1、名词解释及问答总体1. 生物催化 利用生物催化剂（微生物、酶等）改变或通常是加快化学反应速度，获得生物产品的过程。典型的生物催化反应系统：系统构成三要素：反应物、催化剂和反应介质2. 双水相萃取系统 某些亲水性高分子聚合物的水溶液超过一定浓度后可以形成两相，并且在两相中水分均占很大比例，即形成双水相系统。利用亲水性高分子聚合物的水溶液可形成双水相的性质，待分离组分在两相中分配系数有所差异可达到分离的目的。3. 浊点系统 当一种非离子表面活性剂的水相胶束溶液温度达到其浊点以上，或者在存在某些添加剂的情况下，会导致相分离，形成一个表面活性剂稀少相（水包油乳液）和一个表面活性剂富集相( 油包水乳液)
2、，后者又称凝聚相，其中包含许多大的水泡，可容纳细胞或溶解的酶分子。这样的系统被称为浊点系统，它曾被用于分离技术中，即浊点萃取。4. 离子液体 离子液体实质上是一些凝固点较低的盐。离子液体作为一类极性溶剂，能溶解许多有机化合物。 与普通有机溶剂最大的区别在于： 离子液体不会挥发(没有蒸气压) ，对环境比较友好，用于工业生产也相对比较安全； 它们与许多有机溶剂互不相溶，可以形成有机溶剂-离子液体两相系统或者有机溶剂 -水-离子液体三相系统，从而为溶剂工程在生物催化反应中的应用提供了新的可能。 一般而言，离子液体通常有三种方式被应用于生物催化过程：作为单一的溶剂；作为共溶剂添加于水相系统中；与水形成
3、两相系统。5. 逆胶束系统逆胶束系统是含有表面活性剂与少量水的有机溶剂系统。表面活性剂分子由疏水性尾部和亲水性头部两部分组成，在含水有机溶剂中，它们的疏水性基团与有机溶剂接触，而亲水性头部形成极性内核，从而组成许多个逆胶束，水分子聚集在逆胶束内核中形成“微水池”，里面容纳了酶分子，这样酶被限制在含水的微环境中，而底物和产物可以自由进出胶束。 6. log P 规则 log P 是衡量物质疏水性强弱的一个特征参数，log P 值越大，溶剂的疏水性越强，其夺取酶分子必需水的能力越弱。P=C 正辛醇 /C 水.7. 未培养微生物 表示的是活的但不可培养微生物的概念，将菌种转到不含营养物质的盐水中，经
4、常长时间的低温保存，细菌会进入一种数量不减、有代谢活力、但在正常试验室培养条件下不能生长产生菌落的状态，把这种状态的微生物成为未培养微生物。8. 酶必需水 指维持酶空间构象和分子结构所需的最低水量。9. 微乳液 微乳液一般是由表面活性剂、助表面活性剂、油与水等组分在适当比例下组成的无色、透明(或半透明 ) 、低粘度的 热力学体系。10. 膜反应器膜反应器是膜过程和反应过程相结合的新技术。同时具备了 反应和分离的步骤。具有一系列优点：反应和分离组合成单一的单元过程，降低分离等过程的费用；对于可逆反应，突破热力学平衡限制，通过膜扩散过程移走产物，使转化率达到 100%；调节反应过程参数，缓和反应条
5、件，提高目的产物的选择性和产率，减少副反应。11.易错 PCR 技术是指通过改变 PCR 反应条件来调整 PCR 反应中的突变频率，降低聚合酶固有的突变序列的倾向性，提高突变谱的多样性，使得错误碱基随机地以一定的频率掺入到扩增的基因中，从而得到随机突变的 DNA 群体，最后用合适的载体克隆突变基因。12 基因重排技术 DNA shuffling从两条以上的正突变基因出发，经过酶切和不加引物的 PCR 扩增，使碱基序列重新排布而引起基因突变13 基因家族重排技术 DNA family shuffling 从基因家族的若干基因出发，经过酶切和不加引物的 PCR 扩增，使碱基序列重新排布而引起基因突
