1、一株海南野生灵芝的 rDNAITS 鉴定与系统发育分析摘 要：灵芝是一类重要的木腐真菌，在我国海南岛有广泛分布。研究扩增了 1 株分离自海南五指山的灵芝菌株 rDNA-ITS 序列，构建系统发育树，并比较了其与部分亲缘关系较近灵芝的 rDNA-ITS 序列差异。结果表明，分离自海南五指山的菌株 Wzs1 与 G.resinaceum 类群亲缘关系较近，支持聚类的自展值为 26%，表明灵芝 Wzs1 与 G.resinaceum 类群较相近。 关键词：海南；灵芝；rDNA-ITS；系统发育 中图分类号 Q933 文献标识码 A 文章编号 1007-7731（2016）02-14-03 灵芝（Ga
2、noderma spp.）是一种重要的腐生型真菌，隶属于真菌界（Kingdom Fungi） ，担子菌门（Basidiomycota） ，担子菌纲（Basidiomycetes） ，灵芝目（Ganodermatales） ，灵芝科（Ganodermataceae）1。野生灵芝的形态特征常常由于受到外部环境的影响产生很大的差异，有伞形、马蹄形等，菌盖有圆形、半圆形或肾形等，菌盖表面一般有光泽或环形纹理。海南岛的热带和亚热带雨林气候为野生灵芝生长发育提供了适宜的温度和湿度，丰富的原始森林为灵芝生长提供充足的营养成分。至今已发现野生灵芝科有 103 个种，分为4 个属，3 个亚属，其中海南有 72
3、个种，约占总数的 70%，表明海南岛是我国野生灵芝分布最丰富的地区之一2。本研究利用 rDNA-ITS 引物，扩增 1 株灵芝菌株的序列，并构建系统发育树，研究菌株的分类学地位及亲缘关系，以便今后进一步的资源探索和菌株进化研究提供参考借鉴。1 材料与方法 1.1 供试菌株分离、培养及 DNA 的提取 供试菌株 Wzs1 为灵芝子实体经酒精-次氯酸钠-酒精常规表面消毒后，置放于 PDA 培养基表面，于25恒温培养至长出菌落，纯化后 4冷藏保存。菌种斜面上挑取菌丝接种至 30mLGY 液体培养基中，25摇床培养 14d，收集菌丝用于 DNA 提取3。 1.2 PCR 扩增及产物的克隆和测序 扩增片
4、段为 ITS1、5.8S 和 ITS2区域，引物为 ITS1 （5-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3 ）和 ITS4 （5-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3） 3。目的片段的扩增及克隆参照 Chen 等方法4，将含有目的基因片段的菌液委托北京华大基因科技股份有限公司测序。 1.3 系统发育学分析及 DNA 序列差异性比较 根据菌株的 rDNA-ITS测序结果，在 GenBank 数据库中进行 Blast 比对，搜索同源序列。选取不同种的代表性菌株作进一步的分析。采用 Clustalx 1.835将序列对齐，利用 MEGA 5.06软件进行系统发育分析，并以自展法（boot
5、strap）进行检测，循环 1 000 次，采用邻接法构建系统发育树，其中虎皮香菇（Lentinula tigrinus）作为外群。利用 Clustalx 1.835软件将实验菌株序列及部分亲缘关系较近的代表性菌株序列进行比对，找出不同序列间的碱基差异。 2 结果与分析 2.1 分离菌株的形态特征 在 PDA 培养基上 25培养，从表面消毒的子实体边缘生长出白色菌落，具有典型的腐生真菌形态特征。菌落正面白色，棉质，质地紧密，中央隆起或稍有皱褶，边缘疏松，背面泛黄色或淡褐色。 2.2 DNA 序列组成分析 灵芝菌株 Wzs1 进行了 rDNA-ITS 的扩增和测序。扩增产物包括 ITS1-5.8
6、S-ITS2 区段以及部分 18S、25S 区段，其中菌株 Wzs1 扩增长度为 674bp，ITS1、5.8S、ITS2 序列长度分别为206bp、158bp、215bp，同时将测得的序列提交到 GenBank（HQ689698） 。 2.3 系统发育分析 利用 MEGA5.0 软件进行系统发育分析，构建 NJ树 branch length=0.391。系统发育树结构显示：灵芝菌株 Wzs1 与G.resinaceum 类群聚为一支，自展值为 26%；这一支包含了G.resinaceum、G.tenue、G.subamboinens 和 G.weberianum 共 4 个种（图 1） 。此
