1、大豆异黄酮的高效液相色谱法研究摘 要本文建立了同时测定四种大豆异黄酮（大豆苷、大豆苷元、染料木素和染料木苷）含量的高效液相色谱法方法。采用日本岛津LC10AT 高效液相色谱仪测定：色谱柱为安捷伦 Eclipse XDB-C18（250mm4.6mm 5m） ，采用甲醇?s 乙腈?s 磷酸水（pH=3.0）=30?s10?s60 洗脱，流速为：1.0mL/min，波长：260nm，进样量：10L，柱温：30。四种大豆异黄酮在 20400g/mL 线性关系良好。加标回收率分别达到 90%以上，方法简便、灵敏、准确，适用于大豆异黄酮成分的含量测定。 关键词高效液相色谱法； 大豆异黄酮；含量测定 中图
2、分类号：R284 文献标识码：A 文章编号：1009-914X（2015）06-0197-02 曾经 1999 年 10 月 FDA 发布了第 11 个健康声明：每人每天食用 25g黄豆，可以减少发生冠心病的风险。而近年来一些研究表明，大豆及豆制品具有更加广泛的生物功效，如抗肿瘤、防治骨质疏松和增强记忆等，这些功能均与大豆异黄酮有关。大豆异黄酮与防治一些和雌激素水平下降有关的疾病，延缓女性衰老、改善更年期症状、骨质疏松、血脂升高、乳腺癌、前列腺癌、心脏病、疏松症、心血管疾病等。 大豆异黄酮是大豆生长中形成的一类次生代谢产物，是生物黄酮中的一种，也是一种植物雌激素。它主要分布于大豆种子的子叶和胚
3、轴中，种皮中含量极少。80%90%的异黄酮存在于子叶中，浓度为0.1%0.3%。胚轴中所含异黄酮种类较多且浓度较高，为 1%2%，但由于胚只占种子总重量的 2%，因此尽管浓度很高，所占比例却很少（10%20%）1-3。迄今为止，共发现有 12 种成分，分为游离型的苷元和结合型的糖苷两类。苷元占总含量的 2%3%，包括软料木黄酮、黄豆苷元和黄豆黄素 3 种4。糖苷 9 种，以葡萄糖苷、乙酰基葡萄糖苷、丙二酰基葡萄糖苷 3 种形式存在，其中染料木苷、黄豆苷、丙二酰金雀异黄苷、丙二酰大豆苷 4 种成分约占总量的 83%93%5。 目前国内外测定大豆异黄酮的方法主要有比色法、纸色谱法、薄层色谱法、气相
4、色谱法（GC） 、紫外分光光度法和高效液相色谱法（HPLC）等。但紫外分光光度法常以染料木苷标准品来表征大豆异黄酮总浓度，该方法虽然简便易行、成本低廉但仅适用于粗略测定异黄酮总量，结果有一定偏差6。薄层色谱法具有取样量少，操作简单、分离效果好等优点，但其薄层显色剂用量难于准确控制，人为误差大。康纯7等以 6 种 SDS、正丁醇、正庚烷、水微乳液作展开剂，通过聚酰胺薄层色谱法分离和检测 13 种黄连药材、饮片及中成药，并且观察了微乳液类型副 I 分辨率的影响，结果表明，含水量 75%的微乳液为适宜的展开剂。GC 法采用了样品衍生后进行测定，存在操作烦琐，条件不易控制、杂质干扰严重等问题；高效液相
5、色谱法则具有样品不需要预处理、测定快速、定量准确的优势。本研究采用高效液相色谱法（HPLC） ，甲醇?s 乙腈?s磷酸水（pH=3.0）=30?s10?s60 作为流动相，同时对大豆异黄酮 4 种主要成分大豆苷、染料木苷、大豆苷元和染料木素进行分离定。 1 实验部分 1.1 仪器和试剂 岛津 LC10AT 高效液相色谱仪：附带 SPD-10A 紫外检测器，色谱柱为安捷伦 Eclipse XDB-C18（250mm4.6mm 5m） ，0.45？m 微孔滤膜过滤器，JP-030S 型超声波清洗器，TU-1810 紫外-可见分光光度计，BSA224S-CW 分析天平。大豆苷、染料木苷、大豆苷元和染
6、料木素的含量均98%，且均购置于曼思特生物科技有限公司。乙腈色谱纯，甲醇色谱纯。样品大豆异黄酮软胶囊购置于深圳医药公司。 1.2 标准溶液制备 1.2.1 大豆异黄酮标准贮备溶液：称取大豆苷、大豆苷元、染料木苷和染料木素各 1mg，置于 25mL 容量瓶中，加入适量甲醇，经超声处理10min，再用甲醇定容至刻度，制成 400g/mL 标准溶液。 1.2.2 大豆异黄酮混合标准使用溶液：吸取 1.2.1 中标准贮备液，配成 200g/mL，100g/mL，50g/mL，20g/mL 的混合标液，使用甲醇定容。 1.3 供试液制备 胶囊去壳，将内容物混合均匀，称取样品 0.05g-0.5g（精确至