6、变问答题1. 简述影印平板培养法原理及其应用。影印平板培养法，是一种能达到在一系列培养皿的相同位置上出现相同遗传型菌落的接种培养方法。把长有许多菌落的母种培养皿倒置于包有灭菌丝绒布的木质圆柱印章上，使其沾上来自平板上的菌落。然后可把这一“印章”上的菌落一一接种到不同的选择性培养基平板上。待这些平板培养后，对各平板相同位置上的菌落作对比后，就可选出适当的突变型菌株。影印法目前已广泛应用于营养缺陷型的筛选以及抗药性菌株筛选等研究工作中。通过影印培养法，就可以从在非选择性条件下生长的细菌群体中，分离出各种类型的突变菌种。2. 简述酶分子的理性设计。指在了解酶分子结构，空间特点等的结构基础上，通过改变
7、外界条件或者定向突变某一位点，从而增强酶的稳定性或提高酶活力大小。具体包括以下内容：（1）分子模建：根据已知的目标酶一级结构序列，构建蛋白质的分子图像；（2）理性设计突变位点：通过对酶结构与性能之间的关系的理性分析，确定需突变的氨基酸残基；（3）酶的突变与表达：通过基因工程手段，对酶基因 DNA 进行定点突变。选择合适的表达载体与宿主，对突变酶进行高效表达对突变酶的性质进行分析，指导新一轮理性设计理性设计改造的优势及其局限性目标明确，工作量较小。目前，研究确定了影响酶稳定性(热稳定性、pH 稳定性、有机溶剂耐受性等性质 )的许多结构特征，理性设计在改善酶稳定性方面具有较高的成功可能性。对其它基
8、本性质(如活性、底物特异性、对映选择性) 和结构之间的关系的理解还非常不充分，其结构影响参数难以清楚地界定，成功范例较少。有理设计改造将来的进步主要依赖酶结构-功能方面的重大认识突破，其次在于结构生物学方面结构鉴定的进展，和生物信息学方面模建程序的完善。3. 简述非水相生物催化的优点。(1) 能提高非极性（水难溶）底物的溶解度；(2) 使热力学平衡向有利于合成的方向偏移；(3) 改变酶对底物的专一性, 包括位置和立体专一性； (4)能抑制依赖于水的某些不利反应( 如酸酐和卤化物的水解，酚/ 醌的聚合等) ；(5) 由于酶不溶于有机溶剂而无须固定化，或简单吸附于无孔表面( 如玻璃珠)即可；(6)
9、 可通过过滤或离心等简单方法回收酶，反复利用；(7) 从低沸点溶剂中可以较容易地分离产物；(8) 酶的稳定性提高；(9) 消除了微生物的污染；(10) 酶可能被直接应用于化工过程。4. 简述微水有机溶剂单相系统和水有机溶剂单相系统的区别。微水有机溶剂单相系统，是指用与水不互溶的有机溶剂取代所有的溶剂水(98%) ，形成固相酶分散在有机溶剂中的非均相反应体系。处于这种体系中的酶，其表面必须有残余的结构水，才能保证其催化活性。一般有机溶剂中含有小于 2%的微量水。一般而言，酶在微水有机溶剂体系中稳定性较好，但催化活力要比水相中低得多，部分原因是因为酶在有机相不溶，许多酶分子聚结成团，影响了颗粒内部
10、酶分子的催化效率。水有机溶剂单相系统，是一种水和有机溶剂互溶的单相均相反应体系，酶在此系统中是游离状态的存在于均相的反应体系中，所以在此系统中酶的空间构象受水分影响比微水有机溶剂单相系统小，一般来讲，该系统中与水互溶有机溶剂的量可达总体积的 10%20% (体积分数 )，在一些特殊的情况下，甚至可高达 90%以上。有些酶(如酯酶和蛋白酶) 在水-有机溶剂均相系统中的反应选择性会增加；往往需要添加有机助溶剂等进行此系统的制备。5. 请回答下图中（a）-（f）分别代表酶在有机溶剂中的哪一种使用方式。(a) 水与水溶性溶剂的均相混合物 (b) 水-有机溶剂两相系统 (c) 悬浮于溶剂中的酶粉 (d)
