1、标本溶血对 ELISA 法检测 25OH 维生素 D3 的影响摘要：目的 分析标本溶血对 ELISA法检测 25-OH维生素 D3的影响，以评估溶血标本血浆 25-OH维生素 D3结果的准确性。方法 将正常标本分为两份，利用物理震荡法制备一份溶血标本，用 ELISA竞争法分别检测溶血标本和正常标本血浆 25-OH维生素 D3水平，比较两组结果的差异；并检测溶血标本游离血红蛋白，分析游离血红蛋白与 25-OH维生素 D3偏倚的相关性。结果 溶血标本血浆 25-OH维生素 D3结果显著降低，其血浆游离血红蛋白与 25-OH维生素 D3偏倚呈正相关。结论 标本溶血影响25-OH维生素 D3的检测，检
2、测结果差异与溶血程度呈正相关，临床工作中碰到溶血标本应通知重抽标本检测。 关键词：溶血；ELISA；25 羟维生素 D 维生素 D（Vitamin D，VD）是胆固醇在紫外线作用下转换生成的一种人体必需的脂溶性维生素，在调节机体钙、磷代谢方面发挥着非常重要的作用。近年来，维生素 D又被发现与细胞增殖与分化以及免疫功能有着密切的联系。25 羟维生素 D3（25-OH Vitamin D3，25-OHD3）是维生素 D在人体内的主要循环活性形式。临床上常常检测血液中 25-OHD3水平，用于评估维生素 D的营养状况、诊断儿童 VD缺乏以及调整口服维生素 D的用量等。目前检测 25-OHD3主要方法
3、有色谱法、化学发光法和酶联免疫吸附试验（ELISA） ，其中 ELISA检测 25-OHD3由于操作简单、标本用量少、成本低廉以及实用范围广而成为临床上检测 25-OHD3最常用的方法。本文主要探讨标本溶血对 ELISA法检测 25-OHD3水平的影响，以评价溶血标本 25-OHD3结果的可靠性。 1 资料与方法 1.1 一般资料 本院 2015年 7月10 月儿童保健科、儿科门诊及住院检测 25-OHD3的儿童 42例，年龄为 2岁6 岁，男童 15例，女童 27例，剔除脂血和黄疸标本。 1.2 试剂与仪器 25-OHD3检测 ELISA试剂盒为广州菲康生物技术有限公司生产，批号为：B153
4、07；游离血红蛋白检测试剂盒购自北京瑞尔达生物科技有限公司；洗板机和酶标仪均由雷杜公司提供；真空采血管和抗凝剂有湖北金杏科技发展有限公司提供。 1.3 标本采集与处理 真空采血法采集研究对象肘静脉血，EDTA-K2抗凝，摇匀，分成两管，一管用于制备溶血标本，然后以 4 000 r/min离心 5 min分离血浆，不能及时检测的血浆标本置于-20冷藏，避免反复冻融。 1.4 方法 1.4.1 溶血标本的制作 将分出的一管 EDTA-K2抗凝血，利用物理震荡方法制备溶血标本。 1.4.2 将正常标本和制作的溶血标本离心，取血浆用于检测。 1.4.3 按照试剂盒说明书的操作步骤检测溶血标本血浆游离血
5、红蛋白。1.4.4 按照 ELISA试剂盒操作步骤同时检测正常标本和溶血标本血浆25-OHD3，每个样本均做平行孔，取均值。高值和低值质控均在控。 1.5 统计学方法 用 SPSS 17.0软件进行统计分析，计量资料用 xs表示，两配对样本之间的比较采用配对 t检验；两组数据之间的相关性采用 Pearson直线相关分析。 2 结果 2.1 正常标本与溶血标本血浆 25-OHD 3水平的差异 溶血标本血浆25-OHD3水平（57.622.3）nmol/L 明显低于正常标本（65.419.1）nmol/L，差异具有有统计学意义（t=23.134，P0.01） 。 2.2 血浆游离血红蛋白与 25-
6、OHD 3偏倚的相关性 偏倚 Bias=（正常标本血浆 25-OHD 3-溶血标本血浆 25-OHD 3）/正常标本血浆 25-OHD3100%。将溶血标本血浆游离血红蛋白与偏倚进行相关分析，结果表明，二者之间呈显著正相关（r=0.6692，P0.01） ，二者相关散点图见图 1。 图 1 游离血红蛋白与 25-OHD3偏倚的相关性 3 讨论 维生素 D在体内经肝脏和肾脏代谢后生成 1，25-二羟维生素 D，后者是维生素 D在体内的活性形式，是该磷代谢的的主要调节因子之一，促进钙的吸收是其主要功能之一。研究表明，维生素 D在缺钙、佝偻病发生之前数月就已经开始缺乏，因此，定期测定体 25-OHD
7、3是预防佝偻病发生的重要措施。Belderbos ME等研究表明1，低脐带血 25-OHD3的婴儿在 1年之内更加容易发生病毒性的呼吸道感染。曲辉等也发现2，体内维生素 D不足的儿童更加容易发生反复的呼吸道感染。不难推测，定期测定婴儿与儿童血浆中 25-OHD3，及时补充及处理，对提高儿童免疫功能及预防呼吸道感染也有着重要的临床意义。目前，测定 25-OHD3的方法主要有色谱法和免疫学方法。临床上用的较多的是 ELISA测定 25-OHD3。ELISA 是结合抗原抗体反应的特异性和酶催化的敏感性建立起来的便捷、经济的免疫学方法，操作简便，实用范围广，但是影响因素较多。不少学者已报道3-5，溶血
8、可干扰 ELISA检测乙肝表面抗原和艾滋抗体的检测，造成假阳性的结果。本研究中，溶血标本血浆 25-OHD3明显低于正常标本，而且在一定的溶血程度范围内，检测受干扰的程度与标本中游离血红蛋白呈正相关，说明溶血越厉害，25-OHD3 检测值越低。这可用游离血红蛋白吸附于反应孔来解释：本研究检测 25-OHD3采用的是竞争法，颜色越深，25-OHD3 值越低，因此，当游离血红蛋白吸附于反应孔时，催化 TMB产生颜色反应，导致颜色加深，结果是导致检测结果降低。因此，我们在临床检测 25-OHD3的工作中，如碰到溶血标本，应该通知临床重抽标本，对于没法重抽的“让步检验“标本，应与临床进行沟通，告知溶血
9、对结果的影响，以免对临床诊断和治疗效果产生不良的影响。 参考文献： 1Belderbos ME，Houben ML，Wilbrink B，et al.Cord blood vitamin D deficiency is associated with respiratory syncytial virus bronchiolitisJ.Pediatrics，2011，127（6）：e1513-e1520. 2曲辉，康凯，付姝丽，等.血清维生素 D水平与儿童反复呼吸道感染的关系J.实用儿科临床杂志，2012，2（22）：1738-1739. 3何星，黄小明.溶血标本在 ELISA二步法中对 HBsAg测定结果的影响J.中国输血杂志，2013，26（9）：900-902. 4薛俊太，邓翠华，王惟，等.溶血标本在 ELISA一步法和二步法中对 HBVM测定结果的影响J.检验医学与临床，2009，6（14）：1126-1127. 5岳展伊.溶血对 ELISA检测 HIV抗体影响的临床分析J.中外医疗，2010，2：34.编辑/丁一
