1、生物工程下游技术复习题一、名词解释包含体：一种蛋白质不溶性聚集体，包括目标蛋白、菌体蛋白等。目标蛋白一级结构是正确的，但立体结构是错误的，所以没有生物活性。细胞破碎技术：是指利用外力破坏细胞膜和细胞壁，使细胞内物质包括目的产物成分释放出来的技术。双水相萃取：利用溶质在两水相中的选择性分配，萃取分离目的产物，称为双水相萃取。生物工程下游技术：又叫生物分离工程，是研究生物制品分离和纯化的工程技术学科，是生物工程中不可缺少的组成部分 。离子交换：利用离子交换树脂作为吸附剂，将溶液中的待分离组分，依据其电荷差异，依靠库仑力吸附在树脂上，然后利用合适的洗脱剂将吸附质从树脂上洗脱下来，达到分离的目的。反萃
2、取：在完成萃取操作后，为进一步纯化目标产物或便于下一步分离操作的实施，将目标产物从有机相转入水相的操作就称为反萃取。膜分离技术：利用膜的选择性（孔径大小） ，以膜的两侧存在的能量差作为推动力，由于溶液中各组分透过膜的迁移率不同而实现分离的一种技术。反渗透：是一种以压力差为推动力，从溶液中分离出溶剂的膜分离操作；吸附色谱：利用组分在吸附剂（固定相）上的吸附能力强弱不同而得以分离的方法；纳滤（NF）：以压力差为推动力，从溶液中分离 3001000 小分子量的膜分离过程；带溶剂：能和产物形成复合物，使产物更易溶于有机溶剂相中，该复合物在一定条件下又要容易分离。浸取：用某种溶剂把有用物质从固体材料中提
3、取到溶液中的过程称为浸取或浸出。固定相：在色谱法中，将填入玻璃管或不锈钢管内静止不动的一相（固体或液体）称为固定相。盐析法：在高浓度的中性盐存在下，蛋白质（酶）等生物大分子物质在水溶液中的溶解度降低，产生沉淀的过程。水通量：每单位时间内透过单位膜面积的水体积流量，也叫透水率，即水透过膜的速率。离子交换色谱法：利用组分在离子交换剂（固定相）上的亲和力大小不同而达到分离的方法。沉淀法：利用添加沉淀剂或改变溶液的 pH 值、离子强度和极性等方法使所需提取的生化物质或杂质在溶液中的溶解度降低而形成无定形固体沉淀的过程。电渗析（ED） ：以电位差为推动力，利用离子交换膜的选择透过性，从溶液中脱除或富集电
4、解质的膜分离操作；分配色谱法：又称液液色谱，利用组分在固定液（固定相）中溶解度不同而达到分离的方法；二、简答1、细胞破碎的方法有哪些？机械破碎：通过机械运动产生的剪切力，使组织、细胞破碎。捣碎法、研磨法、匀浆法、超声法 物理破碎：通过各种物理因素的作用，使组织、细胞的外层结构破坏，而使细胞破碎。温度差破碎法、压力差破碎法化学破碎：通过各种化学试剂对细胞膜的作用，而使细胞破碎。有机溶剂、表面活性剂、酸碱酶促破碎：通过细胞本身的酶系或外加酶制剂的催化作用，使细胞外层结构受到破坏，而达到细胞破碎自溶法、外加酶制剂法2、比较凝聚和絮凝？凝聚：指在中性盐（铝、铁的盐类）作用下，由于双电层排斥电位的降低，
5、而使胶体脱稳并使粒子相互聚集成mm 大小块状凝聚体的过程。絮凝：指使用高分子絮凝剂（天然的和合成的大分子量聚电解质）将胶体粒子交联成网，形成 10 mm 大小絮凝团的过程。其中絮凝剂主要起架桥作用。3、收率的计算题利用乙酸乙酯萃取发酵液中的放线菌素 D，pH=3.5 时，k=57，料液流速 450L/h，萃取剂流量 39L/h，计算采用三级错流萃取和三级逆流萃取的萃取因素 E 和理论收率各为多少？ =57*450/39=657.7三级错流=（657.7+1） 31/(657.7+1)3=三级逆流4、气液色谱中色谱柱中载体有哪些特点？1、不溶性；2、渗透性，即具有疏松的网状结构，容许大分子自由通