7、外，rDNA-ITS 系统发育树显示灵芝不同种间亲缘关系的远近，同时 G.japonicum 与 G.sinense 这 2 个种的 4 株菌株聚为一支，与此相似的还有 G.australe 与 G.adspersum，G.applanatum 与G.lipsiense，G.pseudoferreum 与 G.philippii 6 个种，其它各个种菌株各自聚为一支，这些结果反映了 rDNA-ITS 能够较好地对不同种菌株进行区分（图 1） 。 2.4 DNA 序列差异分析 将属于 G.resinaceum 类群的 9 个菌株进行rDNA-ITS 序列差异性比较，以序列的一端作为起始点，菌株
8、Wzs1 与其它8 个菌株的差异主要分布在 3 个不同区域，分别位于90140bp，160200bp，420460bp，这反映了菌株 Wzs1 与其它G.resinaceum 类群菌株产生差异可能由这 3 个差异显著的片段决定（图2） 。 3 讨论与结论 随着分子生物学技术的发展，灵芝真菌的形态分类容易受到外界环境的影响被越来越多的研究证明，形态数据难以准确区分不同种的菌株3。采用 rDNA-ITS 序列研究发现，中国栽培灵芝菌株中树舌亚属、紫芝组的菌株各自聚成一组，赤芝组的菌株分成 3 组，85.7%赤芝组菌株均聚于同一组，且树舌亚属、紫芝组和赤芝组间的遗传差异较大，赤芝组内存在一定的遗传差
9、异，但多样性并不丰富7-8。菌株 Wzs1 与G.resinaceum 类群聚为一支，说明这些灵芝遗传关系较为紧密。此外，Wzs1 灵芝子实体也具有类似 G.resinaceum 类群 4 种灵芝的形态特征。因此，系统发育分析结果表明，菌株 Wzs1 可能与 G.resinaceum 类群较相近，但与 G.resinaceum 这个种有较明显的区别，并且序列差异比较分析也表明 Wzs1 与 G.resinaceum 类群其它菌株存在 3 个不同区域的差异，这也反映了菌株 Wzs1 仅与这一类群相近但有别于 G.resinaceum 的菌株。这些结果为进一步研究海南产灵芝菌株的系统发育学信息提供
10、了参考借鉴。 参考文献 1Chang S T，Miles P G.Mushrooms cultivation，nutritional value，medicinal effect，and environmental impactM.CRC Press，2004：357-372. 2吴兴亮，戴玉成.中国灵芝图鉴M.北京：科学出版社，2005：1-14. 3陈永敢，陈光宙，袁学军，等.中国产 Ganoderma lucidum 的系统发育学分析及栽培技术研究J.北方园艺，2014，08（1）：92-95，96. 4Chen Y G，Ji Y L，Yu H S，et al.A new Neotyph
11、odium species from Festuca parvigluma Steud.grown in China J.Mycologia，2009，101（5）：681-685. 5Thompson J D，Higgins D G，Gibson T J.Clustal W：improving the sensitivity of progressive multiple sequence alignment through sequence weighting，position-specific gap penalties and weight matrix choice J.Nuclei
12、c Acids Res，1994，22：4673-4680. 6Tamura K，Peterson D，Peterson N，et al.MEGA5：molecular evolutionary genetics analysis using maximum likelihood，evolutionary distance，and maximum parsimony methodsJ.Mol Biol Evol，2011，28：2731-2739. 7苏春丽，唐传红，张劲松，等.基于 rDNA-ITS 序列探讨中国栽培灵芝菌株的亲缘关系J.微生物学报，2007，47（1）：11-16. 8Zheng L Y，Jia D H，Fei X F，et al.An assessment of the genetic diversity within Ganoderma strains with AFLP and ITS PCR-RFLP J.Mycol Res.，2009，164：312-321. （责编：张宏民）
