屑病模型的治疗作用 ，最终确认这一新的药物靶点，为研究银屑病新的生物治疗奠定基础。 主要参考文献： 1 Szell M, Bata-Csorgo Z, Koreck A, et al. Proliferating keratinocytes are putative sources of the psoriasis susceptibility- related EDA+ (extra domain A of fibronectin) on cofetal fibronectin. J In-vest Dermatol 2004;123:537-546. 2 COTTLIEBA
12、B.Psoriasis:immuno-pathology-and-immunomodulation.DermatolClin,2001,19:649-657. 3 KREUGER G,ELLIS C N.Psoriasis-recent advances in understanding its pathogenesis and treatment.J Am Axad Dermatol,2005,53:S94-S100 4 MAN Xiao-yong, ZHENG Min ( 满孝勇 , 郑敏 ).Advances in pathogenesis of psoriasis.Journal of
13、 Zhejiang University:Medical Sciences( 浙 江 大 学 学 报 : 医学版 ),2006,35(6):673-677.(in Chinese) 5 颜文飞 ,孙国均 ,郑敏 .角质形成细胞生长因子与银屑病的关系 .国外医学皮肤性病学分册 ,2001,27(1):10-12 6 郗彦萍 ,于春水 ,谭升顺 ,周艳，张磐谏 .成纤维细胞生长因子 10 在寻常型 银屑病皮损中的检测 .中国皮肤性病学杂志 ,2006,20(11):671-674. 7 郗彦萍 ,于春水 ,谭升顺 ,周艳，张磐谏 .成纤维细胞生长因子 10mRNA 在寻常型银屑病皮损中的表达 .第
14、四军医大学学报 ,2007,28(2):150-153. 8 KovacsM, FalchiG, CardinaliS, eta.l Immunohistochemical analysis of keratinocyte growth factor and fibrblast growth factor 10 expression in psoriasis.Exp Dermato,l 2005, 14(2): 130-137. 9 Griffiths CE.The immunological basis of psoriasis.J Eur A cad Demato l V enereol.
15、2003,17(Suppl 2):1-5 10 李红，周澜华 .银屑病的生物治疗新进展 .中国皮肤性病学杂志 .2010， 24（ 9）： 863-864. 二、课题的目标与任务 1课题目标与任务需求分析 本项目总体目标：拟 用杂交瘤技术制备 FGF10单克隆抗体 ，拟利用 HaCaT细胞体外培养，研究 FGF10以及 FGF10 McAb对 HaCaT细胞培养引起的增殖、抑制、细胞周期、凋亡改变，模拟银屑病 KC增殖 ,以求进一步明确 FGF10及 FGF10 McAb在银屑病表皮过度增殖机制的作用。在此基础上，我们进一步深入观察 FGF10 McAb对小鼠及豚鼠银屑病模型的治疗作用 ，以
16、FGF10单克隆抗体 作为药物对患处组织中高表达的 FGF10进行拮抗，从而阻断或缓解角质细胞的过度增殖，达到对银屑病的治疗目的。最终确认这一新的药物靶点，为研究银屑病新的生物治疗奠定基础 。 2课题目标与任 务解决的主要技术难点和问题分析 制备 FGF10单克隆抗体 ,研究 FGF10以及 FGF10 McAb对 HaCaT细胞培养引起的增殖、抑制、细胞周期、凋亡改变，模拟银屑病 KC增殖 ,以求进一步明确 FGF10及 FGF10 McAb在银屑病表皮过度增殖机制的作用。在此基础上，进一步深入观察FGF10 McAb对小鼠及豚鼠银屑病模型的治疗作用 ,采用 FGF10单克隆抗体 作为药物对