6、过；3、高硬度及适当的颗粒形式，最好为均匀的珠状；4、最低的吸附力；5、较好的化学稳定性；6、抗微生物和酶的侵蚀；7、亲水性；8、具有大量的供反应的化学基团，能与大量配基共价连接。5、双水相萃取的特点1）操作条件温和，整个操作过程在常温常压下进行，利于保持生物分子的活性；2）双水相萃取克服了有机溶剂萃取中蛋白容易失活和强亲水性蛋白难溶于有机溶剂的缺点。3）双水相系统之间的传质和平衡过程速度快，回收效率高。4）不存在有机溶剂残留问题，高聚物一般是不挥发性物质，因而操作环境对人体无害；6、发酵液预处理的目的？nnnE)1()(11 1n提高从悬浮液中分离固形物的速度和固液分离的效率 改变发酵液的物
7、理性质，包括增大悬浮液中固体粒子的尺寸，降低液体黏度； 尽可能使产物转移到液相 相对纯化，去除发酵液中的部分杂质（高价无机离子和杂蛋白质)； 7、醋酸纤维素膜的特点？优点：水渗透流率高，适合作反渗透膜来源丰富，价格便宜无毒，制膜工艺简单缺点：热稳定性差，不耐温（30）易水解，易压密抗氧化性能差抗微生物侵蚀性能差8、认图（膜分离并简述特点）1）透析法蛋白质、无机盐无机盐 缓冲液2）反渗透3）利用具有一定孔径大小、高分子溶质不能透过的亲水膜，将含有高分子溶质和其它小分子溶质的溶液与水溶液或缓冲液分隔；由于膜两侧的溶质浓度不同，在浓差的作用下，高分子溶液中的小分子溶质（如无机盐）透过膜向水渗透，这就
8、是透析。透析法的应用：常用于除去蛋白或核酸样品中的盐、变性剂、还原剂之类的小分子杂质，由于透析过程以浓差为传质推动力，膜的透过量很小，不适于大规模生物分离过程、但在实验室中应用较多。透析法在临床上常用于肾衰竭患者的血液透析。利用反渗透膜选择性的只能通过溶剂（通常是水）而截留其他溶质的性质，以膜两侧静压差为推动力，使溶剂通过反渗透膜实现对液体混合物进行分离的过程。反渗透的应用：在膜分离的应用中，反渗透的应用最广泛。海水和苦咸水脱盐制饮用水；制备医药、化学工业中所需的超纯水；低相对分子质量水溶性组分的浓缩和回收； 用于浓缩过程，不会破坏生物活性，不会改变风味、香味。（食品工业中果汁、糖、咖啡的浓缩
9、；电镀和印染工业中废水的浓缩；奶品工业中牛奶的浓缩）3）微滤、超滤、纳滤、反渗透微滤、超滤、纳滤、反渗透相同点以膜两侧压力差为推动力；按体积大小而分离；膜的制造方法、结构和操作方式都类似微滤、超滤、纳滤、反渗透区别： 膜孔径：微滤（0.110m） 超滤（0.010.1m ） 纳滤（0.0010.01 m） 反渗透（小于 0.001m） 分离粒子：微滤截留固体悬浮粒子，固液分离过程；超滤、纳滤、反渗透为分子级水平的分离； 分理机理：微滤、超滤和纳滤为截留机理，筛分作用；反渗透机理是渗透现象的逆过程： 压差：微滤、超滤和纳滤压力差不需很大 0.10.6 MPa4）电渗析+固定离子Cl-Na+-电渗
