1、EB 病毒与鼻咽癌的研究进展1 关于 EB 病毒EB 病毒是人类疱疹病毒家族成员之一，系 DNA 病毒，南 173kb 组成。1964 年由 Epstein 和 Barr 在研究非洲儿童恶性淋巴瘤时发现的一平叶 t 亲人类 B 淋巴细胞的疱疹病毒。EB 病毒被罔际癌症研究机构(IARC)归为 I 类致癌物质，与鼻咽癌密切相关。EB 病毒的全世界人感染率超过 90。原发感染通常发生在幼年时期，并且无症状，表现为隐性感染：但如果感染发生在青少年或成年， 【Ij 可能导致感染性单核细胞增多症。原发感染后，病毒可以长期持续性存任，呈潜伏感染状态，在大多数病例中无症状。EB 病毒主要经唾液传播，但也有报
2、道经血液和性活动传播。EB 病毒感染细胞有两种形式：即潜伏性感染和增殖性感染。在潜伏性感染中，病毒以环状游离体和或整合型形式存在。在一定条件下，如免疫功能低下或某些物理、化学冈素的作用(紫外线、丁酸、巴豆油及尿嘧啶等 )，EB 病毒町以从潜伏状态变为增殖状态2EB 病毒的基因表达目前已知的 EB 病毒基表达产物有潜伏膜蛋白(LMPI、LMP2A、LMP2B)和 6 种核抗原(EBNA1、EBNA2EBNA3AEBNA3BEBNA3CEBNALP)，以及一些在各潜伏期均有感染的但功能尚不清楚的微小的非多聚腺苷酸(非编码 )RNAs，EBERsl 和 EBERs2。按 EB 病毒潜伏感染状态，将基
3、冈表达分为3 类，即潜伏 I(LanI)，潜伏(Lan ) 和潜伏(Lan)。EB 病毒所有基闲均表达 LanIli 感染。3EB 病毒的免疫机制鼻咽癌细胞表达的病毒抗原可能是 EB 病毒特异 CTLs 的靶2，在体外，这些细胞显示出有正常抗原处理功能，可被人类主要组织相容性复合体(HLA)l 类限制性抗原及病毒特异 CTLs 有效识别。而且，鼻咽癌表达 CD 并对 Fas 介导的细胞溶解敏感，但这些细胞溶解反应可被 CD 信号抑制 。表型研究表明免疫涮节受体与配体均在鼻咽癌巾表达，这些受体和配体允许上皮肿瘤细胞与肿瘤浸润淋巴细胞相互作用。鼻咽癌肿瘤细胞证明有 CDCD7o 及 CDso CD
4、86 的表达，其相应的受体配体 CD27，CD 和 CD 在基质淋巴细胞11 被检测到。有趣的是，在动物实验中，非免疫肿瘤细胞 CD，CDCD8。的表达，可诱导强的抗肿瘤CTL 反应 。在非角化鼻咽癌巾肿瘤细胞和浸润淋巴之间相互作用的本质仍很难理解。在体内，鼻咽癌细胞可能通过分泌细胞冈子调节局部免疫反应，逃避免疫杀伤。而传染性单核细胞增多症(IM)是由 EB 病毒感染引起的 B 淋巴细胞携带 EBV 基因，并表达相抗原，刺激性杀伤 T 细胞增殖，进而引起全身淋巴结肿大及内脏器官病变的一种自限性疾病。多数为增殖状态但也有部分处于潜伏状态，且以型为主。由于EB 病毒进行增殖感染表达的相关基因及蛋白
5、。使病毒感染细胞易被 CTL 识别。成为 CTL 攻击的主要目标而被杀伤，使其具有自限性。4EB 病毒与鼻咽癌的关系鼻咽癌在世界各地发生率差别悬殊，在西方发达闰家极为少见年发生率0510 万，而东南亚部分地区及我的台湾、香港、广东、广西、湖南等地。则属常见肿瘤(1510 万5010 万) 。世界卫生组织把鼻咽癌分成 3 种类型：I 型为鳞状细胞癌， 为非角化癌型为未分化癌，后两者均可归为未分化癌。非角化癌通常伴有淋巴细胞、组织细胞、嗜酸性细胞和其他反应细胞成分，闳而也被称为淋巴上皮癌或淋巴上皮瘤。典型的鼻咽鳞状细胞癌常伴有结缔组织反应性增生，而不伴有淋巴基质。鼻咽癌组织学类型不同，瘤细胞与问质