17、患处组织中高表达 KGF-2进行拮抗，从而阻断或缓解角质细胞的过度增殖，达到对银屑病的治疗目的。 最终确认这一新的药物靶点，为研究银屑病新的生物治疗奠 定基础。 三、现有工作基础与优势 1国内外现有技术、知识产权和技术标准现状及预期分析 单克隆抗体素有“生物导弹”之称，利用单克隆抗体靶向病变组织活细胞上表面抗原已成为理想的靶向治疗方法。其特点是在局部阻断损害皮肤的自身免疫反应，而避免影响全身免疫系统的正常功能。目前已有多种有报道的单克隆抗体药物应用于皮肤病等治疗，如：抗 CD20抗体（利妥昔），治疗天疱疮， Kirby等用其与甲氨蝶呤联合治疗顽固的斑块型银屑病取得了满意的效果；抗 IgE抗体治
18、疗特应性皮炎以及其他相关的过敏性疾病都有较好的疗效；抗 IL-8单克隆 抗体能够抑制银屑病表皮角质形成细胞的过度增生，东芜宏远逸士生物技术药业有限公司研制生产了抗人白细胞介素 -8（ IL-8）单克隆抗体乳膏。因此，这种新方法受到众多研究者的广泛关注，特别是近年随着基因工程抗体技术的飞速发展 , 抗体疗法从实验研究逐渐向临床应用过渡 , 在银屑病的治疗中展示出良好的前景。 2课题申请单位及主要参与单位研究基础（已有的研究开发经历，科技成果、科研条件与研究开发队伍现状等） （ 1）本项目研究基础 本项目组 将 KGF-2 蛋白与弗氏佐剂充分乳化作为免疫 抗 原，免疫 BALB/c小鼠后，采用 5
19、0%的 PEG4000 为细胞融合剂，将脾脏中的免疫淋巴 B 细胞与小鼠骨髓瘤细胞 SP2/0 融合， 后用 间接 ELISA 方法对融合细胞所分泌抗体的特异性进行筛选。经过 3 次亚克隆，获得 1 株可稳定分泌抗 KGF-2 单克隆抗体的杂交瘤细胞株 2G6。 具体如下： (1)免疫效果 经过 3次腹部皮下多点注射免疫， 4只小鼠均产生抗 FGF10抗体。抗血清的效价达到 1:3200，符合细胞融合的要求，取脾融合（见表 1、图 1）。 表 1 小鼠血清抗体效价测定结果 抗体稀释倍数 鼠 1 鼠 2 鼠 3 鼠 4 1:800 1.873 1.802 1.922 1.827 1:1600 1
20、.464 1.397 1.492 1.413 1:3200 1.072 0.983 1.207 1.138 空白对照 0.058 0.056 0.058 0.057 阴性对照 0.202 0.207 0.204 0.202 图 1 经免疫后小鼠的脾 脏 图 2 融合后第 7 天生长状态 (2) ELISA 条件的确定 通过棋盘滴定法的筛选，摸索了间接 ELISA 检测方法检测血清效价的最佳条件。 FGF10 抗原包被浓度： 500ng/mL； 1%BSA 的 PBST 溶液做为封闭液；酶标二抗稀释倍数： 1:2000。 (3) 细胞融合结果 进行了 3 次细胞融合，第一次融合率较低，第二、三次
21、融合的融合率依次有所提高；经间接 ELISA 筛选，第三次融合后得到阳性细胞株 28 株，共得到阳性细胞株 41 株。经过对融合阳性孔连续 3 次克隆筛选，最后阳性率 100%的杂交瘤细 胞中选出最好的细胞传瓶扩大培养，最终得到 1 株能够稳定分泌抗 FGF10 单克隆抗体的杂交瘤细胞株 2G6。细胞生长状况见图 2；细胞融合结果见表 2。 表 2 细胞融合率及阳性率 融合次数 分装孔数 克隆生长数 融合率 阳性孔数 阳性率 1 288 12 4.2% 2 16.7% 2 384 67 17.4% 11 16.4% 3 288 98 34% 28 28.6% (4) 单抗亚类的鉴定 按照试剂盒
22、说明，利用抗原介导的 ELISA 法检测杂交瘤细胞株 2G6 的亚类类型，见表 3，结果表明该抗体为 IgG1 型 。 表 3 单抗亚类鉴定 细胞株 IgA IgM IgG1 IgG2a IgG2b IgG3 2G6 0.081 0.172 0.121 0.101 0.120 0.103 (5) 抗体腹 水及纯化后 SDS-PAGE 电泳结果 腹水及纯化后腹水经 SDS-PAGE 分析 (图 3)显示，未纯化的样品杂蛋白带较多，纯化后的单克隆抗体有明显的两条带，分别为抗体的轻链和重链。说明腹水经纯化后绝大部分杂蛋白被除去。利用 Maker（ 97.2、 66.4、 44.3、 29.0、 20