11、 悬浮于溶剂中的载体固定化酶 (e) 酶溶于由水、有机溶剂和表面活性剂组成的微乳状液 (f) 可溶于有机溶剂的共价 修饰酶（或者用过不同化学键合形成的酶）6. 简述酶及细胞固定化方法。A 载体结合法 (a) 共价结合法(b) 离子结合法(c) 物理吸附法(d) 生化特异结合法 B. 自身交联法 C.包埋法 (a) 格子型(b) 微胶囊 D. 复合法，将上述两种方法组合使用的固定化方法。例如:吸附+交联,吸附 +包埋, 包埋+交联固定化酶便于操作、易于分离、反复利用。固定化酶的优点体现在以下几点：便于分离，固定化酶易与反应液分离，产物溶液中没有酶的残留，简化了产品提纯工艺；重复利用，固定化酶可较
12、长时间地反复、分批操作或装柱连续反应，有利于工艺的连续化、自动化和管道化；稳定性高，固定化酶的稳定性一般会有较大提高。7. 简述酶分子修饰的原理。酶分子修饰通过对蛋白酶主链的剪接切割和侧链的化学修饰对酶分子进行改造，改造的目的在于改变酶的一些性质，创造出天然酶不具备的某些优良性状，扩大酶的应用已达到较高的经济效益。酶的化学修饰，通过对酶蛋白分子的主链进行“切割”、 “剪切 ”以及在侧链上进行化学修饰来达到改造酶分子的目的。这种应用化学方法对酶分子施行种种“手术”的技术称为酶化学修饰。酶分子的化学修饰简单，容易见效。修饰剂的要求：一般情况下，要求修饰剂具有较大分子量、有良好的水溶性和生物相容性，
13、修饰后酶的半衰期长。反应条件的选择：反应要在酶稳定的环境下进行，避免破坏酶的活性集团。控制酶分子与修饰剂的分子比例，反应温度，时长。确保酶的高结合率和高回收率。金属离子置换修饰；大分子结合修饰(共价/非共价;多结合水不溶分子) ；侧链基团修饰( 多结合水溶解性小分子)；肽链有限水解修饰；氨基酸置换修饰；酶分子的物理修饰。酶分子物理修饰，可以了解不同物理条件下，特别是在极端条件下（高温、高压、高盐、极端 pH 值等）由于酶分子空间构象的改变而引起酶的特性和功能的变化情况。酶的基因工程修饰，酶的基因工程主要利用基因工程解决酶的大量生产和天然酶分子的改造。在酶的蛋白质基础上利用基因工程将两种或两种以
14、上的酶的不同结构片段构成新的酶，使酶具有多种生产需要的功能特点。8. 简述酶分子定向进化原理及策略人为创造特殊的条件，模拟自然进化机制，在体外对基因进行随机突变；从一个或多个已经存在的亲本酶(天然的或者人为改造的 )出发，经过基因的突变和重组，构建人工突变酶库，采用高效的筛选或选择方法，最终获得具有某些优良特性的进化酶。定向进化=随机突变/正向重组 +定向选择/ 筛选 现有酶的分子改造包括理性设计：在深入了解酶的结构、功能和催化机制等信息的基础上，对酶的突变位点进行精确设计，采用基因工程手段对天然酶的序列进行改造，获得具有所需性能的新酶。定向进化通过随机突变、DNA 重组等手段对酶的基因序列进
15、行改造，并对获得的突变酶库进行定向筛选获得性能优异的突变酶。定向进化策略具体包括：高突变菌株；易错 PCR；DNA 改组；外显子改组； 杂合酶；PCR 体外随机引发重组； 交错延伸法； 随机定向突变等。9. 简述非水介质中影响酶活性的因素有哪些？并解释溶剂极性对酶活性的影响？非水溶剂中酶的选择性取决于底物的去溶剂化能力。 非水溶剂对酶稳定性有影响，有机溶剂能够增加酶构象的刚性，尤其是在低水含量的疏水性有机溶剂中提高酶的稳定性。在所有含溶剂的生物催化系统中，溶剂的性质会在很大程度上影响酶的活性、选择性和稳定性。其中起关键作用的是溶剂的极性。降低介质的介电常数将导致酶分子中带电残基之间静电作用力的
