1、1草莓叶片愈伤组织的诱导摘要：采用丹东大果草莓品种叶片作为离体培养的对象，用不同的激素配比，以探讨最合适草莓叶片愈伤组织形成的激素配比和浓度。同时还研究了叶片的放置方式和暗培养对形成愈伤组织的影响。实验结果表明，高浓度的 6-BA 有利于愈伤组织的形成,而 IBA 的诱导效果要比NAA 好。另外叶片背面接触培养基要比正面接触培养基所形成的愈伤组织多，通过暗培养也可以促进愈伤组织的形成。 关键词：草莓；叶片；愈伤组织 Abstract: the Dandong a strawberry cultivars as isolated culture of the object, with diffe
2、rent hormone combinations, in order to explore the most appropriate strawberry leaf callus formation and concentration of hormones. At the same time also was studied in leaves of placement and dark culture on callus formation effect. The experimental results show that, the high concentration of 6-BA
3、 in favor of callus formation, and IBA induction effect is better than NAA. In addition the blade back surface contact with the medium than the positive contact with the medium of the callus formation, through the dark culture can promote callus formation. Key words: strawberry leaf; callus; 2中图分类号：
4、V232.4 文献标识码：A 文章编号：2095-2104（2012） 1 材料和方法 11 植物材料 试验品种为丹东大果组培苗，由新疆农业大学园艺学院植物组织培养实验室提供。 1.2 培养基 采用 MS 培养基，蔗糖浓度设为 30g/L，琼脂调节到 7g/L，PH 调至5.8。加入不同组合的植物生长激素后，在 121高温下灭菌 20 分钟。最后分装至每个锥形瓶中，每瓶 20ml，经封口制成用于接种叶盘的培养基。1.3 处理方式 将上述叶盘以不同方式接种于 MS +蔗糖 30g/L+琼脂 7g/L，PH 调至 5.8的基本培养基。接种后，经过一个星期的暗培养，再转入室温为 222,光照周期为
5、18/6 小时的培养室中进行培养。每两星期更换一次培养基。 研究不同激素组合以及叶盘的放置方式和暗处理对愈伤组织形成的影响。 2 结果与分析 2.1 植物生长调节剂与愈伤组织的形成 接种一星期后，叶盘边缘开始卷曲。10 天后在叶片的边缘处形成肉眼可见的愈伤组织，愈伤组织大部分呈淡绿色，极少数白色，结构致密。30 天后，统计所有组合的出愈率，其结果见表 1。其中以 6-BA 31.0mg/L+IBA 0.1mg/L 的出愈率最高，为 93.3%，而 6-BA 1.0mg/L+NAA 0.1 mg/L 的出愈率最低，只有 43.3%。由此可以得出丹东大果草莓叶片的最适培养基为 MS+ 6-BA 1
6、.0 mg/L +IBA 0.1 mg/L。 第 5 至第 8 组的 BA 浓度比相应的第 1 至第 4 组的 6-BA 浓度高一倍，出愈率相应提高了 13.2%26.7%不等（表 1） 。这表明提高 6-BA 的浓度更有利于愈伤组织的形成。在 NAA，IBA 和 2,4-D 对愈伤的形成的影响方面，从第 1，2，7，8 四组中也可以发现 6-BA 的浓度都为 1.0，使用 IBA比使用 NAA 的所形成的愈伤组织比较多；另外对没有加入 2，4-D 的第 6组和加入了 2，4-D 的第 9 和第 10 组比较，不难看出，加入 2，4-D 后的出愈率有很大的提高。但是 2，4-D 的浓度似乎对形
7、成愈伤组织的影响并不十分明显。 表 1 植物生长调节剂及其组合对草莓叶盘愈伤形成的影响（单位：mg/L） 2.2 叶盘的放置方式对愈伤形成的影响 外植体与培养基的接触方式对叶片愈伤组织的形成也相当大的影响，由表 2 可知， 丹东大果草莓叶盘正面接触培养基和背面接触培养基对愈伤组织的形成有很大的差别。相同的培养基和激素水平上，背面接触培养基要比正面接触培养基所形成的愈伤组织多得多。一般认为，造成这种差异的原因是叶背面气孔较多，组织疏松，角质层不发达，有利于营养的吸收4-7。王文和8等人对草莓叶片愈伤组织形成及再生芽的4分化的组织学研究中发现愈伤组织由维管束周围的薄壁细胞脱分化形成分生结节，再由分