23、.1、 14.3KDa）中的标准蛋 图 3 腹水 SDS-PAGE 结果 1. Marker 2、 3. 未纯化的腹水纯化后腹水 4、 5. 纯化后腹水 白在凝胶中的相对迁移与分子量的关系做标准曲线，横坐标为标准蛋白的相对迁移率，纵 坐标为分子量的对数。用 Excel进行曲线拟合并求回归方程。将 2G6 分泌抗体的重链和轻链在凝胶中的相对迁移率代入回归方程。分别计算出其分子量，再根据 IgG 中重链和轻链的比例关系，计算得出 2G6 分泌抗体分子量约为 161KDa。 （ 2）工作条件 工作基础： 本项目申请人 主要从事生物制药相关工作，主要研究方向为抗体免疫、细胞生物活性。目前主持该方面的省
24、级基金 1 项，主持校内启动基金1 项，并同时参与国家级省级项目 2 项，发表文章 8 篇，课题组已经成功制备了FGF10 单克隆抗体并进行了鉴定及纯 化，并发表相关文章 2 篇，因此工作基础较好，完全有能力完成该项工作。 技术准备： 本项目组人员长期以来，从事生长因子研究工作。本项目申请人所在课题组依托于工程研究中心，主要以生物反应器及新型药物的基础研究、应用开发、工程转化为主，主要开展各种成纤维细胞生长因子的研究工作。本项目申请人所从事专业为细胞生物学，熟练掌握单克隆抗体制备技术、 Western Blot、免疫组织化学、免疫细胞化学等分子生物学方法，为本项目的顺利实施积累了可行的技术和方
25、法。因此工作基础好，完全有能力完成该项 工作。 仪器设备： 本课题依附于工程中心，在分子生物学与动物细胞培养方面，经历几年的建设， 投入了 2000 万元购置了大批国外先进设备，其基础设施方面达到国内领先水平。目前中心已具备了分子生物学细胞生物学的常规和现代仪器设备，包括 PCR 仪、流式细胞仪、激光共聚焦显微镜、 CO2 培养箱、倒置显微镜、高速低温离心机、超低温冰箱、超净工作台、凝胶成像系统等，并具备实验条件良好的细胞培养室。为本实验的顺利完成提供了实施保障。动物实验部分在团队的合作单位某大学动物中心进行，银屑病模型制备方 法已经成熟，为确保实验的准确，本项目分别选用小鼠和豚鼠，分别用不同
26、的方法制作银屑病样皮炎的动物模型，观察 FGF10 McAb 膏剂对银屑病皮损的治疗作用。目前的实验条件能够保证本实验的顺利进行。 人员配备： 本课题组配备了与本项目研究有关的从事细胞生物学、动物免疫学、生物技术等方面的专业人员和研究生，人员结构合理，有能力完成本项目所拟定的研究内容。 动 物实验部分： 在吉林大学动物中心进行，银屑病模型制备方法已经成熟，为确保实验的准确，本项目分别 选用小鼠和豚鼠，分别用不同的方法制作银屑病样皮炎的动物模型，观察 FGF10 McAb 膏剂对银屑病皮损的治疗作用。目前的实验条件能够保证本实验的顺利进行。 四、任务分解与考核指标 1课题研究内容、技术路线和创新
27、点 (1)课题的研究内容 通过杂交瘤技术，建立稳定分泌 FGF10 McAb 杂交瘤细胞株 将 FGF10 蛋白与弗氏佐剂充分乳化作为免疫 抗 原，免疫 BALB/c 小鼠后，采用 50%的 PEG4000 为细胞融合剂，将脾脏中的免疫淋巴 B 细胞与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0 融合， 后用 间接 ELISA 方法对融合细胞所分泌抗体的特异性进行筛选。经过 3 次亚克隆，获得可稳定分泌抗 FGF10 单克隆抗体的杂交瘤细胞株 。 FGF10 McAb 的大量生产及纯化及鉴定，得到高亲和力的 FGF10 McAb 将杂交瘤细胞悬浮后置于 24 孔细胞培养板中，补加适量培养液培养。待细胞长满后用上述
28、同样的方法转入 50mL 细胞培养瓶中扩大培养。经过多次传代培养后，选取生长状态良好的细胞冻存。 采用小鼠腹水法大量制备单克隆抗体。 研究 FGF10及 FGF10 McAb 对 HaCaT 细胞增殖的影响 HaCaT 细胞是正常突变的永生化人角质形成细胞株 ,许多生物学特性与原代KC相同 ,Finch等学者也都采用 HaCaT细胞株研究银屑病的病理生理改变 ,模拟银屑病 KC 增殖。本研究也采用这种方法，观察被干预后 HaCaT 细胞的增殖、分化和凋亡情况。 a MTT 法检侧 FGF10 对 HaCaT 细胞增殖的影响 文献报告银屑病 FGF10 表达增高，本实验拟用作 FGF10 为诱导剂，检测 FGF10对 HaCaT 细胞增殖作用，从体外实验层面研究 FGF10 对 HaCaT 细胞增殖的影响 ,