10、析：膜 的 分 类 与 物 性反 渗 透纳 滤超 滤微 滤 单 价 盐不 游 离 酸水悬 浮 粒 子大 分 子糖二 价 盐游 离 酸 利用待分离分子的电荷性质和分子大小的差别，以外电场电位差为推动力，利用离子交换膜的选择透过性，从溶液中脱除或富集电解质的膜分离操作；电渗析器主要组成部分是离子交换膜。分为阳膜，阴膜。阳膜只充许阳离子通过而阴离子被阻挡；阴膜只充许阴离子通过而阳离子被阻挡。 电渗析的应用：工业上多用于海水、苦咸水淡化和废水处理；生物分离中可用于氨基酸和有机酸等小分子的脱盐和分离纯化。9、酶解法细胞破碎的优缺点？优点：1）发生酶解的条件温和2）能选择性地释放产物3）胞内核酸等泄出量少
11、，细胞外形较完整缺点：1）溶酶价格高2）溶酶法通用性差（不同菌种需选择不同的酶)3）产物抑制的存在10、沉淀法优缺点？优点：1) 操作简单；成本低；收率高；2)浓缩倍数高可达 l0-50 倍；3)不会使蛋白质等大分子失活缺点：针对复杂体系而言，分离度不高、选择性不强11、溶剂萃取法的特点？1)萃取过程有选择性；2)能与其它步聚相配合；3)通过相转移减少产品水解；4)适用于不同规模；5)传质快；6)周期短，便于连续操作；7)毒性与安全环境问题。12、包涵体形成的原因及处理方法？大肠杆菌中目标产物的表达水平过高，超过正常代谢水平，过多表达产物聚集在细胞内，形成不溶性的包涵体。处理方法：胞外分泌型表
12、达：离心（收集液相）浓缩纯化胞内表达：胞内可溶性表达：离心（收集菌体）细胞破碎离心（收集上清）纯化不溶性包含体：离心（收集菌体）细胞破碎离心（收集沉淀）包含体洗涤目标蛋白变性溶解复性纯化。13、.什么叫浓差极化现象？处理方法是什么？在分离过程中，料液中溶剂在压力驱动下透过膜，大分子溶质被带到膜表面，但不能透过，被截留在膜的高压侧表面上，造成膜面浓度升高。于是在膜表面与临近膜面区域浓度越来越高，产生膜面到主体溶液之间的浓度梯度，形成边界层，使流体阻力与局部渗透压增加，从而导致溶液透过流量下降，同时这种浓度差导致溶质自膜反扩散到主体溶液中，这种膜面浓度高于主体浓度的现象称为浓差极化。处理方法：提高
13、渗透压，降低水通量：产生结垢现象，造成物理阻塞，使膜丧失透水能力。通过搅拌等方法可以减弱或消除浓差极化。14、化学渗透法细胞破碎的优缺点？优点：1）对产物释放有一定的选择性，可使一些较小分子量的溶质如多肽和小分子的酶蛋白透过，而核酸等大分子量的物质仍滞留在胞内；2）细胞外形完整，碎片少，浆液粘度低，易于固液分离和进一步提取。缺点：1）通用性差； 2）时间长，效率低，一般胞内物质释放率不超过 50%； 3）有些化学试剂有毒； 4）化学试剂的加入常会给随后产物的纯化带来困难，并影响最终产物纯度。15、选择分离纯化方法的依据1. 产物的位置（胞内/胞外）2. 产物与主要杂质的浓度3. 产物和主要杂质
14、的物理、化学特性及差异4. 产品的用途和质量标准5. 产品的市场价格6. 废液的处理方法16、影响盐析的因素？1）蛋白质种类的影响；蛋白质的种类不同，Ks 值会有所不同；分子量越大，沉淀所需盐的量越少；蛋白质分子不对称性越大，越容易沉淀。2）蛋白质浓度的影响；蛋白质浓度大时，分辨率低，但用盐量减少、蛋白质的溶解损失小；蛋白质浓度低时，分辨率高，但用盐量增大、蛋白质的回收率低。3）无机盐的种类；阴离子的影响大于阳离子4）pH 值；在接近蛋白质等电点的溶液中进行盐析有利于蛋白质的沉淀。5）盐析温度。在高离子强度溶液中，升高温度有利于蛋白质的失水，使之溶解度下降；在低离子强度溶液或纯水中，蛋白质的溶