16、增加。这可能会降低酶分子的柔性，进而降低酶催化的活力。遵循 log P 规则。10. 简述有机溶剂中微量水对酶催化活性的影响？酶都溶于水，只有在一定量的水存在的条件下，酶分子才能进行催化反应。所以酶在有机介质中进行催化反应时，水是不可缺少的成分之一。有机介质中的水含量多少对酶的空间构象、酶的催化活性、酶的稳定性、酶的催化反应速度等都有密切关系，水还与酶催化作用的底物和反应产物的溶解度有关。 酶分子只有在空间构象完整的状态下，才具有催化功能。在无水的条件下，酶的空间构象被破坏，酶将变性失活。故此，酶分子需要一层水化层，以维持其完整的空间构象。维持酶分子完整的空间构象所必需的最低水量称为必需水12
17、 脂肪酶催化的界面活化原理生物柴油：常见的类型为脂肪酸甲酯生物催化反应系统的组成 系统构成三要素：反应物、催化剂和反应介质构象工程 (Conformational Engineering) 酶在溶液中的空间构象是柔性可变的：环境 结构 功能！ 通过改变反应环境(溶液性质) 即有可能调节酶的空间构象, 优化强化酶的催化性能。非水相生物催化技术 近 20 年来酶工程领域最大的突破 长期以来,人们一直错误地认为酶只能在水溶液中使用; 若与有机溶剂接触，就会变性失活。 由于大多数有机化合物在水中很难溶解，有些还不稳定，因此化学合成大多使用有机溶剂作为反应介质，从而忽略了对生物催化剂的开发和应用。 19
18、84 年， A.M.Klibanov 在 Science 上发表“Enzymatic Catalysis in Organic Media at 100” ，使原来认为生物催化必须在水溶液中进行的酶学概念发生了革命性的变化。 酶可以在含有各种有机溶剂和微量水分的非水介质系统中发挥催化作用，并且所表现出的催化性能(如活力、选择性、稳定性)与在常规水溶液介质中的性能截然不同，从而极大地扩展了生物催化剂的应用范围。 介质工程 在设计、优化工业生物催化的反应介质系统时，我们不应简单地从一个极端(100%水)走向另一个极端(100%有机溶剂)，必须根据反应底物/产物和生物催化剂的特性，具体情况具体分析。
19、 通过非水相介质系统的多样性变化，也可以在很大程度上调控酶的催化性能，达到“蛋白质工程”所欲达到的类似效果，因此才提出了“溶剂工程” 、 “介质工程”或“微环境工程”等概念。有机介质中生物催化的优点 有利于疏水性底物的反应 可提高酶的热稳定性 能催化水中不能进行的反应 可改变反应平衡移动方向 可调控酶的底物专一性 可防止由水引起的副反应 可扩大反应 pH 值的适应性 酶易于实现固定化 酶和产物易于回收 可避免微生物污染 有机介质中使用酶的不同方式 (a) 水与水溶性溶剂的均相混合物 (b) 水-有机溶剂两相系统 (c) 悬浮于溶剂中的酶粉 (d) 悬浮于溶剂中的载体固定化酶 (e) 酶被增溶于
20、由水、有机溶剂和表面活性剂组成的微乳状液 (f) 可溶于有机溶剂的共价修饰酶典型的生物催化介质系统种类 水或缓冲溶液系统； 水-有机溶剂单相系统 水-有机溶剂两相系统; 乳状液或微乳液系统 微水有机溶剂单相系统; 超临界流体系统 离子液体介质系统 无溶剂反应系统 双水相系统; 浊点系统单一的水或缓冲溶液系统 由于酶的构象与其离子化状态密切相关，因此酶的体外实验研究通常在一定浓度的缓冲溶液体系中进行，这样可保证酶在最佳 pH 附近发挥最大的活力。均相水-有机溶剂系统 增加亲脂性底物溶解度的一个最简单办法是向反应混合物中加入与水互溶的有机溶剂，通常被称为有机助溶剂(organic cosolven