6、的比例也不同。在所有鼻咽癌患者中，未分化癌占大多数。鼻咽癌的恶性上皮大多数是多角形细胞，细胞核呈圆形或椭圆形，染色质和核分裂少见。电镜下肿瘤细胞是由鳞状细胞变异而成未分化癌只是鳞癌的一种形态。鼻咽癌高发区和低发区在血清中的 EB 病毒检出率都较高。利用原位杂交技术研究发现，EB 病毒编码 RNA 可以在几乎所有的鼻咽癌肿瘤细胞中表达，但在临近的正常组织中不表达(除少数淋巴细胞外)。在癌前期的鼻咽上皮组织中也叮检测出 EB 病毒 ，这预示 EB 病毒感染在鼻咽癌的早期阶段起一定作用。如检出单体病毒 DNA 意味着肿瘤是被 EB 病毒感染的单个细胞的同源细胞增殖所形成。特殊的 EB 病毒潜伏基因在
7、鼻咽癌及早期异常组织中持续表达。相应的病毒潜伏蛋白(潜伏蛋白1，2)对细胞基因表达和细胞生长有很大影响可导致肿瘤的高侵袭性和恶性生长。非角化鼻咽癌尤其是未分化类型与 EB 病毒的感染有关，鼻咽鳞状细胞癌与 EB 病毒感染的相关性存在争议。分析证实高发区(香港)鼻咽鳞状细胞癌均与 EB 病毒有关，而低发区 (英国)只有近 13 的病例是 EB病毒阳性7。表明鼻咽鳞状细胞癌与 EB 病毒的关系显示出地区差异，这与 Burkitt 淋巴瘤相似。也有研究表明在鼻咽鳞状细胞癌可能与吸烟有关，k 等认为 23 的鳞状细胞癌与吸烟有关(不对非角化鼻咽癌)，这体现了肿瘤发展的异质性5 外周血的 EBVDNA
8、最初人们认为 EB 病毒的 DNA 主要存在于外周单核细胞中，病毒在细胞中复制，因此可以检测到 DNA，事实上正常人群所携带的 EBV 主要存在于外周血 B 淋巴细胞中，是一种潜伏感染。但是之后深入研究发现 NPC 患者血浆存在着游离于细胞外的大量的 EBVDNA，并发现 EBVDNA 随着肿瘤消长而变化，故认为血浆 EBVDNA 是肿瘤 EB 病毒裂解释放到血浆中去的。对于鼻咽癌患者来说 EBV 主要分布于鼻咽上皮中，仅少数分布于外周血白细胞。蒋卫红等 用原位杂交技术对鼻咽癌组织、癌旁组织、正常鼻咽黏膜三者的 EBV 进行定位分析认为鼻咽癌组织中的 EBV 主要存在于癌细胞而不是淋巴细胞这提
9、示血浆中的 EBVDNA 来源于肿瘤细胞，而不是外周血白细胞。至于 EBVDNA 是肿瘤细胞自然繁殖后释放到血浆，还是肿瘤细胞被破坏后释放到血浆的，目前尚不清楚，有待进一步研究。6 血浆 EBVDNA 检出率 1999 年 Lo 等采用 RTPCR 方法，定量分析鼻咽癌患者血浆细胞游离的EBVDNAEB 病毒的 DNA 检出率高达 96，而正常对照组仅为 7，并发现进展期鼻咽癌患者血浆EB 病毒的 DNA 水平比早期癌高 8 倍以上。Wang 等报道在不考虑分化程度的条件下，在所有原发性病例中都检测到 EB 病毒 DNA 的存在，而且在肿瘤组织及外周血中发现有 EBNA1 序列的突变。与此相反
10、，张云等对 150 例初诊的鼻咽癌和 75 名正常人的外周血白细胞 DNA 进行检测，结果 NPC 病人治疗前的EBVDNA 表达水平和检出率与治疗后及正常对照比较均无统计学差异。并且血浆与外周血白细胞两者的 EBVDNA 没有相关性。我院对不同期的鼻咽癌患者、复发及转移者和正常人群进行的 EBVDNA检测也没有发现它们之间的差异。并且与 I 临床的亦无相关性( 尚未发表 )。目前所有发表的研究中不管是患者还是正常人群，他们的血浆 EBVDNA 检出率都存在很大的差异，这可能是 PCR 荧光灵敏性高而操作中容易产生某些误差，造成假阳性或假阴性结果。7EBv_oNA 浓度监测与鼻咽癌的关系祝晓芬