8、生结节进一步分化成维管组织结节。叶片维管束都在表皮栅栏组织之下，维管束上面是结构紧密的上表皮，而叶片下表皮通常结构比较松散。这样就能很好的解释为什么下表皮接触培养基能使叶盘更好的吸收营养进而有利于愈伤组织的形成。 表 2 叶盘放置方式对草莓愈伤组织形成的影响 2.3 暗培养对愈伤组织形成的影响 不同的培养条件对叶片外植体愈伤组织的形成也有所影响。暗培养在许多植物(如：梨，苹果)的离体叶片培养中都可以促进愈伤组织的高效再生9。在表 3 中所采用的有无暗培养的对比中现，暗培养对愈伤组织的形成有一定的促进作用。在没有暗培养的情况下愈伤组织的形成率基本上在 60%左右，而通过一段时间的暗培养愈伤组织的
9、形成率几乎都提高到 90%以上。George(1993)认为暗处理可减少外植体酚类物质的溢出 ，酚类物质受到多酚氧化酶的氧化作用会生成褐色的醌类物质，即我们常见的褐化现象。暗培养可以降低褐化现象的发生，相应的能提高愈伤组织的形成。 表 3 暗培养对草莓叶盘愈伤组织形成的影响 3 讨论 53.1 褐化 在本实验中外植体褐化现象比较多。褐化是由于植物体内多酚氧化酶被激活,使酚类物质氧化造成的,酚类物质被氧化后产生棕褐色的醌类物质,它们会逐渐扩散到培养基中,抑制其它酶的活性,毒害整个外植体组织10。在植物组织培养中,过高的无机盐、蔗糖浓度均会引起外植体的褐变;激素使用不当时,材料也容易褐变;另外,培
10、养条件不适宜,如温度过高或光照过强,均可使多酚氧化酶的活性提高,从而加速被培养的组织发生褐化11。在董晓颖12等人的研究中指出，如果在培养基中加入 6-BA，则外植体基本上无褐化现象。而在本实验中，每一组合都有 6-BA 的加入。所以出现褐化的原因主要是可能是由于培养条件不稳定，温度和光照控制不严格所导致。由于培养室没有专业的控温设备，室内温度基本与外界温度相同。而在乌鲁木齐，一天中温差比较大，一般情况下清晨与中午温差可达 15。培养室的光源由日光灯提供，但本人在实验期间日光灯管有许多不能亮而且光照时间也不稳定。另外也可能与所采取的培养基种类、蔗糖浓度、激素浓度等因素有很大的关系。具体原因有待
11、进一步研究。 预防外植体褐化主要可采取如下措施来防止:暗培养；选择最佳的培养基；在培养基中加入抗氧化剂或吸附剂；增加培养基的琼脂浓度；在转材料的过程中尽量缩短操作时间以减少外植体在空气中的暴露时间；多次连续转移培养。这些措施都对防止褐化产生了不同的效果,其中暗培养是较好的一种方法11。 3.2 其它激素的运用 6已有大量文献报道4,13,14，TDZ 的再生效果比 6-BA 要理想，并且TDZ 的有效浓度比 6-BA 低。这可能是由于 TDZ 具有高的细胞分裂素活性所致。目前对 TDZ 的作用机理了解的较少，初步认为 TDZ 可诱导细胞分裂素的生物合成，并抑制内源生长素的降低。由于实验室没有相
12、关的激素，所以于 TDZ 对草莓叶片离体培养所具的优点可以在以后的实验中尝试。 4 小结 在丹东大果叶片愈伤的诱导过程中，最适培养基为 MS+6-BA 1.0 mg/L +IBA 0.1 mg/L。 叶片正面朝上放置比叶片正朝下放置更有利于愈伤组织的形成。 暗培养可以大幅度提高叶片愈伤组织的诱导率。 参考文献： 1 梁贵秋,唐燕梅. 草莓的组织培养和快速繁殖J. 广西热带农业，2004(6):89. 2 艾勇，赵佐敏,唐红.草莓组织培养及产业化应用初步研究J种子，2002(5)：5658 3 洪艳萍，林顺权. 草莓离体培养研究进展J.福建农业学报，1999,14(2):3744. 4 于冬梅，
13、胡文玉，王关林基因型和培养因子对诱导草莓叶片再生芽的影响J沈阳农业大学学报，1998，29(2)：138143 5 邓馨,胡文玉.草莓叶片再生芽及遗传转化系统的建立J.植物学通报， 2000,17(2):174178. 76 PasseyAJ,BarrettKJ,JamesDJ.Adventitious shoot regeneration from seven commer- cial strawberry cultivars (Fragaria Xananassa Duch.) using a range of explant typesJ.Plant Cell Reports，2002,
14、21:5,397401. 7 宋国庆,肖兴国,李绍华等.草莓叶片和叶柄再生体系的建立J.落叶果树，2000,(2):58. 8 王文和，邓馨，胡文玉，吴禄平.草莓叶片愈伤组织形成及再生芽分化的组织学研究J.沈阳农业大学学报，1998，30(4):430433. 9 吴雪梅，汤浩茹.草莓叶片培养研究进展J.北方园艺，2004(6):810. 10 王关林,方宏筠.植物基因工程原理与技术M.北京:科学出版社，1998.190. 11 闫华晓,赵辉,崔德才.影响草莓叶片植株再生因素的研究J. 山东农业大学学报(自然科学版)，2003,34(2):177180. 12 董晓颖,李培环,王 然,刘成连,王永章,孙妮妮. 哈尼草莓叶片诱导再生植株及快繁J.莱阳农学院学报，2004,21(3)：234237. 13 张志宏,吴禄平,代红艳,等.草莓主栽品种再生和转化的研究J.园艺学报，2001, 28 (3):189193. 14 吴雪梅,汤浩茹,文国琴,李 燕. 不同培养条件对丰香草莓离体叶片再生的影响J.园艺学报，2004,31(5):657659.