15、解度在一定温度范围内一般随温度升高而增大。17、萃取过程有机溶剂的选择？常用的有机溶剂有哪些？有机溶剂的选择：1）根据相似相溶的原理，选择与目标产物极性相近的有机溶剂为萃取剂，可以得到较大的分配系数；2）有机溶剂与水不互溶，与水有较大的密度差，黏度小，表面张力适中，相分散和相分离容易；3）应当价廉易得，容易回收，毒性低，腐蚀性小，不与目标产物反应。常用于生化萃取的有机溶剂有：丁醇、丁酯、乙酸乙酯、乙酸丁酯、乙酸戊酯等。 18、色谱法分离的原理。利用多组分混合物中各个组分物理化学性质（吸附力、分子极性、分子形状和大小、分子亲和力、分配系数等）的差别，使各组分以不同程度分配在两相中，其中一相为固定
16、相，另一相为流动相（气体或液体） 。当多组分混合物与随流动相流动时，由于各组分物理化学性质的差异，易分配于固定相的物质移动速度慢，易分配于流动相中的物质移动速度快，从而分离。三、论述1、论述生物工程下游技术的一般流程（可画图说明） 。2、高效液相色谱与传统色谱的优势在哪（即特点）？1高压：液相色谱法以液体为流动相（称为载液） ，液体流经色谱柱，受到阻力较大，为了迅速地通过色谱柱，必须对载液施加高压。 2. 高速：流动相在柱内的流速较经典色谱快得多；高效液相色谱法所需的分析时间较之经典液相色谱法少得多。3. 高效：近来研究出许多新型固定相，使分离效率大大提高。 4.高灵敏度：高效液相色谱已广泛采
17、用高灵敏度的检测器，进一步提高了分析的灵敏度。另外，用样量小，一般几个微升。5.适应范围宽：气相色谱法，沸点太高的物质或热稳定性差的物质都难于应用气相色谱法进行分析。而高效液相色谱法，只要求试样能制成溶液，而不需要气化。对于高沸点、热稳定性差、相对分子量大（大于 400 以上）的有机物（这些物质几乎占有机物总数的 75% 80% ）原则上都可应用高效液相色谱法来进行分离、分析。3、液相色谱及气相色谱（HPLC 与 GC）的区别。（1）分析对象的区别GC：适于能气化、热稳定性好、且沸点较低的样品；但对高沸点、挥发性差、热稳定性差、离子型及高聚物的样品，尤其对大多数生化样品不可检测，占有机物的 2
18、0%HPLC：适于溶解后能制成溶液的样品（包括有机介质溶液） ，不受样品挥发性和热稳定性的限制，对分子量大、难气化、热稳定性差的生化样品及高分子和离子型样品均可检测。用途广泛，占有机物的 80%（2）流动相差别的区别GC：流动相为惰性，气体组分与流动相无亲合作用力，只与固定相有相互作用。HPLC：流动相为液体，流动相与组分间有亲合作用力，能提高柱的选择性、改善分离度，对分离起正向作用。且流动相种类较多，选择余地广，改变流动相极性和 pH 值也对分离起到调控作用，当选用不同比例的两种或两种以上液体作为流动相也可以增大分离选择性。（3）操作条件差别GC：加温操作HPLC：室温；高压（液体粘度大，峰展宽小）5、萃取红霉素实验