11、等对广东省惠州市初治鼻咽癌患者 100 例、放疗后 106 例及健康对照者 40 例用 PCR 方法检测血浆 EBVDNA，结果初治者 907、放疗后 965、复发者100，而健康者仅 75阳性。持续临床缓解者 10阳性；血浆 EBVDNA 定量检测对初诊鼻咽癌患者的诊断敏感性为 907特异性 92；另有 3 例临床缓解但 EBVDNA 持续升高，在随后的 6 个月随访中，最终出现肿瘤的复发或转移。李宇红等 5研究放疗后复发或转移者的血浆 EBVDNA 检出率为967，持续缓解者为 12，3 例临床持续缓解但血浆 EBVDNA 升高者在随后的 34 个月中证实有肿瘤复发或转移。同时还发现肿瘤分
12、期与 EBVDNA 关系密切。晚期患者的血浆 DNA 水平明显高于早期患者。侯雪等对广州中山市 69 例鼻咽癌患者治疗前后的血浆 EBVDNA 浓度进行比较，发现 EBVDNA 低浓度患者无复发生存率和转移生存率，总生存率均高于高浓度者，治疗后能否降到零与远处转移有关。Chan等 m 研究发现病情减轻的患者浓度下降，甚至到检测不出，复发和转移者则在最初治疗下降后又出新升高，可有效的监视患者对放疗及化疗的反应。Lin 等检测 99 例患者发现放疗结束后 1 周监测血浆 EBVDNA 为预测复发的最佳时间。治疗后复发患者其治疗前的 EBVDNA 水平显著高于无复发者。并且放疗后能否检测到 EBV-
13、DNA 为最重要的预后因子。8 体内 EB、 ，_LMP1 与鼻咽癌的关系 EB 病毒与鼻咽癌细胞表型鼻咽癌为 LanII 型 EB 病毒潜伏感染；病毒以单克隆游离基因存在癌细胞中，故可在绝大多数肿瘤细胞中检测到病毒，在鼻咽原位癌中也检测到单克隆病毒基因组。因而推测 EB 病毒感染在恶性细胞克隆扩展之前就已经发生，病毒在适当的时间点参与非角化鼻咽癌的发生发展。在所有的病例中均可检测到 LMP1 的表达；而 Westernblot 或免疫组化方法，在蛋白表达水平进行分析，LMP1 阳性仅表达在部分病例。就 LMPI 转化能力来看，支持 EB 病毒参与鼻咽癌的发生发展的观点。就其功能而言，LMP1
14、 和 CD40 相似，但又存在差异， CD 柏是肿瘤坏死因子受体家族成员。LMP1 分子聚集在细胞膜上，通过 2 个 C 一末端活化区域与肿瘤坏死因子受体相关因子及肿瘤坏死因子受体相关死亡结果区域蛋白(TRADD)相互作用。LMP1 在 NPC 中主要作用：(1)诱导 A20 的表达。从而抑制鼻咽癌细胞分化。(2)一般情况下。P53 发生自身突变而丧失诱导细胞凋亡的功能。在鼻咽癌中发现，LMP1 通过上调 A20 来阻断 P53 导致的细胞凋亡，LMP1 亦可激活 TRAF 通路直接阻断肿瘤坏死因子 TNFa 介导的细胞凋亡。最近发现 LMP1 可以通过 Survivin 信号传导途径发挥抗凋
15、亡作用，从而促进细胞增殖，诱发上皮细胞转化“。(3)LMPl 可通过 NFKB 使 EGFR 高表达，使上皮生长失调，诱发上皮细胞转化。(4)LMP1 还能影响细胞信号通路，使 EBV 感染细胞逃避宿主的免疫监视。研究表明 LMP1能快速激活转录因子 NFKB并能激活 RasMAPK 激酶通道和 JNKAP l 通道，使人胚胎细胞HEK293 无限制生长 21】 。学者还发现 c22LanIII 型的细胞中LMP1 的表达能诱导 sTAT 一 1STAT 一2、STAT 一 3 的表达，其中 SI、Arr_l 与 EBV 的转化有关SrATs 蛋白在某些特定肿瘤的产生和维持中发挥关键作用。(5