7、0.1mg） ，加入适量 80%乙醇。超声提取 30min，加水定容，离心分离 5-10min，取上清液经 0.45m 微孔滤膜过滤后，收集滤液待测。 2 结果与分析 2.1 色谱条件确定 2.1.1 检测波长选择 通过紫外扫描，可知四种大豆异黄酮在 260nm 处均有较大吸收，故选取检测波长 260nm。 2.1.2 流动相的选择 分别采用甲醇-水，甲醇-磷酸水（pH3.0） ，甲醇-乙腈-磷酸水（pH3.0）作为流动相。甲醇-水作流动相时发现染料木素峰有严重的拖尾现象，且大豆苷和大豆苷元无法完全分开。当流动相 pH3.0 时，大豆苷和大豆苷元能很好的分开，但是染料木苷有前出峰现象，当流动相
8、中加入一定比例的乙腈时，这种现象能够很好的改善。因此流动相选择甲醇?s 乙腈?s 磷酸水=30?s10?s60。 2.1.3 色谱条件确定 根据上述实验，确定本实验的色谱条件为：流动相为甲醇?s 乙腈?s磷酸水（pH3.0）=30?s10?s60，流速为：1.0mL/min，波长：260nm，进样量：10L，柱温：30。 2.2 检测方法的验证 2.2.1 线性关系考察 分别精密吸取一系列浓度范围的对照品混合溶液，进样量 10L。按照 2.1.3 条件注入液相色谱仪，测定峰面积。以峰面积为纵坐标，浓度为横坐标，进行线性回归。回归方程及线性范围见表 1。 大豆苷、大豆苷元、染料木苷和染料木素的理
9、论塔板数分别为 2412、2402、6803和 7115，其理论塔板数显示各成分的分离程度，能够满足检测的需要。在进样量为 10？L 时，四种大豆异黄酮最低检测浓度均为：2.5g/mL。 2.2.2 稳定性试验 精密吸取供试品溶液 10？L，每隔 8h，按照 2.1.3 项色谱条件进样一次，共测 6 次，测定峰面积，结果大豆苷、大豆苷元、染料木苷和染料木素的 RSD 分别为 1.56%、2.03%、1.05%和 2.37%。表明 48h 内测定结果稳定性良好。 2.2.3 重复性试验 取同一样品，按照 1.3 制备供试液，按照 2.1.3 项色谱条件，分别测定四种大豆异黄酮日内含量重复性和日间
10、重复性，结果分别见表 2 和表 3。样品在一天时间内重复测定 6 次完成其日内重复性。每隔 2 天测定一次，共测定 3 次完成日间重复性。表 2 和表 3 的结果显明本方法精密度好，准确度高，且操作简便，适合推广应用。 2.2.4 回收率试验 称取已知含量的同一样品共 9 份，每 3 份为 1 组，按高、中、低 3个水平分别加入对照品溶液，按照 1.3 制备供试液，按照 2.1.3 的色谱条件进样，进行回收率试验。回收率见表 2。 3 结论 本方法讨论了用不比例的醇-水，甲醇-磷酸水（pH3.0） ，甲醇-乙腈-磷酸水（pH3.0）作流动相，结果显示甲醇?s 乙腈?s 磷酸水=30?s10?s
11、60 作流动相时，四种大豆异黄酮能很好的分开。对方法的重复性考察，在 6 天时间内方法是稳定的，重复性好，精密度高。分别对四种大豆异黄酮的回收率加以考察，回收率均在 90%以上，表明方法可操作性高。 本方法用高效液相色谱法同时测定 4 种大豆异黄酮苷元的含量，结果准确、可靠，为大豆异黄酮的定量测定提供了一定的支持。 参考文献 1 Wang HJ， Murphy PA. Isoflavones composition of American and Japanese soybeans in Lowa： effects of variety. Crop year， and location. J
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