21、t)。 常用的助溶剂有二甲亚砜(DMSO)、二甲基甲酰胺(DMF)、四氢呋喃(THF)、二氧六环(dioxane)、丙酮和低级醇等。 一般来讲，该系统中与水互溶有机溶剂的量可达总体积的 10%-20%(体积分数)，有的甚至高达 90%. 水-有机溶剂两相系统 水-有机溶剂两相系统是指由水相和非极性有机溶剂相(烃、醚、酯等)组成的非均相反应系统; 两相的体积比可以在很宽的范围内变动。 底物和产物则主要溶于有机相中; 酶溶解于水相中，这样可使酶与有机溶剂在空间上相分离，以保证酶处在有利的水环境中，而不直接与有机溶剂相接触。水-有机溶剂两相系统 水-有机溶剂两相系统已成功地用于强疏水性底物(如甾体、
22、脂类、烯烃类和环氧化合物)的生物转化。 例如，在两相体系中已成功地实现微生物催化的烯烃不对称环氧化：珊瑚诺卡氏菌(Nocardia corallina)生物转化烯烃产生的环氧化物被及时转移到有机相中，使得产物环氧化物对微生物的毒性降低到最低程度。 巨大芽孢杆菌环氧水解酶催化的缩水甘油苯基醚的对映选择性开环水解反应也适合于在两相系统中进行，由于不稳定的环氧底物大部分溶解在异辛烷中，因此不但可以减少其自发水解，而且可以减轻其对酶的抑制，从而便于大幅度增加有机相中底物和产物的浓度，有助于提高生物催化的效率 乳状液或微乳液系统 反相胶束体系能够较好地模拟酶的天然状态，在逆胶束系统中，大多数酶能够保持催
23、化活性和稳定性，甚至表现出“超活性”(super activity)。 自 1974 年 Wells 发现磷脂酶 A2 在卵磷脂-乙醚-水逆胶束系统中具有催化卵磷脂水解活性以来，胶束酶学(micelle enzymology)的研究和应用在国内外引起广泛的关注。 逆胶束系统是含有表面活性剂与少量水的有机溶剂系统。表面活性剂分子由疏水性尾部和亲水性头部两部分组成，在含水有机溶剂中，它们的疏水性基团与有机溶剂接触，而亲水性头部形成极性内核，从而组成许多个逆胶束，水分子聚集在逆胶束内核中形成“微水池” ，里面容纳了酶分子，这样酶被限制在含水的微环境中，而底物和产物可以自由进出胶束。 逆胶束系统优点
24、组成的灵活性：大量不同类型的表面活性剂、有机溶剂甚至是不同极性的物质，都可用于构建适宜于酶反应的逆胶束系统； 热力学稳定性和光学透明性：逆胶束是自发形成的，因而不需要机械混合，有利于规模放大； 逆胶束有非常高的比界面积：远高于有机溶剂-水两相系统，使底物和产物在相间的转移变得极为有利； 逆胶束的相特性随温度而变化：这一特性可以简化产物和酶的分离纯化。例如马肝醇脱氢酶在 AOT 或 C12E5 逆胶束系统中催化 4-甲基环己酮还原生成 4-甲基环己醇，反应后通过温度诱导可使产物回收到有机相中，而酶、辅酶在水相中，并可多次循环反复使用，每一次循环酶活性损失很小。 逆胶束中的酶催化反应可用于油脂水解、辅酶再生、消旋体拆分、肽和氨基酸合成和高分子材料合成。色氨酸合成可采用色氨酸酶催化吲哚和丝氨酸缩合而成，由于吲哚在水中溶解度很低、且对酶有抑制作用。Eggers 运用 Brij-Aliguat 336-环己醇为逆相胶束系统，建立了膜反应器中逆胶束酶法合成色氨酸的生产工艺。乳状液系统 在脂肪酶催化拆分酮基布洛芬酯的水解反应中,使用添加剂，可使脂肪酶活性和选择性提高 1-2 个数量级！