16、)LMP1 可下调 E 钙粘素和 8 一链接素的表达，增强癌细胞的侵袭性。(6)LMP1 能促进鼻咽癌的淋巴结转移。Horikawa 发现 LMP1 能诱导 CMet 原癌基因表达，后者能促进鼻咽癌的淋巴结转移。另有资料表明，LMP2A 能通过 P13KAKt 途径介导细胞的抗凋亡。还呵以通过上调整合素a6(ITGalpha6)而促进鼻咽癌转移。在体外，上皮细胞 LMP1 表达能诱导或上调细胞问连接分子 l(1CAM1)、CD 及细胞因子如白介素 6(IL 一 6)和白介素 8(IL 一 8)的表达。而且 LMP1 可诱导上皮细胞表达肿瘤坏死因子家族成员 CD 抗原，虽然鼻咽癌 CD 表达与
17、LMPl 蛋白检测没有明显相关性，但这一观察是有意义的，因为大多数非角化鼻咽癌为 CD 阳性而且 LMP1 通过 C 一末端活化区域 1 和 2(CTAR 一 1、CTAR 一 2)，能使基质金属蛋白 MMP 一 9 的作用被过度表达的 IB 所封闭，这一作用如果在体内实现的话将促使鼻咽癌的浸润生长。9 一个关于 EB、 ，_LMP1 的有趣问题I,MP1 阳性的鼻咽癌似乎比 LMP1 阴性鼻咽癌病例病程晚，LMP1 表达似乎标志预后较差，然而将 LMP1转染到 EB 病毒阴性的胃癌细胞，结果导致牛 K 率下降，有效减少肿瘤细胞集落形成，肿瘤细胞恶性度下降及对凋亡的敏感性增加。LMP1 在胃癌
18、中表达阳性似乎可作为预后良好的标志。总之 LMP1 在鼻咽癌发生发展中的作用有待进一步确定。1O 鼻咽拭子检测 EBVLMPl 与鼻咽癌诊断和预后的关系台湾学者 Hao 等对 320 个成年人进行咽拭子检测 EBVLMP1 与纤维鼻咽镜的检查对照。发现用咽拭子检测 EBVLMP1 诊断鼻咽癌的敏感性 87_3，特异性 984，阳性预测值 923，阴性预测值973；而鼻咽镜的敏感性为 62，特异性 996阳性预测值 98，阴性预测值 889。台湾地区正常人群中鼻咽癌的检出率 02以下，此方法可以作为高危人群进行鼻咽癌筛查的一个有效手段。Eang 等对 7l 位鼻咽癌患者进行放疗前后的 EBVLM
19、P1 表达作一系列检测，放疗后中位消退时间为 43周，4，3 周的归为早期消退者，反之为延迟消退，两者的 3 年无病生存率分别为 935和765在至少 6 个月的随访中有 l0 例又重新检测出 EBVLMP1，9 例再阳性的和 2 例持续阳性的患者最终发展为局部复发，说明这是一个有效预测鼻咽癌黏膜复发的监测方法。并且在鼻嘲拭子中联合检测EBVI,MP1 和 EBNA 诊断鼻咽癌的敏感性(914)、特异性(983)均很高 ，可以在流行地区作为一个对鼻咽癌病理诊断的有效辅助检查手段。Tsang 等还发现 EBVDNA 在其他的上呼吸消化道的鳞癌中都不表达仅在鼻咽癌中高表达，而正常对照人群中则有 2的人阳性。Lin 等进一步证实，用鼻咽拭子方法对 127 个局限性鼻咽癌患者在放疗过程中的 EBVLMP1 检测，发现EBVLMP1 的消退时间是影响局控率的重要因素(单凶素 P40d， KaplanMeier 分析提示延迟消退的患者比早期消退患者的预要差 P=O0129提示 EBVLMPI 是鼻咽癌患者局控率一个独立的重要的预测因素。总之,大量资料娩示 EB 病毒 DNA 及其基因片段的检测对于鼻咽癌患者的分期、诊断、判断疗效和监测复发及转移都具有重要的临床意义，用荧光 PCR 方法检测外周血及鼻咽黏膜的 EBVDNA 准确、无创、便捷。是鼻咽癌患者诊断和个体化治疗的一个良好的肿瘤标记物。
